Summary
Vi præsenterer en teknik til lokaliserede administration af narkotika gennem ruten trans-tympaniske ind i cochlea. Medicinafgivelse gennem denne rute ville ikke forstyrre anti-cancer effekt af de kemoterapeutiske stoffer såsom cisplatin.
Abstract
Systemisk administration af beskyttende agenter til behandling af narkotika-induceret ototoksicitet er begrænset af den mulighed, at disse beskyttende stoffer kan forstyrre den kemoterapeutiske effekten af de primære lægemidler. Dette gælder især for stof cisplatin, hvis anticancer handlinger er svækket af antioxidanter, som giver tilstrækkelig beskyttelse mod tab af hørelse. Andre aktuelle eller potentielle otoprotective agenter kunne udgøre et lignende problem, hvis administreres systemisk. Anvendelse af forskellige biologiske stoffer eller beskyttende agenter direkte til cochlea ville give mulighed for høje niveauer af disse stoffer lokalt med begrænsede systemiske bivirkninger. I denne rapport viser vi en trans-tympaniske metode til levering af forskellige lægemidler eller biologiske reagenser til cochlea, som bør øge grundlæggende videnskabsforskning i cochlea og give en enkel måde at brugen af otoprotective agenter i klinikkerne. Denne rapport beskriver en metode til trans-tympaniske medicinafgivelse og giver eksempler på, hvordan denne teknik har været anvendt med succes i forsøgsdyr til at behandle cisplatin ototoksicitet.
Introduction
Den perifere auditive system er udsøgt følsomme medicin såsom cisplatin og aminoglykosid antibiotika. Cisplatin er en himmelvidt anvendte kemoterapeutiske agent for behandling af en lang række solide tumorer, såsom æggestokkene, testikelkræft og hoved og hals kræft. Ototoksicitet oplevet med brug af dette stof er dosis-begrænsning og ret almindelig, påvirker 75-100% af patienterne behandlet1. Andre stoffer, såsom carboplatin og oxaliplatin, er dukket op som alternativer til cisplatin2,3,4,5, men deres anvendelighed er begrænset til nogle kræftformer.
Tidlige studier har vist den kritiske rolle af reaktive ilt arter (ROS) i mægle ototoksicitet produceret af cisplatin og aminoglykosider. Efterfølgende undersøgelser viste, at NOX3 isoform af NADPH oxidase er den primære kilde til ROS i øresneglen, og aktiveres af cisplatin6,7. Generation af ROS kompromiser øget antioxidant buffer kapaciteten af celler, fører til lipid fedtstoffer af cellulære membraner8. Derudover øger cisplatin produktionen af hydroxylradikaler, som genererer højtoksiske aldehyd 4-hydroxynonenal (4-HNE), en initiativtager til celle død9,10. Baseret på disse resultater, er blevet undersøgt flere antioxidanter til behandling af cisplatin ototoksicitet. Disse omfatter N-acetyl cystein (NAC), sodium thiosulfate (STS), amifostine og D-methionin. En stor bekymring for antioxidant terapi er dog at disse antioxidanter kan reducere cisplatin kemoterapeutiske effekt når det administreres systemisk11 gennem interaktion af cisplatin med thiol grupper i antioxidant molekyler.
I lyset af disse problemer med antioxidant terapi var målet med denne undersøgelse at undersøge de trans-tympaniske rute levere antioxidanter og andre stoffer til cochlea at reducere tab af hørelse. Trans-tympaniske rute stof og korte indblanding (si) RNA, beskrives nedenfor, vises særligt lovende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mandlige Wistar rotter blev håndteret i overensstemmelse med National Institutes of Health dyret bruge retningslinjer og en protokol, der er godkendt af det sydlige Illinois University skole af medicin Laboratory Animal Care og bruge udvalg. Auditive hjernestammen svar (ABR) blev udført på rotter mens under anæstesi før drug administration og 72 h efter for at kontrollere effekten af den trans-tympaniske medicinafgivelse.
1. auditive hjernestammen svar (ABR)
Bemærk: ABR målinger blev indsamlet ved hjælp af auditive test udstyr og software. ABR repræsenterer evoked potentials eller højfrekvente bølger genereret af den ottende kranienerver (bølge I og II) og andre højere auditive hjernestammen strukturer herunder anteroventral cochlear kerne (bølge III), lateral lemniscus (bølge IV) og ringere colliculus (bølge V). Disse bølger er differentieret afhængig af ventetid. ABR målinger blev udført som beskrevet tidligere12.
