Summary
조 혈 줄기에 규제 요인 및 신호 통로의 효과 결정 하 식 분석, 문화와 비장, 장기 재구성에 콜로 니 형성 단위에 대 한 교양된 대동맥-생식-Mesonephros를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다. 셀 개발입니다. 이 조 혈 줄기 세포 생물학을 연구 하 고 기능에 대 한 효과적인 시스템으로 입증 되었습니다.
Abstract
조 연구에 대 한 마우스 배아를 사용 하 여 제한 주로 태아의 자궁내 개발 하는 작업에 추가 불편입니다. 녹아웃 (KO) 마우스에서 유전자 데이터를 설득 하지만 필요에 따라 모든 유전자에 대 한 코 쥐를 생성할 비현실적 이다. 또한, vivo에서 수행 코 쥐에서 얻은 데이터를 통합 하는 구조 실험은 하지 편리. 이러한 한계를 극복 하기 위해 대동맥-생식-Mesonephros (AGM) explant 문화는 조 혈 줄기 세포 (HSC) 개발을 공부 하는 적절 한 시스템으로 개발 되었다. 구조 실험을 위해 특히 코 쥐에 장애인된 조 복구 사용할 수 있습니다. 매체에 적합 한 화학 물질을 추가 하 여 장애인 신호 재 활성화할 수 있습니다 또는 위로 경로 저해 될 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 많은 실험 HSC 개발의 중요 한 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 수행할 수 있습니다, 그리고 HSC를 포함 하 여 관련 된 mRNA와 단백질 수준, 식민지 형성 능력, 및 재구성 능력에서 유전자 발현. 이 일련의 실험 포유류에 HSC 개발에 필수적인 기본 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 될 것 이다.
Introduction
조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 자체 갱신 하는 기능 뿐만 아니라 erythroid, 골수성를 포함 하는 multilineage 잠재력 및 림프 세포 조직 관련 성인 줄기 세포 이다. 최근 연구 초기 HSCs 조 혈 등 쪽 대동맥1,2의 복 부 벽에 전환 (EHT) 내 피를 통해 (그는), hemogenic endothelium로 알려진 전문된 내 피 인구에서 발생 ,,34. HSCs 확장을 위한 태아 간으로 이동 되며 마지막으로 개인의 생활 내내 성인 조를 유지 하 골 식민지 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에 배아 (E) 10.5에서에서 E12.5 마우스 배아 형성, 면 5 , 6.이 몇 년 동안 공부 하고있다, 비록 HSC 출현 그리고 발달의 기본 메커니즘 남아 불완전 하 게 이해.
체 외에서 수정 및 zebrafish 태아의 개발와 달리 마우스 배아의 자궁내 개발은 확실 한 조 연구 embryogenesis 동안 훨씬 더 불편. 녹아웃 (KO) 마우스를 사용 하 여 유전 실험은 일반적으로 활용 하 고, 비록 특정 KO 마우스의 부족 또한 조 혈 연구 분야에서 그들의 사용을 제한 합니다. 또한, 구조 실험 vivo에서 KO 생쥐에서 쉽게 수행 하지 않습니다. 1996 년 이래로, AGM explant 문화 분야7에 개척자에 의해 조 혈 연구 개발 되었습니다. 이 문화 시스템의 도움으로 관련해 지역의 복 부 조직 등 조직 반대 효과8,9발휘 하는 동안 HSC 활동, 홍보 확인 되었습니다. AGM explant 문화 시스템 또한 세로토닌, Mpl, SCF, BMP, HSC 개발10,,1112,13, 신호 고슴도치의 역할 결정에 적용 된 14. 중요 한 것은, 그것은 또한 돌연변이 배아13,15조 혈 결함을 구출 하는 데 사용 하는 인기 있는 방법.
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Protocol
동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 동물학 연구소, 중국 과학원, 베이징, 중국에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 재료 준비
- Sterilize는 0.65 μ m 필터 자외선 자외선 아래 생산 4 h에 대 한 깨끗 한 벤치에 램프를 레이 2 h 마크 후 필터를 넘겨.
참고: UV 라이트를 사용할 경우 적절 한 보호를 착용. - 소독 30 분 동안 121 ° C에 고압 소독 기와 스테인레스 스틸 메쉬.
참고: 스테인레스 스틸 메시의 특정 높이 공기 액체 인터페이스에서 필터를 지원 하기 위해 필요 하다 고이 강철 메시 ( 그림 1 A)에 와이어로 실현 될 수 있다. - M5300 장기로 10 µ M의 최종 농도에 희석 부정맥 문화 매체와 혼합 균등 하 게.
