Live celle fluorescens mikroskopi å observere viktige prosesser under mikrobiell cellevekst

Summary

Forstå funksjonen av viktige prosesser i bakterier er utfordrende. Fluorescens mikroskopi med mål-spesifikke fargestoffer kan gi viktig innsikt i mikrobiell celle vekst og celle syklus progresjon. Her brukes Agrobacterium tumefaciens som en modell bakterie for å markere metoder for levende celle bildebehandling for kategorisering av viktige prosesser.

Abstract

Kjernen cellulære prosesser som utryddelse og segregering, proteinsyntese, cellevegg biosyntesen og celledeling stole på funksjon av proteiner som er essensielle for bakteriell overlevelse. En rekke mål-spesifikke fargestoffer kan brukes som sonder bedre forstår disse prosessene. Flekker med lipofile fargestoffer kan observasjon av membran struktur, visualisering av lipid microdomains og oppdagelsen av membran blebs. Bruk av fluorescerende-d-aminosyrer (FDAAs) å undersøke stedene i Peptidoglykan biosyntesen kan angi defekter i cellen vegg biogenesis eller celle vekst mønster. Endelig kan nukleinsyre flekker indikere mulige feil i DNA replikering eller kromosom raseskille. Cyanine DNA flekker etiketten levende celler og er egnet for time-lapse mikroskopi aktivering av real-time observasjoner av nucleoid morfologi under cellevekst. Protokoller for cellen merking kan brukes på protein uttømming mutanter å identifisere feil i membranen struktur, cellevegg biogenesis eller kromosom raseskille. Videre kan time-lapse mikroskopi brukes til å overvåke morfologiske endringer som en viktig protein er fjernet og kan gi ytterligere innsikt i protein-funksjonen. For eksempel fører uttømming av viktige celledeling proteiner til filamentation eller forgrening, mens uttømming av celle vekst proteiner kan føre til at celler blir kortere eller rundere. Her tilbys protokoller for cellevekst, mål-spesifikke merking og time-lapse mikroskopi for bakteriell anlegget patogen Agrobacterium tumefaciens. Sammen, mål-spesifikke fargestoffer og time-lapse mikroskopi aktiverer karakteristikk av viktige prosesser i A. tumefaciens. Til slutt, protokollene gitt kan lett endres for å undersøke viktige prosesser i andre bakterier.

Introduction

Fremdrift gjennom bakteriell cellen syklus krever koordinering av mange prosesser inkludert membran og cellevegg biosyntesen, utryddelse og segregering og celledeling. Å fullt ut forstå kompleksiteten av bakteriell cellebiologi, er det nødvendig å studere disse viktige hendelser; men er dette en ikke-triviell oppgave siden cellen levedyktighet er svekket når nøkkelkomponenter av disse er mutagenized. Epifluorescence mikroskopi kombinert med mål-spesifikke fargestoffer er en kraftig tilnærming å undersøke disse viktige prosesser i wildtype og mutant bakteriell stammer.

Peptidoglykan-spesifikke fargestoffer inkluderer fluorescerende antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) og fluorescerende-d-aminosyrer (for eksempel 7-hydroxycoumarin-3-karbonoxylsyre syre-3-amino-d-alanin, HADA, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). I Gram-positive bakteriene, har bruk av sublethal konsentrasjoner av fluorescerende antibiotika analogs å undersøke områder av Peptidoglykan biosyntesen vært en effektiv strategi å avsløre Peptidoglykan innsetting mønstre^{1,2, 3,4}. Mens fluorescerende vancomycin merking er brukt til å få innsikt i Peptidoglykan innsetting mønstre i fast Gram-negative bakterier⁵, gir den ytre membranen generelt en permeabilitet barriere som forhindrer bruk av lysrør antibiotika som en sonde for Peptidoglykan biosyntesen i levende celler. Derimot merke korte pulser fluorescerende-d-aminosyrer eller d-aminosyrer med biorthogonal funksjonelle grupper covalently regioner i siste Peptidoglykan innsetting i et bredt spekter av levende bakterieceller^6,7. Mønstre av Peptidoglykan innsetting som har blitt observert med syntetisk d-aminosyrer inkluderer vises punctate og septal (Escherichia coli og Bacillus subtilis), polar og septal (Agrobacterium tumefaciens og Listeria monocytogenes), septal eneste (Staphylococcus aureus) og apikale (Streptomyces venezuelae)^6,7. Disse observasjonene indikerer at bakterier ha mangfoldig mønstre av cellen vegg biogenesis og at bruken av syntetiske d-aminosyrer som sonder for å undersøke vekst mønster er en verdifull strategi i mange bakterier.

Fargestoffer som etiketten bakteriell kromosomene inkluderer deoksyribonukleinsyre (DNA) bestemt mindre groove dokumentordneren (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) og høy affinitet cyanine fargestoffer (grønn og oransje; se materialer liste). DAPI farging av fast celler hjelper opplisting av bakterier fra miljøprøver⁸, mens DAPI farging av levende celler brukes til å angi bakteriell levedyktighet⁹. Derimot fargestoffer cyanine som oransje og grønn er ofte beskrevet som membran impermeant “død” celle flekker liste opp ikke-levedyktige celler⁹. Bemerkelsesverdig, når skal disse reagensene brukes å undersøke morfologi av bakteriell nucleoid under cellevekst, DAPI, oransje og grønn var alle vist seg membran permeant og i stand til merking lever celler¹⁰. Lever E. coli celler, DAPI farging av DNA vises diffus på grunn av auto-fluorescens cytoplasma og gjentatte eksponeringer av DAPI-farget celler til ultrafiolett (UV) lys perturbs nucleoid struktur¹⁰. Farging E. coli eller B. subtilis med oransje avslører at dette fargestoffet membran permeant og gir langvarig fluorescens ved binding til DNA i lever celler uten at cellevekst, utryddelse eller kromosom raseskille¹⁰ . Disse observasjonene foreslår at cyanine DNA fargestoffer kan brukes til å overvåke morfologi av nucleoids under cellevekst i mange bakterier.