- Bedøver rotter med en blanding af 90 mg/kg ketamin og 17 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion. Bekræfte dybde af anæstesi via toe-knivspids refleks. Anvende oftalmologiske smøring (eller mineralolie dråber) på begge øjne til at forhindre øjne fra udtørring og undgå ulceration under anæstesi.
- Placere rotten i den liggende stilling på en varmepude (37 ° C) i en kontrolleret akustiske booth. Audiologi testudstyr ligger udenfor og ved siden af standen.
- Indsæt rustfrit stål elektroder i overensstemmelse hermed: jorden elektrode i bageste flanke, den positive elektrode mellem de to ører direkte på toppen af kraniet, og de negative elektroder under toppunkt i hvert øre.
- Anvende akustiske stimuli ved hjælp af højfrekvente transducere som en 5 ms tone brast på 8, 16 og 32 kHz. Bestemme stimulus intensitet som decibel lydtryk (dB SPL). Dette begynder ved 10 dB SPL og når 90-dB SPL med en 10-dB trin størrelse. Kalibrere de lyd intensiteter til et maksimalt output af 90-dB SPL ved hjælp af en impuls præcision Lydmåler.
Bemærk: Testens resultat giver en indikation af integriteten af den perifere hørelse orgel, cochlea og de førnævnte auditive strukturer. Kurveformer genereres inden for 15 ms af stimulus input og latenstid af bølgerne afhænger overledningstid, som igen er reguleret af tre kritiske faktorer: mængden af hjernen, intensiteten og hyppigheden af lyden. Auditive evoked potentials blev registreret ved hjælp af software, der leveres af producenten. - Overveje den mindste intensitet, som kan fremkalde to forskellige bølgeformer (II og III) i 0,5 µV amplitude som tærskel fremtrædende.
Bemærk: Tærskel Skift repræsenterer forskellen i den tærskel, der måles efter behandling sammenlignet med den tærskel, der er fremstillet før behandling.
2. Trans-tympaniske injektioner
- For at administrere stoffet trans-tympanically, placere rotten i den venstre lateral decubitus position.
- Indsæt 2,5 mm engangs øre specula ind i øregangen.
- Placer specula med brug af en kirurgisk anvendelsesområde, så trommehinden er synlige.
- Ved hjælp af en 29 G X ½, 0,5 mL insulin sprøjte, udarbejde 50 µL af [R] - N - phenyl isopropyl adenosin (R-PIA) opløsning (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) opløsning (3 µM) eller siRNA løsning (0,9 µg) at injicere (5 enheder).
- Bruge specula direkte nål til den forreste ringere region i trommehinden.
- Stikke et hul gennem membranen med nålen og administrere stoffer nævnt i 1.2.3. Tillad rotte at hvile i denne position i 15 min.
Bemærk: 50 µL bør være den passende mængde til at passe bag trommehinden. Ingen væske skal være i den øre kanal efter administration. - Placere rotten i højre laterale decubitus position og Gentag trin 1.2.1 gennem 1.2.5 for administrationen i andet øre.
- For rotter modtager cisplatin intraperitoneal, placere rotten i den liggende stilling på en varmepude på 37 ° C.
- Ved hjælp af en 21 G X 3/4 sommerfugl nål (12" længde slange), udarbejde cisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL opløsning i sterilt fosfat buffer saltvand [PBS]).
- Ved hjælp af en sprøjte pumpe, administrere cisplatin (1 mg/mL) via intraperitoneal injektion over 30 min.
Bemærk: For en 250-g rotte, ville lydstyrken være 2,75 mL med en hastighed på ca. 0,1 mL / min.
- Fortsætte med at overvåge dybde af anæstesi overalt i disse procedurer. Når cisplatin administration er færdig, placere rotten tilbage i buret i liggende position, og sørg for der er intet til hindrer dets vejrtrækning.
- Overvåge rotte indtil fuldt tilbagebetalt.
3. cochlea dissektion og afkalkning
- Efter den endelige ABR (efter 72 timer), bedøver rotte med en blanding af 90 mg/kg ketamin og 17 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion. Bekræfte anæstesi med en tå-knivspids refleks. Aflive rotten via halshugning.
- Dissekere ud den tidsmæssige knoglen som tidligere beskrevet13.
- Placer cochlea i 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS løsning i en 7-mL glas scintillation hætteglas (helt dækker cochlea). Opbevares i køleskab natten over ved 4 ° C. Fjerne PARAFORMALDEHYD og vask med 1 x PBS ved stuetemperatur.
