Summary
Этот протокол описывает использование искусственного аорто-Гонада-мезонефрос для выражения анализа, образуя колонии единиц в культуре и селезенке и долгосрочное восстановление для определения влияния нормативных факторов и сигнальных путей на гемопоэтических стволовых развития клеток. Это было продемонстрировано как эффективной системы для изучения биологии гемопоэтических стволовых клеток и функции.
Abstract
Ограничение использования эмбрионов мыши для кроветворения исследования является добавлен неудобства в операции, которая в значительной степени обусловлено внутриутробное развитие эмбриона. Хотя генетических данных от мышей нокаут (KO) являются убедительными, это не реалистично для создания KO мышей для всех генов при необходимости. Кроме того выполнение в естественных условиях спасения экспериментов, чтобы консолидировать данные, полученные от KO мышей не удобно. Чтобы преодолеть эти ограничения, культура экспланта аорто-Гонада-мезонефрос (AGM) был разработан как надлежащей системы для изучения развития гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Особенно для спасения экспериментов он может использоваться для восстановления нарушение кроветворения в KO мышей. Путем добавления соответствующих химических веществ в среду, нарушением сигнализации может быть реактивирован или вверх регулируется пути можно тормозится. С использованием этого метода многие эксперименты могут быть выполнены для выявления критических регуляторы HSC развития, включая HSC связанных экспрессии генов в мРНК и белка уровнях, способность формирования колонии и воссоздания потенциала. Эта серия экспериментов было бы полезным в определении основных механизмов, необходимых для развития HSC в млекопитающих.
Introduction
Гемопоэтические стволовые клетки (СКК), специфичные для ткани взрослых стволовых клеток, которые обладают мультилинейного потенциалом, включая эритроидные, миелоидной и лимфоидных клеток, а также возможность самостоятельного обновления. Недавние исследования показали, что ранние СКК возникает от специализированный эндотелиальной населения, известный как эндотелий кроветворения (он), через эндотелиальные гемопоэтических перехода (EHT) на брюшной стенке грудной аорты1,2 ,3,4. После того, как сформировалась в аорто Гонада мезонефрос региона (AGM) от эмбриональных (E) 10,5-E12.5 в эмбриона мыши, СКК будет перенести в фетальной печени для расширения и наконец колонизировать костного мозга для поддержания кроветворения взрослых на протяжении всей жизни индивидуума 5 , 6. Хотя это был изучен на протяжении многих лет, основных механизмов HSC эмерджентности и развития по-прежнему неполно понял.
В отличие от в экстракорпорального оплодотворения и развитие зародышей данио рерио внутриутробное развитие зародышей мыши делает исследование окончательного кроветворения во время эмбриогенеза гораздо более неудобным. Хотя обычно используются генетические эксперименты с использованием маскирования (KO) мышах, отсутствие определенных KO мышей также ограничивает их использование в области гемопоэтических исследований. Кроме того в естественных условиях спасения эксперименты не выполняются легко KO мышей. Начиная с 1996 года AGM экспланта культуры был разработан для гемопоэтических исследования пионеров в области7. С помощью этой системы культуры было выявлено брюшной ткани AGM региона содействовать деятельности HSC, в то время как спинной тканей приложить противоположный эффект8,9. AGM экспланта культуры системы также был применен для определения роли серотонина, Mpl, SCF, BMP и еж сигнализации в HSC развития10,11,12,13, 14. Важно отметить, что это также популярным методом, используемым для спасения гемопоэтических дефекты в мутанта эмбрионов13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все процедуры, включая животных темы были утверждены Комитетом по рассмотрению этических в Институте зоологии Академии наук Китая, Пекин, Китай.
1. Подготовка материала
- Стерилизируй-отпусти 0,65 мкм фильтры с ультрафиолетовые лучи, выпускаемых под ультрафиолетовой луч лампы на чистой скамейке для 4 h и переверните фильтры после отметки 2 ч.
Примечание: При работе с ультрафиолетовым светом, носить соответствующую защиту. - Стерилизации сетки из нержавеющей стали с стерилизатор-автоклав при 121 ° C за 30 минут.
