微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。
Summary
細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。
Abstract
DNA 複製と分離、タンパク質合成、細胞壁の生合成と細胞分裂などのコア細胞プロセスは、細菌の生存に不可欠なタンパク質の機能に依存します。ターゲット固有の染料のシリーズよりプローブがこれらのプロセスを理解するように使用できます。膜構造の観察、脂質マイクロ ドメインの可視化および膜鉱物の検出を有効脂溶性染料で染色します。蛍光 d-アミノ酸酸ペプチドグリカン生合成のサイトを調査する (FDAAs) の使用は、細胞壁や細胞成長パターンの作成の潜在的な欠陥を示すことができます。最後に、核酸の汚れは、DNA の複製または染色体の分離の可能な欠陥を指定できます。シアニン DNA は、細胞ラベルの汚れ、微速度顕微鏡観察細胞増殖時核様体の形態のリアルタイム観測を有効にするために適しています。セルの分類のためのプロトコルは、膜構造、細胞壁の生合成、または染色体の欠陥を識別するために蛋白質の枯渇変異に適用できます。さらに、微速度顕微鏡観察は重要な蛋白質が削除され、タンパク質の機能に追加の洞察力を提供することができる形態学的変化の監視に使用できます。たとえば、重要な細胞分裂蛋白質の枯渇結果を細線または分岐、細胞成長タンパク質の枯渇が短いまたは円形になる細胞を引き起こす可能性があります一方。ここでは、細胞の成長、ターゲット固有のラベリングおよび微速度顕微鏡観察のためのプロトコルは、細菌植物病原菌アグロバクテリウムを提供しています。一緒に、ターゲット固有の染料と微速度顕微鏡観察に不可欠なプロセスの特性を有効にA. 根頭がんしゅ病菌。最後に、他の細菌に不可欠なプロセスを調査する提供するプロトコルを容易に変更できます。
Introduction
細菌の細胞周期の進行には、膜と細胞壁の生合成、DNA 複製と分離、細胞分裂など多くのプロセスの調整が必要です。細菌の細胞生物学の複雑さを完全に理解するには、これらの重要なイベントを研究する必要があります。しかし、これはこれらの経路の主要なコンポーネントは、突然変異誘発時にセル実行可能性が侵害されたので以外の些細なタスクであります。ターゲット固有の染料と相まって落射蛍光顕微鏡は、野生型と変異細菌株のこれらの重要なプロセスを調査する強力なアプローチです。
ペプチドグリカン固有染料など蛍光抗生物質 (バンコマイシン フロリダ州、bocillin FL) 蛍光 d アミノの酸 (たとえば、7-hydroxycoumarin-3-カルボン酸-3-アミノ-d-アラニン、波田; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-アラニン、灘。tetramethylrhodamine-3-アミノ-d-アラニン;多田)。グラム陽性菌のペプチドグリカン生合成のサイトを調査する抗生物質類縁体蛍光の致死濃度の使用はペプチドグリカン挿入パターン1,2を明らかにするための効果的な戦略をされています。 3,4。外膜は一般的に蛍光を使用できないように関門を提供します蛍光バンコマイシンのラベリングは、固定のグラム陰性細菌5の挿入パターン、ペプチドグリカンに洞察力を得るために使用されています、一方生細胞におけるペプチドグリカン生合成用プローブとしての抗生物質。対照的に、蛍光 d アミノの酸または双直交官能と d-アミノ酸の短いパルスは共有生活細菌細胞6、7の広い範囲で最近のペプチドグリカンの挿入の領域をラベルします。合成 d-アミノ酸と観察されているペプチドグリカン挿入のパターンは、点状、中隔 (大腸菌と枯草) 極と中隔 (アグロバクテリウムとリステリア菌)、中隔のみ (黄色ブドウ球菌)、および根尖 (放線菌 venezuelae)6,7。これらの観察は、細菌が細胞壁の生合成の多様なパターンを示すことと成長パターンを検査するためのプローブとして合成 d-アミノ酸の利用は多くの細菌で貴重な戦略を示します。
細菌の染色体にラベルを付ける染料は、デオキシリボ核酸 (DNA) 特定のマイナーな溝バインダー (4, 6-diamidino-2-phenylindole;DAPI) と親和性の高いシアニン色素 (緑とオレンジ; 材料のリストを参照してください)。生きているセルの DAPI 染色、細菌生存率9を示すために使用されます環境試料8から細菌の列挙に役立ちます DAPI 染色固定セルの。対照的に、シアニン色素膜非透過性の「死んだ」細胞の非実行可能なセル9を列挙する汚れとオレンジと緑が頻繁に記述されているようです。驚くことに、これらの試薬はセル成長の間に細菌の核様体の形態を調査する際、DAPI、オレンジと緑すべてあることを示した膜側の透過物、生きているセル10のラベル付けが可能。住んでいる大腸菌の細胞、細胞質から自動蛍光によるびまん性表示され DAPI は DNA の染色、紫外線 (UV) の DAPI 染色性細胞の反復暴露は核構造10を摂動します。染色の大腸菌や枯草オレンジと明らかにこの色素が膜側の透過物です、染色体分配10 や DNA の複製、細胞の増殖に影響を与えることがなく生きている細胞内の DNA に結合する長期的な蛍光を提供します.これらの観察は、DNA のシアニン色素を多くの細菌の細胞の成長中に核様体の形態を監視する使用ことができることをお勧めします。
Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) フェニルなど染料) hexatrienyl) ピリジニウム臭化 (4-64; 材料リストを参照) は陽イオン性化合物、負荷電に優先的に関連付けるリン脂質カルジオリピンおよびホスファチジルグリセロール11など。4 64 を使用して別の細菌の膜をラベルするときは、明確なパターンが観察されます。大腸菌4-64 極、外側壁に沿ってバンドの濃縮し、後半の pre-divisional の部門サイト細胞12。枯草菌、4-64 の分類、脂質スパイラル13の可視化が可能です。アグロバクテリウムで 4 64 外膜をラベルし、成長ポールが14,15をラベリングを欠いている、特徴的な「馬蹄形」パターンで観察する.これらの観察は、これらの細菌が細胞の非対称性に寄与する脂質ドメインの存在による異種の脂質分布を示すことを示します。びまん性ラベリングの存在など 4 64 ラベリング パターンの変化、鉱物または小胞、陥入、または膜収縮が有益であろう分布または脂質の生合成に影響を与える突然変異体を特徴付けること。
細胞を染色、を超えて、不可欠なプロセスに参加しているタンパク質の機能を決定することは必要です。削除必須遺伝子と表現型の結果を研究することが可能ではないために、重要なタンパク質の解析は技術的に挑戦的です。したがって、タンパク質を破壊する方法が浮上しています。たとえば、そのネイティブのプロモーターではなく誘導性プロモーターの制御下に必須な遺伝子を置くことができます。誘導性プロモーターなどの小さな分子に敏感であります。16イソプロピル β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, アラビノース22、バニリン酸17,23, 亜鉛します。キシロース23、従ってターゲット遺伝子のトランスクリプションを停止するためにおよび興味の蛋白質がなくなると、誘導が削除されたとき。興味の本質的な蛋白質を破壊のための代替アプローチは、CRISPR 干渉25,26 標的遺伝子の転写を阻害する低分子と RNA の相互作用を用いる合成 riboswitches24を含んでいます。ブロックの転写標的遺伝子と化学肥料プロテアーゼによる分解の標的タンパク質をペプチド タグを使用する誘導タンパク分解27,28に。したがって、タンパク質枯渇中に時間の経過とともに細胞の顕微鏡像は、特性評価のための強力なアプローチ、枯渇系統は、細胞生存率を失う前に特性の短時間だけを提供します。確かに、生きている細菌の細胞の顕微鏡観察は、区画29分泌、細胞形状維持のメカニズムを含む基本的な生物学的プロセスへの洞察を得るために研究者を可能にしました。
A. 根頭がんしゅ病菌細菌植物病原体30は、自然遺伝エンジニア31,32。したがって、機構、病原性に関連する宿主-病原体相互作用33,34,35など分泌36、ホスト変換30,31, 37広く検討されています。A. 根頭がんしゅ病菌による病気を防ぐため、植物形質転換を高める戦略を設計するには、 A. 根頭がんしゅ病菌の生存に不可欠なプロセスをよりよく理解する必要があります。ターゲット固有の染料を使用し、最近A. 根頭がんしゅ病菌18タンパク質枯渇戦略の不可欠なプロセスを調査するための手段を提供します。
ここでは、 A. 根頭がんしゅ病菌の野生型、変異体、および蛋白質の枯渇系統の顕微解析のための詳しいプロトコルが提供されます。最初の 2 つのプロトコルはセルを準備し、ターゲット固有の染料でそれらにラベルを付ける方法を説明します。第 3 のプロトコルでは、細菌の細胞 (図 2, , 図 3図 4) をイメージングとアガロース パッド (図 1) を準備するためのステップバイ ステップの指示を提供します。これらのプロトコルは、別のメディア条件、成長率、酸素の要件、および細胞構造を考慮して追加適応を持つ他の細菌に適した可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルには、一連a. 根頭がんしゅ病菌野生型、変異体、および枯渇系統の調査のためのプロシージャにはが含まれています。それはすべてのプロトコル セクションに記載されている手順が成長媒体、温度、および成長率を考慮して追加の変更とその他の細菌の緊張のために容易に適応することができますは注目に値するです。
ターゲット固有の染料の使?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図 2と図 4で FDAAs の贈り物ありがとうマイケル ・ VanNieuwenhze (インディアナ大学)。この原稿の準備の間のフィードバックのためのブラウンの実験室のメンバーに感謝いたします。A. 根頭がんしゅ病菌の細胞増殖と分裂にブラウンの実験室の研究は、国立科学財団 (IOS1557806) によってサポートされます。
Materials
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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