- Fjerne PBS og fyld slangen helt med en 120 mM løsning af EDTA (pH 7.3). Sted på en rotator ved stuetemperatur og tillade afkalkning i 2 til 3 uger, ændrer EDTA-oploesningen dagligt.
4. Cryosectioning
- Ved afslutningen af afkalkning, helt fordybe cochlea i de følgende løsninger (7 mL hver) i 24 timer ved 4 ° C: 10% saccharose, 20% saccharose, 1:1 blanding af 20% saccharose og optimal opskæring temperatur (OCT) indlejring sammensatte.
- Placer frisk OCT sammensatte at fylde og helt dække cochlea i en 15 mm x 15 mm x 5 mm engangs indlejring skimmel. Orientere cochlea på sin side, således at det er parallelt med bunden af formen indlejring, som beskrevet af Whitlon al.. 14
- Umiddelbart Placer formen på tøris til at størkne OLT og opbevares ved-80 ° C natten over.
- Fordyb objektglas i 0,01% Poly-L lysin ved stuetemperatur i 30 min. Fjern dias, ikke skylles, og Tillad at tørre natten over. Bruge disse dias til snit frosset organmateriale.
- Fjerne cochlea i OLT fra-80 ° C fryser og anbringes på tøris. Ved hjælp af en skarp mikrotomen klinge (L x W: 80 mm x 8 mm, tykkelse 0,25 mm, skæring vinkel på 34 °), afsnit OCT blokke på 10 µm ved hjælp af en kryostaten ved-30 ° C. Placer to sektioner pr. slide.
- Køleskab dias ved 4 ° C, når du er færdig.
5. Immunohistokemi
- Placer dias i et glas objektglas farvning parabol på et dias rack. Fyld fadet med 350 mL 1 x PBS og vaske dias i 5 min. tre gange ved stuetemperatur.
- Fjern dias fra fadet og tør af området omkring væv ved hjælp af en tør tørre, Sørg for ikke at tørre ud i vævet.
- Ved hjælp af en flydende blokerende pen, tegne en cirkel omkring afsnittet væv.
- Blokere væv i 1 time ved stuetemperatur ved at tilføje 150 µL blokerende opløsning indeholdende 10% normal (donkey) serum, 1% nonionisk detergent, og 1% BSA i 1 x PBS.
- Tryk på off overskydende blokerende løsning og inkuberes væv natten over ved 4 ° C i en fugtig kammer med 150 µL af 10% normal (donkey) serum, 0,1% nonionisk detergent og primære antistof (Se Note nedenfor) i 1 x PBS.
Bemærk: For de følgende antistoffer, disse fortyndinger blev brugt: til figur 2 og 3, p-STAT1 Ser727 1: 300. Figur 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 og TRPV1 1: 100. - Objektglassene i glas objektglas farvning parabol på et dias rack. Fyld fadet med 350 mL 1 x PBS og vaske dias i 5 min. tre gange ved stuetemperatur.
- Inkuber med de sekundære antistoffer fortyndet i en oploesning indeholdende 0,01% nonionisk detergent og 10% normal (donkey) serum i 1 x PBS i 2 til 3 timer ved stuetemperatur i en fugtig kammer i mørke.
Bemærk: For de følgende sekundære antistoffer, disse fortyndinger blev brugt: til figur 2 og 3, æsel anti-kanin IgG 1:600. Figur 4, rodamin (TRITC) æslet anti-kanin IgG 1: 500 og æsel anti-ged IgG 1: 500. - Objektglassene i glas objektglas farvning parabol på et dias rack. Fyld fadet med 350 mL 1 x PBS og vaske dias i 5 min. tre gange ved stuetemperatur.
- Tryk på overskydende væske væk fra diaset, og tørre dias med en tør tørre omkring væv. Montere dias ved at tilføje en dråbe af montering agent med DAPI direkte på vævet. Langsomt placere coverslip på toppen, at sikre, at ingen bobler der dannes nedenunder, og tillade dias til helbrede natten over ved stuetemperatur i mørke. Butik dias ved 4 ° C.