Примечание: Для поддержки фильтры в интерфейсе жидкость воздуха необходима определенной высоты сетки из нержавеющей стали и это может быть реализовано с проволокой на стальной сетки ( рис. 1 A). - Флуоксетин разбавляют до окончательного концентрации 10 мкм в долгосрочный M5300 культуры среднего и смесь равномерно.
Примечание: Для шести ну плиты, 2 мл M5300 долгосрочный питательной среды подходит для каждой скважины. Гидрокортизон на 10 -6 M могут быть выборочно ослаблены в среду. - Передачи среднего, дополненные флуоксетин на 10 мкм в шесть ну пластин или блюда и поставить стерилизовать нержавеющей сетки в среду.
- Мыть 0,65 мкм фильтры с кипящей водой два раза в течение 3 минут каждый раз в стеклянную посуду культуры клеток для стерилизации. После каждой стирки, вставьте фильтры фосфат буфер солевой (PBS) для 2 минут и влажные фильтры на нержавеющей стали место сетки стоя на интерфейсе жидкость воздуха как показано на рисунке 1 A [схема в центре].
Примечание: Кипящая вода может быть создан с стерилизатор-автоклав для достижения асептики и оборудование должны приниматься из стерилизатор-автоклав своевременно во избежание снижение температуры.
2. AGM культуры Explant
- тщательно отдельные регионы AGM от эмбрионов в E10.5 или E11 пинцетом.
- Стрип девушки от беременных мышей с рассечения ножницы и эмбрионы от девушки.
- Протрите желточного мешка, пуповины и внутренние органы из тела эмбриона.
- Тщательно удалять спинной нервных тканей и окружающих мышечных тканей.
- Cut off тканей с щипцы на сайте передних и задних конечностей и отдельные AGM региона от тела эмбриона. 1 цифры B-C Показать схематическое представление и морфология расчлененных AGM.
- Explant расчлененных АГМС отдельно на фильтры в жидкость воздуха интерфейс ( рис. 1 А) и культуры в 5% CO 2 при 37 ° C на 2-3 дня.
Примечание: Не место расчлененных AGM на провод стальной сетки и убедитесь, что фильтры находятся на уровне интерфейса воздуха жидкость во время культуры. Помимо AGM, желточного мешка и фетальной печени может также быть культивировали с этой системы 7.
3. Анализ выражения
- уровень мРНК
- собирать культивировали АГМС в 1 мл PBS и центрифуги на 4 ° C, 310г x 6 мин
- После удаления супернатанта, Общая РНК добывается из собранных АГМС монофазные раствором фенола, по словам производителя ' s инструкции.
- Всего РНК (2 мкг) затем обратной транскрипции с помощью M-MLV обратной транскриптазы для получения cDNA как шаблон. Количественных анализов в реальном времени PCR выполняются с зеленым SYBR и Gapdh используется в качестве внутреннего контроля.
- Уровень протеина
- собирать культивировали AGM, как описано выше в шаге 3.1.1.
- Подготовить белка из искусственного AGM с буфер lysis клетки (10 мм трис-HCl, 10 мм NaCl и 0,5% NP-40) содержащий ингибитор протеазы и использования для западный blotting для определения уровня белка как ранее описанных 13.
4. Колония-формирование подразделений в Assay культуры (CFU-C)
- после культивирования на 2-3 дня, собирать AGM регионов в 1 мл фосфатный буфер (PBS) и центрифуги на 4 ° C, 310г x 6 минут и разъединять с 200 мкл коллагеназы (0,1% в PBS) 37 ° C.
Примечание: Время, необходимое для коллагеназы для создания единого клеточных суспензий-около 20 минут. Покачивая трубка, содержащая AGM каждые 5 минут может ускорить процесс пищеварения. 200 мкл 0,1% коллагеназы используется для каждого годового общего собрания акционеров и 200 мкл 10% сыворотки используется для остановки реакции. - Культура единого клеточных суспензий в M3434 среде в ультра-низким крепежные пластины 24-а.
Примечание: Чтобы избежать загрязнения, пенициллина и стрептомицина решение могут быть выборочно добавлены в среде. Потому что средний M3434 вязкой, 1.0 cc шприц без иглы используется сочетание клетки и среднего. - После 7 - 10 дней культивирования при 37 ° C в 5% CO 2, номер для каждого типа колоний, включая взрыв, формирование подразделения--эритроидные (BFU-E), кое функционирование Моноцит (CFU-GM) и кое гранулоцитов, эритроцитов, макрофагов, мегакариоцитов (CFU-ГЭММ) Это уважаемый основанный на словотолковании и забил с инвертированным микроскопом ( рис. 2 C).