참고: 6-잘 접시 2 mL M5300 장기 배양은 각 잘 적합 합니다. 10 -6 M에 날린 선택적으로 매체에 희석 수 있습니다. - 6 잘 플레이트 나 요리에 10 µ M에서 부정맥으로 보충 하는 매체를 전송 하 고 매체에 넣고 멸 균된 스테인레스 스틸 메쉬.
- 때마다 살 균에 대 한 유리 셀 문화 접시에 두 번 3 분 동안 끓는 물으로 0.65 μ m 필터 세척. 각 세척, 염 인산 염 버퍼에 필터를 넣어 (PBS) 2 분 및 장소는 스테인리스에 젖은 필터 메쉬 공기 액체 인터페이스에 서 보듯이 그림 1 A [도식 후 센터].
참고: 끓는 물 생성 될 수 있습니다와 무 균 상태를 달성 하기 위해 고압 소독 기 및 장비 온도 감소를 피하기 위해 적시에 고압 소독 기에서 취해야 한다.
2. AGM Explant 문화
- 신중 하 게 집게와 E10.5 또는 E11 배아에서 AGM 영역을 분리.
- 해가 위로 임신한 쥐에서 uteruses를 벗기고 배아는 uteruses에서 분리.
- 노른자위 낭, 탯 줄, 및 태아 몸에서 내장 닦아.
- 신중 하 게 등 쪽 신경 조직 및 주변 근육 조직 제거.
- 컷 앞쪽에 및 후방 사지의 사이트에 집게와 조직와 관련해 지역 태아 몸에서 분리. 그림 1 B C 표현식 및 해 부 AGM의 형태 표시.
- 2-3 일 동안 37 ° C에서 5% CO 2 문화와 공기 액체 인터페이스 ( 그림 1 A)에서 필터에 별도로 해 부 AGMs explant.
참고: 않습니다 하지 강철 메시의 와이어에 해 부 관련해 놓고 필터 문화 중 공기 액체 인터페이스에는 다는 것을 확인 합니다. AGM, 외 노 른 자 sac와 태아 간 수 또한 될 교양이 시스템 7.
3. 식 분석
- mRNA 수준
- 1 mL PBS에 교양된 AGMs 수집 및 4 ° c, 310 x g 6 분에 대 한 원심
- 제거한 후에 상쾌한, 총 RNA 추출에서 monophasic 솔루션 페 놀의 수집된 AGMs 제조 업체에 따르면 ' s 지침.
- 총 RNA (2 µ g)은 역방향 다음 템플릿으로 cDNA를 M MLV 역전사를 사용 하 여 복사할. 양적 실시간 PCR 분석 실험 SYBR 녹색 공연과 Gapdh 내부 통제로 사용 됩니다.
- 단백질 수준
- 단계 3.1.1에서에서 위에서 설명한 대로 교양된 관련해 수집.
- 세포 세포의 용 해 버퍼와 교양된 AGM에서 단백질을 준비 (10 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, 그리고 0.5 %NP-40) 포함 하는 효소 억제제와 단백질 수준으로 이전 검색 서양 blotting에 대 한 사용 설명 13.
4. 식민지 형성 단위 (CFU-C) 문화 분석 결과에
- 2-3 일 동안 배양 후 1 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 및 4 ° C, 6 분 310 x g에서 원심 분리기에 관련해 지역 수집 하 고 37에서 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 해리 ° C.
참고: 단일 셀-정지를 생성 하는 콜라에 필요한 시간은 약 20 분입니다. 관련해 포함 된 튜브를 떨고 5 분 마다 소화 과정을 가속화할 수 있습니다. 200 µ L 0.1% 콜라 각 관련해 사용 되 고 200 µ L 10% 혈 청 반응을 중지 하는 데 사용 됩니다. - 문화 초 저 첨부 파일 24-잘 접시에서 M3434 매체에 단일 셀 정지.
참고: 오염을 피하기 위해, 페니실린 스 솔루션 추가할 수 있습니다 선택적으로 매체에. M3434 매체 점성 때문에 1.0 cc 주사기 바늘 없이 세포와 매체는. - 후 7-10 일 식민지 형성 단위-erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyte (CFU-GM) 및 CFU granulocyte, 버스트를 포함 한 적혈구, 대 식 세포, megakaryocyte (CFU-GEMM)의 각 유형에 대 한 수, 5% CO 2에서 37 ° C에서 배양 고유 형태에 따라 하 고 ( 그림 2 C) 거꾸로 현미경으로.