- Billede dias ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Bruge lasere til imaging som følger: UV laser for DAPI, 488 nm laser til æsel anti-kanin IgG og 543 nm laser til rodamin TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR svar målt i rotter på tre dage følgende cisplatin administration viste en betydelig udvidelse i tærskler. Elevation af disse tærskler blev reduceret betydeligt i rotter administreres med trans-tympaniske [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosin en1 receptor agonist15, før cisplatin. Specificiteten af handlingen af Rasmussen-PIA på adenosin en1 receptor blev påvist med den observation, at det var modvirkes af 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), en A1 receptor-specifik antagonist16. Dette stof forstærkede cisplatin-induceret ABR tærskel Skift (fig. 1A). Svarende til dens effekt producere høretab, cisplatin også øget tab/skader til ydre hårceller (vurderet af scanning elektronmikroskopi [SEM]) (figur 1B). SEM billeder blev fremstillet som tidligere beskrevet17. Denne effekt blev betydeligt reduceret af trans-tympaniske administration af Rasmussen-PIA (figur 1C). Derudover viser vi det trans-tympaniske Rasmussen-PIA reducerer basal og cisplatin-induceret p-STAT1 immunoreactivity i cochlea, hvilket afspejler den anti-inflammatoriske ejendom af dette stof (figur 2).
Den trans-tympaniske rute kan også bruges til at administrere biologics såsom siRNAs, som resultere i gavnlige virkninger. Trans-tympaniske administration af STAT1 siRNA til rotter effektivt reduceret STAT1 og p-STAT1 niveauer og blokeret aktivering af denne transskription faktor af cisplatin (figur 3).
Flere undersøgelser viser, at trans-tympaniske administration af en anden siRNA for NOX3 mRNA reduceret evne til lægemidler såsom capsaicin til at øge nogle downstream mæglere, såsom forbigående receptor potentielle vanilloid 1 (TRPV1) channel og p-STAT1 ( Figur 4). Disse mæglere er impliceret i capsaicin-induceret hearing tab18.
Figur 1: Trans-tympaniske Administration af R-PIA reduceret Cisplatin-induceret høretab og beskyttet mod tab af ydre hårceller. A. ABR tærskler blev målt i rotter før og 72 h efter behandle dem med cisplatin (11 mg/kg, i.p.) efter trans-tympaniske administration af Rasmussen-PIA eller DPCPX + R-PIA. Cisplatin-induceret elevation af ABR tærskel viste sig at være svækket af A1AR agonist, Rasmussen-PIA. Co administration af A1AR antagonist, DPCPX, omvendt effekt af R-PIA på ABR tærskel og betydeligt forhøjet ABR skifter produceret af cisplatin på alle frekvenser testet. Pilen angiver nul ABR tærskel Skift. B. Cisplatin behandling viste betydelige skader på de ydre hårceller (OHC) (hvid pil) som det fremgår af scanning elektronmikroskopi (SEM). Rasmussen-PIA beskyttet OHCs mod cisplatin-induceret skade, mens DPCPX svækkede den beskyttende effekt af R-PIA. C. søjlediagrammet viser den kvantitative analyse af SEM-billeder, der vises i B. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien. Stjerner (*) og (*) angiver en statistisk signifikant forskel fra køretøjet eller cisplatin behandlingsgrupper, henholdsvis, mens (*) angiver en statistisk signifikant forskel fra Rasmussen-PIA + cisplatin-behandlede rotter (p < 0,05, n = 5). Dette tal blev tilpasset fra Kaur et al. 19 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Trans-tympaniske Administration af en1AR Agonist, Rasmussen-PIA, reduceret Cisplatin-øget p-STAT1 Immunoreactivity i Cochlea. Rotter blev administreret en intraperitoneal dosis af cisplatin (11 mg/kg), som øger p-STAT1 Ser727 immunoreactivity, vurderet på 72 h post drug administration. Dog 1 h forbehandling med trans-tympaniske Rasmussen-PIA afrundede denne stigning i p-STAT1 immunoreactivity. Fælles behandling af A1AR antagonist, DPCPX, sammen med agonist vendt hæmning af p-STAT1 immunoreactivity. Blå farvning repræsenterer DAPI-farvede kerner, mens grøn farvning repræsenterer p-STAT1 immunolabeling. OHC og DC repræsenterer ydre hår celle og Deiters celle, henholdsvis. Hvide pile angiver de tre rækker af OHCs. Skalalinjen vist i nederste venstre panel er 10 µm. Dette tal blev tilpasset fra Kaur et al. 19 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Trans-tympaniske Administration af STAT1 siRNA blokeret Cisplatin-induceret p-STAT1 niveauer. Cochlear sektioner isoleret fra rotter administreres med cisplatin (11 mg/kg, i.p.) for 72 h viste øget Ser727 p-STAT1 immunoreactivity i OHCs. Forbehandling med trans-tympaniske STAT1 siRNA (0,9 mg) svækket