5. В естественных условиях Трансплантация Assay
- колонии формирование пробирного единиц селезенка (CFU-S)
- после 2 - 3 суток культивирования эксплантов, АГМС собрать и подготовить единый клеточных суспензий при инкубации с 200 мкл коллагеназы (0,1% в PBS) для 20 мин
- Выполнять смертоносных облучения (9 гр рентгеновских лучей) 8 - до 10 - неделю старых самцов мышей C57BL/6 4-5 ч до инъекции клеток.
- Вставьте фиксатор ограничить свою деятельность облученного мышь.
- Протрите хвост, используя ватный тампон, погруженный в 75% алкоголя содействовать расширение сосудов вен.
- Придать 0.5 эмбриона эквивалент (ee) или одной ячейки 1 ee-суспензий AGM внутривенно в Вену хвост облученного мыши с 1.0 cc шприца.
Примечание: Клетки приостановлены с PBS и 0,5 мл PBS на получателя является подходящей. Иглы 25 датчика или размера 26 датчика используется для инъекций с 1.0 cc шприца. Воздух не могут быть введены в шприц. Нажмите место инъекции антисептиком тампоном, чтобы остановить кровотечение. - Одиннадцать дней пост пересадки, сбора и исправить селезенки мышей получателя в Bouin ' s решение (1,22% пикриновой кислоты насыщенный водный раствор 15 мл, 2 мл 40% метанола и 1 мл уксусной кислоты) для 1-2 дня и мыть с 80% алкоголя еще 1-2 дней. Макроскопически граф видимые колонии в селезенке и определить количество колоний за ee.
Примечание: Буэна ' s фиксатором, соответствующую защиту от износа.
- Долгосрочный пробирного трансплантации
- после 2-3 дня explant культивирования, АГМС собрать и подготовить единый клеточных суспензий при инкубации с 200 мкл коллагеназы (0,1% в PBS) 20 мин
- Выполнять смертоносных облучения (9 гр рентгеновских) 8 - до 10 - неделю старых самцов мышей C57BL/6 4-5 часов до инъекции клеток.
- Вставьте фиксатор ограничить свою деятельность облученного мышь.
- Протрите хвост, используя ватный тампон, погруженный в 75% алкоголя содействовать расширение сосудов вен. < lя > Inject 0.5 эмбриона эквивалент (ee) или 1 ee отдельные ячейки суспензии AGM внутривенно в Вену хвост облученного мыши с 1.0 cc шприца. AGM вводят в дозе 1 ee каждого получателя с 2 × 10 5 клеток костного мозга (фон CD45.1).
Примечание: Воздух не могут быть введены в шприц. Нажмите место инъекции антисептиком тампоном, чтобы остановить кровотечение. - Четыре месяца после пересадки, собирать костного получателя и использовать его для растворения assay, СУИМ. Только получатели с ≥ 10% доноров производные химеризма считаются выставлять успешного растворения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Недавние публикации сообщили, что эндотелиальных клеток серотонин способствует выживанию СКК, подавляя про apoptotic путь в AGM13. Для подтверждения поощрения эффект серотонина на развитие HSC, флуоксетин был включен. Как ингибитор ре поглощение серотонина (SSRI) флуоксетин была продемонстрирована возможность препятствовать повторное поглощение серотонина в периферических тканях16,17,18. С помощью AGM explant культуры системы, влияние на развитие HSC флуоксетин был рассмотрен, следуя процедуре, представленной выше. Выражение анализ показал увеличение выражение Runx1, которое определяется как ключевой ген, отвечающий за HSC развития19, флуоксетин лечение АГМС мРНК и белка уровнях, соответственно (Рисунок 2A и 2B). Флуоксетин может также значительно увеличить способность формирования колонии СКК в общем собрании акционеров, включая BFU-E, кое-GM и кое-ГЭММ (Рисунок 2C иD на рисунке 2). Кроме того в естественных условиях трансплантация результаты показали, что СКК в AGM, лечение флуоксетином может увеличить количество колоний селезенки в облученных взрослых получателей (Рисунок 2E).
