Summary
Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.
Abstract
A limitação do uso de embriões do rato para estudos de hematopoiese é o inconveniente adicional nas operações, que é em grande parte devido ao desenvolvimento intra-uterino do embrião. Embora os dados genéticos de camundongos nocaute (KO) são convincentes, não é realista para gerar camundongos KO para todos os genes, conforme necessário. Além disso, realizando na vivo resgate experiências para consolidar os dados obtidos de camundongos KO não é conveniente. Para superar essas limitações, a cultura de explante de Aorta-gônada-Mesonephros (AGM) foi desenvolvida como um sistema adequado para estudar o desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas (HSC). Especialmente para as experiências de resgate, ele pode ser usado para recuperar a hematopoiese prejudicada em camundongos KO. Adicionando os produtos químicos apropriados entram no meio, a sinalização deficiente pode ser reactivada ou vias acima-regulada podem ser inibidas. Com o uso desse método, muitos experimentos pode ser realizada para identificar os reguladores críticos de desenvolvimento do HSC, incluindo HSC relacionados a expressão gênica em níveis de mRNA e proteína, capacidade de formação de colônia e capacidade de reconstituição. Esta série de experimentos seria útil na definição dos mecanismos subjacentes essenciais para o desenvolvimento de HSC em mamíferos.
Introduction
Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células-tronco tecido-específica adultas que possuem potencial multilineage incluindo eritroide, mieloide e células linfoides, bem como a capacidade de se renovar. Estudos recentes têm mostrado que os primeiros linfócitos surgiram de uma população endotelial especializada, conhecida como endotélio hemogenic (ele), através o endotelial de transição hematopoiética (EHT) na parede ventral da aorta dorsal1,2 ,3,4. Uma vez formado na aorta-gônada-mesonephros (AGM) região de embrionária (E) 10.5 para E12.5 do embrião de rato, linfócitos irão migrar para o fígado fetal para expansão e finalmente colonizar a medula óssea para manter a hematopoiese adulta ao longo da vida do indivíduo 5 , 6. embora isto tem sido estudado por muitos anos, os mecanismos subjacentes de HSC surgimento e desenvolvimento permanecem incompletamente compreendidos.
Ao contrário de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, desenvolvimento intra-uterino de embriões do rato torna o estudo da hematopoiese definitivo durante a embriogênese muito mais inconveniente. Apesar de experiências genéticas usando camundongos nocaute (KO) são comumente utilizadas, a falta de alguns ratos KO também limita a sua utilização no campo de pesquisa hematopoiéticas. Além disso, na vivo experiências de resgate não são facilmente realizadas em camundongos KO. Desde 1996, a cultura de explant AGM foi desenvolvida para estudos hematopoiéticos pelos pioneiros no campo7. Com a ajuda deste sistema de cultura, tecidos ventrais da região AGM foram identificados para promover a atividade HSC, enquanto tecidos dorsais exercem um oposto efeito8,9. O sistema de cultura de explant AGM também foi aplicado para determinar as funções da serotonina, Mpl, SCF, BMP e ouriço sinalização em HSC desenvolvimento10,11,12,13, 14. importante, é também um método popular usado para resgatar hematopoiéticos defeitos em embriões mutantes13,15.
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Protocol
todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de revisão ética no Instituto de Zoologia, da Academia Chinesa de Ciências, Beijing, China.
1. preparação de material
- esterilize a 0,65 µm filtros com ultravioleta raios produzidos sob o ultravioleta raio lâmpada no banco limpo para 4h e entregar os filtros após a marca de 2 h.
Nota: Ao trabalhar com luz UV, use proteção adequada. - Esterilizar as malhas de aço inoxidável com o esterilizador autoclave a 121 ° C por 30 minutos.
Nota: Uma certa altura, de malha de aço inoxidável é necessário para suportar os filtros na interface ar-líquido, e isto pode ser realizado com o fio sobre a malha de aço ( Figura 1 A). - Fluoxetine diluir para uma concentração final de 10 µM em longo prazo o M5300 cultura médio e mistura uniformente.