Phospholipid-Specific stryl fargestoffer som N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64, se materialer liste) er kationisk forbindelser og knytte fortrinnsvis negativt ladet fosfolipider som cardiolipin og phosphatidylglycerol¹¹. Ulike mønstre er observert når 4-64 brukes til å merke membran av forskjellige bakterier. Escherichia coli, 4-64 er beriket i polene, i band langs den laterale veggen, og i divisjon områder av pre-divisional celler¹². I Bacillus subtiliskan 4-64 merking visualisering av lipid spiraler¹³. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter den ytre membranen og er observert i et karakteristisk “hestesko” mønster der vekst pole er blottet for merking^14,15. Disse observasjonene indikerer at disse bakteriene ha heterogene lipid distribusjoner på grunn av tilstedeværelsen av lipid domener som bidrar til mobilnettet asymmetri. Endringer i 4-64 merking mønstre som tilstedeværelse av diffus merking, blebs eller blemmer, invaginations eller membran krymping kan være informativ karakteriserer mutanter som påvirker distribusjon eller biosyntesen av lipider.

Utover flekker celler, er bestemme funksjonen av protein delta i viktige prosesser nødvendig. Karakterisering av essensielle proteiner er teknisk utfordrende fordi det ikke er mulig å slette viktige gener og studere fenotypiske konsekvensene. Dermed har alternative tilnærminger som tømmer protein dukket opp. For eksempel kan en viktig genet settes under kontroll av en induserbart arrangøren i stedet for sitt opprinnelige promoter. Induserbart arrangører er mottakelig for små molekyler som; sink¹⁶, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinose²², vanillate^17,23, xylose²³, dermed transkripsjon av målet genet opphører og protein av interesse er oppbrukt når induser fjernes. Alternative tilnærminger for å tappe essensielle proteiner av interesse inkluderer syntetisk riboswitches²⁴ som bruker små molekyl-RNA interaksjoner for å hindre transkripsjon av målet gener, CRISPR forstyrrelser^25,26 til blokk transkripsjon av målet gener og induserbart protein fornedrelse^27,28 som bruker peptid tags målet proteiner til fornedrelse som ClpXP protease. Uttømming stammer gir bare en kort tid for karakterisering før cellene mister levedyktighet, derfor mikroskopiske imaging celler over tid under protein uttømming er en kraftig metode for karakterisering. Faktisk har mikroskopi levende bakterielle celler aktivert forskere å få innsikt i grunnleggende biologiske prosesser, herunder mekanismer for cellen figur vedlikehold og sekresjon compartmentalization²⁹.

A. tumefaciens er en bakteriell anlegget patogen³⁰ og naturlige genetiske ingeniør^31,32. Dermed mekanismer knyttet til virusets, inkludert vert-patogen interaksjoner^33,34,35, sekresjon³⁶og vert transformasjon^{30,31, 37} har blitt grundig undersøkt. Utforme strategier som forhindre A. tumefaciens mediert sykdom eller forbedre anlegget transformasjon, må prosessene avgjørende for A. tumefaciens overlevelse bli bedre forstått. Bruk av mål-spesifikke fargestoffer og den siste utviklingen av en protein uttømming strategi for A. tumefaciens¹⁸ gir et middel til å undersøke viktige prosesser.

Her tilbys detaljert protokoller for microscopic analyse av wildtype, mutant og protein uttømming stammer av A. tumefaciens . De første to protokollene beskriver hvordan å forberede celler og merke dem med mål-spesifikke fargestoffer. Tredje protokollen gir trinnvise instruksjoner om forbereder agarose pads (figur 1) og tenkelig bakterieceller (figur 2, Figur 3, Figur 4). Disse protokollene kan også være egnet for andre bakterier med ytterligere tilpasninger å ta hensyn til ulike medier forhold, vekst, oksygen krav og celle strukturer.

Protocol

1. vekst av A. tumefaciens stammer Dyrking A. tumefaciens stammer Bruk en steril tre pinne eller Pipetter tips for å vaksinere 1 mL av ATGN vekst medier (se materialer liste for oppskriften) med en enkelt koloni av ønsket belastningen.Merk: For A. tumefaciens uttømming stammer, ATGN bør inneholde 1 mM IPTG som en induser å opprettholde biosyntesen av viktige protein. Vokse A. tumefaciens stammene overnatter i ATGN på 28 ° C me…

Representative Results

Mål-spesifikke merking av wildtype A. tumefaciens cellerFor å illustrere at celle morfologi er ikke påvirket av vask trinn eller behandling med 1% DMSO (som brukes til å fortynne de fluorescerende fargestoffer), celler ble fotografert direkte fra kultur (figur 2A, venstre panel), etter vask cellene av sentrifugering som beskrevet i 1.2 (figur 2A, venstre) eller …

Discussion

Denne protokollen inneholder en rekke prosedyrer for etterforskningen av A. tumefaciens wildtype mutant og uttømming stammer. Det er verdt å merke seg at alle prosedyrene i delen protokollen kan lett tilpasset andre bakterielle stammer med ytterligere modifiseringer å ta hensyn til vekst medier, temperaturer og vekst.

Bruk av mål-spesifikke fargestoffer er et verdifullt verktøy for å gi en detaljert karakterisering av cellen syklus hendelser i bakterielle celler. Her Peptidoglyk…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.