Рисунок 1 . Схематическое изображение структуры годового общего собрания акционеров и экспланта культуры системы.
(A) схема для использования systemto культуры экспланта AGM изучить воздействие химических веществ на развитие СКК. Кратко АГМС расчлененный из эмбрионов и культивировали на фильтры в интерфейсе воздуха жидкость с химикатами, разводят в M5300 долгосрочный питательной среды. 2 - 3 дня спустя, культивированный АГМС собираются и используются для изучения выражение гемопоэтических связанных генов, колонии формирования способности и способности заселения. AGM, аорто Гонада мезонефрос; КОЕ-C, образуя колонии единиц в культуре; КОЕ-S, образуя колонии единиц селезенка. (B) на этой диаграмме показана структура акционеров. , Спинной аорты; Меня, Мезенхима; G, Гонада; М, мезонефрос. (C) морфология AGM. AGM отделена от хвостового половины эмбриональных тела с окружающих мезенхимальных клеток в E10.5. Масштаб баров = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Применение AGM explant культуры системы для выявления эффекта флуоксетин на развитие HSC. (A) уровень мРНК Runx1 в АГМС в 10 мкм лечение флуоксетином был обнаружен Количественная ПЦР в реальном времени. T -критерия Стьюдента: **, P < 0.01. Результаты представлены как среднее ± SEM. (B) западной blotting анализ также подтвердил, что увеличение выражение Runx1 уровня белка в АГМС лечение флуоксетином. (C) представитель изображения показывают морфология BFU-E, кое-GM и кое-ГЭММ. Масштаб баров = 100 µm. (D) кое-C анализа показали, что лечение флуоксетин может увеличить количество каждого типа колонии. Использовался один эмбрион эквивалент (ee). T -критерия Стьюдента: *, P < 0,05; **, P < 0.01.The результаты представлены как среднее ± SEM. (E) кое-S пробирного с АГМС лечение флуоксетином, показал, что флуоксетин может увеличить количество колоний в селезенке облученного взрослых получателей. Масштаб баров = 1.5 мм. 1 был использован ee. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хорошо известно, что Зрелые СКК в костном мозге может населить системы крови облученных получателей. В отличие от этих функциональных СКК возникающих СКК в AGM зародышей мыши являются незрелыми. Прямая пересадка результаты показали, что тип я (VE-САПР+ CD45– CD41+) и II типа (VE-САПР+ CD45+) pre СКК обладают не восстановление способности20. Воспользовавшись зарождающейся СКК в регионе AGM AGM экспланта культуры системы можно восстановить получателей в трансплантации пробирного4,20. Кроме того благодаря внутриутробное развитие эмбриона мыши, в естественных условиях экспериментов, чтобы спасти нарушение кроветворения в KO мышей неудобны для выполнения. AGM экспланта культура является альтернативной системы, которая хорошо подходит для спасения экспериментов, просто путем добавления химических веществ (факторов роста и цитокинов) в средних13,15. Помимо AGM желточного мешка и фетальной печени может также быть культивировали с этой системы7.
В начале этого эксперимента, строгой стерилизации фильтров и сетки из нержавеющей стали весьма важным избежать загрязнения. Что еще более важно важнейшим шагом в культуре, чтобы расчлененных AGM культивировали на фильтры в интерфейсе воздуха жидкость. Слишком много средних вызовет AGM быть культивировали в жидкости и может быть гнилые, тогда как слишком мало среднего сделает AGM сухой. Во время культивирования, поддержание надлежащего влажность инкубатора клетки также имеет важное значение для предотвращения испарения среды.
Дальнейшее совершенствование этого explant культуры системы действительно имитировать развития СКК в естественных условиях, вместе с недавние выдвижения в органоид культуры техники21, позволит значительно расширить его применение в исследованиях кроветворения, от HSC самообновления, мульти линии дифференциации и взаимодействие HSC-нишу для моделирования и наркотиков обнаружения заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конфликтующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Гао Suwei за помощь в подготовке рис. Эта работа была поддержана субсидий из национального фонда Китая естественных наук (81530004, 31425016) и Министерство науки и техники Китая (2016YFA0100500). J.L. эксперименты и составлен рукопись; Ф.л. редактировать рукописи. Оба автора читать и одобрила окончательный вариант рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