Nota: Para uma placa de seis, meio de cultura a longo prazo 2 mL M5300 é apropriado para cada poço. Hidrocortisona em 10 -6 M pode ser seletivamente diluída no meio de. - Transferir o suplementado com fluoxetina em 10 µM em placas boas seis ou pratos e coloque as malhas de inox esterilizados no meio de.
- Lavar os filtros de 0,65 µm com água a ferver duas vezes por 3 minutos cada vez que a placa de cultura de células de vidro para esterilização. Depois de cada lavagem, colocar os filtros em tampão fosfato salino (PBS) para 2 min. e lugar molhado filtros para o aço inoxidável malhas permanente na interface ar-líquido, como mostrado na Figura 1 A [esquemático no centro].
Nota: A água a ferver pode ser gerada com o esterilizador autoclave para alcançar a assepsia e equipamento deve ser retirado esterilizador autoclave em tempo hábil para evitar uma diminuição na temperatura.
2. Cultura de explantes AGM
- cuidadosamente separar regiões AGM os embriões no E10.5 ou E11 com fórceps.
- Tira o útero de ratos grávidas com a tesoura de dissecação e separar os embriões no útero.
- Limpe o saco vitelino, cordão umbilical e vísceras do corpo do embrião.
- Remover cuidadosamente o nervo dorsal tecidos e tecidos musculares circundantes.
- Corte fora os tecidos com a pinça no local dos membros anteriores e posteriores e separa a região AGM do corpo do embrião. figuras 1 B-C mostra a representação esquemática e morfologia de AGM dissecado.
- Explant as AGMs dissecados separadamente para os filtros na interface ar-líquido ( Figura 1 A) e cultura em 5% CO 2 a 37 ° C durante 2-3 dias.
Nota: Não coloque o AGM dissecado para o fio da malha aço e verifique se que os filtros estão na interface ar-líquido durante a cultura. Além da AGM, saco vitelino e fígado fetal também podem ser cultivados com este sistema 7.
3. Análises de expressão
- nível de mRNA
- recolher os AGMs cultivadas em 1 mL de PBS e centrifugar a 4 ° C, 310 x g, durante 6 min.
- Após a remoção do sobrenadante, o RNA total é extraído os AGMs coletados com uma solução monofásica de fenol, de acordo com o fabricante ' instruções de s.
- RNA total (2 µ g) Então é reverso transcrito usando M-MLV reverse transcriptase para obter o cDNA como modelo. Os ensaios PCR quantitativos em tempo real são executados com SYBR Green e Gapdh é usado como o controle interno.
- Nível de proteína
- recolher o AGM cultivada conforme descrito acima na etapa 3.1.1.
- Preparar a proteína de AGM cultivada com a lise celular (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 0,5% NP-40) contendo inibidor da protease e uso para a mancha ocidental para detectar o nível de proteína, como anteriormente descrito 13.
4. Unidades formadoras de colônia no ensaio de cultura (CFU-C)
- após 2-3 dias de cultivo, coletar as regiões AGM em 1ml tamponado fosfato salino (PBS) e centrifugar a 4 ° C, 310 x g, durante 6 minutos e dissociar com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) em 37 ° C.
Nota: O tempo necessário para colagenase gerar única-suspensões celulares é cerca de 20 minutos. Agitando o tubo contendo AGM cada 5 mins pode acelerar o processo de digestão. Colagenase de 0.1% 200 µ l é usado para cada AGM e 200 µ l de soro de 10% é usado para parar a reação. - Cultura única-suspensões celulares em meio de M3434 em placas de 24 poços fixação ultra baixo.
Nota: Para evitar contaminação, solução de penicilina-estreptomicina pode ser seletivamente adicionada no meio de. Porque o meio de M3434 é viscoso, uma 1,0 cc seringa sem agulha é usada para misturar as células e o meio. - Após 7 - 10 dias de cultivo em 37 ° C em 5% CO 2, o número para cada tipo de colônias, incluindo o estouro formando unidade - eritroide (BFU-E), CFU-granulo-monócitos (CFU-GM) e CFU-granulócitos, eritrócitos, macrófagos, megacariócito (CFU-GEMM) são distinguidos com base na morfologia e marcou com um microscópio invertido ( Figura 2 C).
5. Na Vivo Ensaio de transplante
- formadoras de Colônia (CFU-S) unidades-baço ensaio
- após 2 - 3 dias de cultivo de explante, coletar os AGMs e preparar única célula-suspensões incubando com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) por 20 min.