5. Vivo에서 분석 결과 이식
explant 경작의- 식민지 형성 단위-비장 (CFU-S) 분석 결과
- 후 2-3 일은 AGMs 수집 하 고 준비 20 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 함께 배양 하 여 단일 셀-정지 분
- 8에 10 주 된 남성 C57BL/6 마우스의 치명적인 방사선 (x-레이의 9 Gy)을 수행 셀 주입 하기 전에 4-5 h.
- Restrainer의 활동을 제한 하에 비친된 마우스 넣어.
- 꼬리 정 맥의 vasodilatation를 홍보 하기 위해 75% 알코올에 면봉을 사용 하 여 닦아.
- 0.5 배아 상응 (ee) 또는 1 ee AGM의 단일 셀-정지 정 맥에 주사 방사능된 쥐의 꼬리 정 맥 1.0 cc 주사기.
참고: 세포는 PBS로 일시 중단 하 고 받는 당 0.5 mL PBS는 적합 한 볼륨. 25 게이지 또는 26 게이지 크기 바늘 1.0 cc 주사기 주입에 사용 됩니다. 공기는 주사기에 도입 될 수 있습니다. 눌러 출혈을 멈추게 하는 살 균 면봉으로 사출 사이트. - 11 일 이식, 수집 게시 하 고 받는 사람 마우스의 spleens Bouin 수정 ' s 솔루션 (15 mL 1.22 %Picric 산 포화 용액 2 mL 40% 메탄올, 아세트산 1 mL) 1-2 일 및 또 다른 1-2 일 동안 80% 알코올로 세척. 거시적 비장에 보이는 식민지를 계산 하 고 ee 당 식민지의 수를 결정.
참고: Bouin ' s 정착 액, 마모 보호.
- 장기 이식 분석 결과
- 경작 explant는 AGMs를 수집 하 고 준비 하는 20 분에 대 한 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 함께 배양 하 여 단일 셀 정지 후 2-3 일
- 수행 8에 10 주 된 남성 C57BL/6 마우스의 치명적인 방사선 (x-레이의 9 Gy) 셀 주입 하기 전에 4-5 시간.
- Restrainer의 활동을 제한 하에 비친된 마우스 넣어.
- 꼬리 정 맥의 vasodilatation를 홍보 하기 위해 75% 알코올에 면봉을 사용 하 여 닦아. < l나 > 0.5 배아 상응 (ee)를 주입 또는 1 ee 1.0 cc 주사기 비친된 마우스의 꼬리 정 맥에 정 맥 AGM의 셀 정지를 단일. AGM의 2 × 10 5 골 수 세포 (CD45.1 배경)와 받는 사람 당 1 ee 복용량 주입.
참고: 공기는 주사기에 도입 수 있습니다. 눌러 출혈을 멈추게 하는 살 균 면봉으로 사출 사이트. - 4 개월 후 이식 받는 사람의 골 수를 수집 하 고 FACS에 의해 재구성 분석 결과 대 한 그것을 사용 하 여. 함께 받는 ≥ 10% 기증자 파생 된 chimerism 성공적인 재구성 전시 여겨진다.
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Representative Results
최근 간행물 보고 내 피 세포 유래 세로토닌 관련해13프로 apoptotic 통로 억제 함으로써 HSCs의 생존을 촉진. HSC 개발에 세로토닌의 홍보 효과 확인 하려면 팩 포함 되었다. 선택적 세로토닌 재 이해 억제제 (SSRI)로 부정맥 주변 조직16,,1718세로토닌 재 흡수를 억제 하기 위해 입증 되었습니다. 문화 시스템 explant AGM를 사용 하 여, HSC 개발에 Fluoxetine의 효과 위의 절차에 따라 조사 되었다. 식 분석 각각 HSC 개발19, 부정맥 치료 AGMs mRNA와 단백질 수준에 대 한 중추적인 유전자로 정의 되는 Runx1의 증가 식 보였다 (그림 2A 와 2B). 부정맥도 크게 BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM (그림 2C , 그림 2D) 등 AGM에 HSCs의 식민지 형성 능력을 높일 수 있습니다. 또한, 이식 결과 vivo에서 부정맥으로 치료 AGM에 HSCs 비친된 성인 받는 (그림 2E)에 비장 식민지의 수를 늘릴 수 보였다.
그림 1 . AGM 구조와 explant의 도식 표현 문화 시스템.