cisplatin-induceret stigning i p-STAT1 immunoreactivity, hvorimod scrambled behandling viste ingen effekt. Blå farvning repræsenterer DAPI-farvede kerner, mens grøn farvning repræsenterer p-STAT1 immunolabeling. Hvide pile angiver de tre rækker af OHCs. Skalalinjen vist i nederste højre panel måler 10 µm. Dette tal blev tilpasset fra Kaur et al. 20 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Trans-tympaniske injektion af NOX3 siRNA reducerer TRPV1 og p-STAT1 niveauer i rotte Cochlea. Bedøvede rotter blev administreret scrambled siRNA (scramble) eller NOX3 siRNAs af de trans-tympaniske injektioner, der blev fulgt to dage senere af trans-tympaniske injektioner med capsaicin for 24 h. isolerede cochleae fra disse dyr var farvet for p-STAT1 Ser727 og TRPV1 immunoreactivity. Capsaicin steg både TRPV1 (grøn) og p-STAT1 Ser727 (rød) immunoreactivity på 24 h i stria vascularis (SVA), ydre hårceller (OHC) og spiral ganglion (SG) celler. Dyr forbehandlet med NOX3 siRNA viste dog ikke nogen synlig induktion af p-STAT1 Ser727 og TRPV1 immunolabeling. Skala barer (nederste højre panel) repræsenterer 50 og 10 µm for mellemværker. Dette tal blev tilpasset fra Mukherjea et al. 18 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ruten trans-tympaniske administration tillader lokaliserede leveringen af narkotika og andre agenter til cochlea, der ellers kunne producere betydelige systemiske bivirkninger hvis administreres systemisk. Denne metode af drug administration giver mulighed for hurtig adgang til lægemidler til stedet, handling ved betydeligt højere doser, end der ville opnås gennem den systemiske rute. Resultaterne præsenteres her og offentliggjort tidligere viste at trans-tympaniske administration af [R] - N - phenyl isopropyl adenosin (R-PIA) beskyttet øresneglen fra cisplatin-induceret ydre hår celle tab (figur 1)19 og induktion af betændelse som det fremgår af formindsket aktivering af STAT1 transskription faktor (sammenlignet med dem i behandling med cisplatin eller Rasmussen-PIA + DPCPX + cisplatin) (figur 2)19. Disse fordele kunne bidrage til at beskytte fra høretab af dette stof. Baseret på tidligere erfaringer, hævder vi kun én drug administration er nødvendig. Dette kunne tyde på at stoffet er bevaret i mellemøret og kunne langsomt tages i cochlea at yde beskyttelse i de tre dage disse dyr er vurderet til ototoksicitet. Denne teknik bruges i øjeblikket til at levere andre stoffer i det indre øre til at bestemme deres effektivitet som oto-protectants.
Ud over medicin, kan trans-tympaniske administration af siRNAs tilbyde effektiv knockdown af selektiv RNA'er at reducere deres protein niveauer og give oto-beskyttelse18,20. Igen, disse siRNAs ville give mindre toksiciteter, hvis de leveres i nærhed af øresneglen. Varigheden af knockdown var op til tre dage (grænsen for vores vurderingsperioden). Vigtigere, blokerer tilsætning af siRNAs induktion af deres tilsvarende protein af ototoksiske narkotika, såsom cisplatin. Varigheden af knockdown er noget overraskende givet overfloden af nukleaser i ekstracellulærvæsken og i celler og den potentielle vanskeligheder med at få disse molekyler til cochlear celler. Dog ville demonstration af begge knockdown af proteiner og oto-beskyttelse betyde, at disse siRNAs er ved at nå cochlea på effektiv koncentrationer.
På trods af de fordele, der er beskrevet ovenfor, ventes visse begrænsninger af denne teknik. Disse omfatter behovet for bedøve forsøgsdyr før igangsættelse af proceduren. Narkotika skal administreres i højere koncentrationer i mellemøret, da kun en lille brøkdel (~ 1-10%) forventes for at nå perilymph. Fordeling af anvendte stoffer eller biologicals er derudover mere koncentreret på den base, hvor de største virkninger observeres.
Mens trans-tympaniske levering af agenter præsenteres her var begrænset til rotter, kunne en lignende metode til medicinafgivelse anvendes profylaktisk hos patienter, der venter kemoterapi med stoffer som cisplatin. Det forventes, at denne metode af medicinafgivelse kunne vedtages hurtigt for mennesker til at screene et stort antal forbindelser, som har vist effekt i behandling af narkotika-induceret høretab i forsøgsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nogen interessekonflikt erklæret.
Acknowledgments
Det arbejde, der er beskrevet i denne artikel blev støttet af en NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 og RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J.
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