- Realizar irradiação letal (9 Gy de raios-x) de 8 a 10 - semana de idade camundongos C57BL/6 machos 4-5h antes da injeção celular.
- Colocar o mouse irradiado em uma retenção restringir sua atividade.
- Limpar o rabo usando um cotonete de algodão embebido em álcool 75% para promover vasodilatação da veia.
- Injetar 0,5 equivalente de embrião (ee) ou 1 ee único-suspensões celulares de AGM por via intravenosa na veia da cauda do rato irradiado com uma seringa de 1,0 ml.
Nota: As células são suspensos com PBS e 0,5 mL de PBS por destinatário é um volume adequado. Uma agulha de calibre 25 ou 26 gauge tamanho é usada para a injeção com uma 1,0 cc seringa. Sem ar pode ser introduzido para a seringa. Pressione o local da injeção com um cotonete anti-séptico para parar o sangramento. - Onze dias pós transplante, recolher e corrigir os baços dos ratos destinatários em Bouin ' s solução (solução aquosa de ácido pícrico de 1,22% saturado de 15 mL, 2 mL de metanol de 40% e 1 mL de ácido acético) por 1-2 dias e lave-a com 80% de álcool por mais 1-2 dias. Contar as colônias visíveis no baço macroscopicamente e determinar o número de colónias por ee.
Nota: Bouin ' fixador de s, desgaste de proteção apropriado.
- Ensaio a longo prazo do transplante
- após 2-3 dias de explantes de cultivo, coletar os AGMs e preparar única célula-suspensões incubando com colagenase de 200 µ l (0,1% em PBS) por 20 min.
- Realizar irradiação letal (9 Gy de raios-x) de 8 a 10 - semana de idade camundongos C57BL/6 machos 4-5 hrs antes da injeção celular.
- Colocar o mouse irradiado em uma retenção restringir sua atividade.
- Limpar o rabo usando um cotonete de algodão embebido em álcool 75% para promover vasodilatação da veia. < lEu > injetar 0,5 embrião equivalente (ee) ou 1 ee única suspensões celulares de AGM por via intravenosa na veia de cauda de um rato irradiado com uma seringa de 1,0 ml. AGM são injetados na dose de 1 ee por destinatário com 2 × 10 5 células da medula óssea (fundo CD45.1).
Nota: Falta de ar pode ser introduzido para a seringa. Pressione o local da injeção com um cotonete anti-séptico para parar o sangramento. - Pós-transplante de quatro meses, coletar a medula óssea do receptor e usá-lo para o ensaio de reconstituição por FACS. Apenas os destinatários com ≥ quimerismo doador-derivado de 10% são considerados a exibir reconstituição bem-sucedida.
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Representative Results
Uma publicação recente relatado serotonina derivado de células endotelial promove a sobrevivência de linfócitos inibindo o caminho pro-apoptotic no AGM13. Para confirmar o efeito de promoção de serotonina no desenvolvimento de HSC, fluoxetina foi incluída. Como um inibidor de recaptação de serotonina (ISRS), fluoxetina foi demonstrada para inibir a reabsorção de serotonina em tecidos periféricos16,17,18. Usando o AGM explant sistema cultura, analisou-se o efeito da fluoxetina no HSC desenvolvimento seguindo o procedimento apresentado acima. As expressão análises mostraram aumento da expressão de Runx1, que é definido como um gene crucial para desenvolvimento HSC19, em tratados com fluoxetina AGMs, em níveis de mRNA e proteína, respectivamente (Figura 2 e 2B). Fluoxetina pode também significativamente aumentar a capacidade de formação de colônia de linfócitos em assembleia geral, incluindo BFU-E e CFU-GM CFU-GEMM (Figura 2C e 2 figuraD). Além disso, na vivo resultados de transplante mostraram que linfócitos em AGM tratadas com fluoxetina podem aumentar o número de colônias de baço em irradiados destinatários adultos(Figura 2).
Figura 1 . Representação esquemática da estrutura da AGM e explante cultura sistema.