(A) 관련해 explant 문화 단호하다를 사용 하 여 순서도 HSCs 개발에 화학 물질의 효과 검사 합니다. 간단히, AGMs 배아에서 해 부 고 M5300 장기 문화 매체에서 희석 하는 화학 물질과 공기-액체 인터페이스에서 필터에 경작. 2-3 일 후, 교양된 AGMs 수집 하 고 조 혈 관련된 유전자, 식민지 형성 능력, 및 repopulation 용량 식을 검사 하는 데 사용 됩니다. AGM, 대동맥-생식-mesonephros; CFU C, 콜로 니 형성 단위 문화; CFU S, 콜로 니 형성 단위 비장. (B) AGM의 구조는이 다이어그램에 표시 됩니다. , 등 쪽 대동맥; 나, mesenchyme; G, 생식; M, mesonephros입니다. (C) AGM의 형태. 관련해는 E10.5에서 주변의 중간 엽 세포와 배아 시체의 꼬리 절반에서 분리 된다. 스케일 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . AGM의 응용 explant 문화 감지 하는 시스템 개발 HSC에 Fluoxetine의 효과. (A) Runx1 AGMs 10 µ M에서 부정맥으로 치료에서 mRNA 수준 양적 실시간 PCR에 의해 발견 되었다. 학생의 t 시험: * *, P < 0.01. 결과 평균 ± SEM. (B) 서양 분석 더 럽 Runx1는 AGMs에서 단백질 수준에서의 증가 식 부정맥으로 치료 확인으로 표시 됩니다. (C) 대표 이미지 BFU-E, CFU GM과 CFU GEMM의 형태를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 µ m. (D) CFU C 분석 결과 부정맥 치료 각 유형의 식민지의 수를 증가할 수 있다 보여주었다. 한 배아 상응 (ee) 사용 되었다. 학생의 t 시험: *, P < 0.05; * *, P < 0.01.The 결과 AGMs 부정맥 비친된 성인 받는 비장에 있는 식민지의 수를 증가할 수 있다 보여주었다 부정맥으로 치료로 평균 ± SEM. (E) CFU S 분석 결과 표시 됩니다. 스케일 바 = 1.5 m m. 1 ee 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 잘 알려진 골 수에서 성숙 HSCs 조사 받는 사람 혈액 시스템을 다시 수 있습니다. 이러한 기능 HSCs 달리 마우스 배아의 AGM에 신흥 HSCs 성숙 하지 않습니다. 직접 이식 결과 유형을 보여 난 (VE-cad+ CD45- CD41+) 유형 II와 (VE-cad+ CD45+) 사전 HSCs 없이 재구성 능력20소유. AGM explant 문화 시스템 관련해 지역에서 초기 HSCs의 활용 이식 분석 결과4,20에서 받는 사람 다시 구성할 수 있습니다. 또한,이 마우스 배아의 자궁내 개발 때문 vivo에서 실험 코 쥐에 장애인된 조 구출을 수행 하기 편리 하지 않습니다. AGM explant 문화는 중간13,15에 화학 물질 (성장 인자, cytokines)을 추가 하 여 구조 실험에 적합 한 대체 시스템 이다. AGM, 뿐만 아니라 노 른 자 sac와 태아 간 수 또한 될 교양이 시스템7.
이 실험의 시작 부분에서 엄격한 살 균 필터 및 스테인레스 스틸 메시의 오염을 피하기 위하여 확실히 중요 하다. 더 중요 한 것은, 문화에 중요 한 단계는 공기 액체 인터페이스에서 필터에 해 부 관련해 교양을 만드는 것입니다. 너무 많은 매체에 액체에서 배양 되도록 관련해 원인과 반면 너무 작은 매체 관련해 건조 하게된다 부패, 있을 수 있습니다. 경작, 동안 셀 인큐베이터의 적절 한 습도 유지도 중요 하다 매체의 증발을 방지 하기 위해.
이 더 개선 문화 시스템을 진정으로 모방 HSCs에서 vivo에서, organoid 문화 기술21에 있는 최근 전진 함께 개발 explant, 크게에서 조 연구에 응용 프로그램을 확장할 것 이다 HSC 자체-갱신, 다중 계보 차별화, 그리고 질병 모델링 및 약물 발견에 HSC 틈새 상호 작용.
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Disclosures
저자 아무 충돌 금융 관심 있다.
Acknowledgments
그림 준비에 도움에 감사 Suwei가 오 하 고. 이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81530004, 31425016) 사역의 과학 및 중국의 기술 (2016YFA0100500)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. : J.L. 실험 수행 및 초안 원고; 플로리다는 원고 편집. 두 저자는 읽기와 최종 원고를 승인.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
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