(A) o fluxograma para usar o sistema de cultura de explant AGM examinar o efeito de substâncias químicas no desenvolvimento de linfócitos. Brevemente, AGMs são dissecados de embriões e cultivadas em filtros na interface ar-líquido com produtos químicos diluídos em meio de cultura M5300 a longo prazo. 2 - 3 dias depois, os culturas AGMs são coletados e usados para examinar a expressão de genes relacionados hematopoiéticos, capacidade de formação de colônia e capacidade de repovoamento. AGM, aorta-gônada-mesonephros; Unidades CFU-C, formadoras da cultura; CFU-S, formadoras unidades-baço. (B) a estrutura da AGM é mostrada neste diagrama. Uma, aorta dorsal; Me, mesênquima; G, a gônada; M, mesonephros. (C) a morfologia da AGM. A AGM é separada da metade caudal do corpo embrionário com as células mesenquimais circundantes no E10.5. Barras de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Aplicação da AGM explant sistema de cultura para detectar o efeito da fluoxetina sobre desenvolvimento de HSC. (A) o nível de mRNA de Runx1 nas AGMs tratada com fluoxetina em 10 µM foi detectado por PCR quantitativo em tempo real. Teste t de Student: * *, P < 0,01. Os resultados são apresentados como média ± SEM. (B) Western mancha ainda mais análise confirmou que o aumento da expressão de Runx1 a nível de proteína nos AGMs tratados com fluoxetina. (C) as imagens representativas mostram a morfologia da CFU-GM, BFU-E e CFU-GEMM. Barras de escala = 100 µm. (D) CFU-C ensaio mostrou que o tratamento de fluoxetina pode aumentar o número de cada tipo de colônia. Utilizou-se um embrião equivalente (ee). Teste t de Student: *, P < 0,05; * *, P < 0.01.The resultados são apresentados como média ± SEM. (E) CFU-S ensaio com AGMs tratados com fluoxetina mostrou que a fluoxetina pode aumentar o número de colônias no baço de destinatários adultos irradiados. Escala de barras = 1,5 mm. 1 ee foi usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
É sabido que linfócitos maduros na medula óssea podem repovoar o sistema sanguíneo de destinatários irradiados. Ao contrário destes linfócitos funcionais, os linfócitos emergentes em assembleia geral de embriões do rato são imaturos. Resultados de transplante direto mostraram esse tipo eu (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-+ CD45 cad+) pré-linfócitos possuem nenhuma capacidade de reconstituição20. Aproveitando o sistema de cultura de explant AGM, os linfócitos nascentes na região AGM pode reconstituir os destinatários ao transplante ensaio4,20. Além disso, devido ao desenvolvimento intra-uterino do embrião do rato, na vivo experimentos para resgatar a hematopoiese prejudicada em camundongos KO são inconvenientes para executar. A cultura de explant AGM é um sistema alternativo, que é bem adequado para experimentos de resgate, simplesmente pela adição de substâncias químicas (citocinas e fatores de crescimento) em média13,15. Além da AGM, o saco vitelino e fígado fetal também podem ser cultivados com este sistema7.
No início do experimento, a esterilização rigorosa dos filtros e malhas de aço inoxidável é muito importante para evitar a contaminação. Mais importante, o passo fundamental na cultura é tornar a AGM dissecado cultivadas sobre os filtros na interface ar-líquido. Muito médio fará com que o AGM ser cultivadas no líquido e pode ser deteriorado, Considerando que muito pouco médio fará com que o AGM seco. Durante o cultivo, mantendo a umidade adequada da incubadora a célula também é importante para evitar a evaporação do meio.
Aperfeiçoamento deste explant sistema de cultura para imitar verdadeiramente o desenvolvimento dos linfócitos na vivo, juntamente com os avanços recentes em organoides cultura técnicas21, irá expandir sua aplicação em estudos de hematopoiese, de Diferenciação de auto-renovação, linhagem multi HSC e interação de HSC-nicho para descoberta de modelagem e droga de doença.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos Suwei Gao para ajudar na preparação de figura. Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (81530004, 31425016) e o Ministério da ciência e tecnologia da China (2016YFA0100500). J.L. realizou os experimentos e elaborou o manuscrito; F.L. editado o manuscrito. Ambos os autores ler e aprovaram o manuscrito final.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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