Summary
丸い窓の膜を介してヒト以外の霊長類コモンマーモ (用いた) の内耳に薬を管理する手術法を報告する.
Abstract
研究を聞いて長いによって促進されています齧歯動物モデルがいくつかの疾患では、ことはできませんですが、人間の症状が締めくくっています。コモンマーモ (用いた) が小さい、ハンドル簡単新しい世界猿と齧歯動物の比較よりも中耳の耳小骨連鎖と人間、内耳を含む頭骨のような解剖学を持っています。ここでは、一般的なマーモセットの内耳への薬物送達の蝸牛の丸い窓のニッチに再現可能な安全かつ合理的な手術アプローチを報告する.後部鼓膜、鼓膜伝導性の聴力損失を引き起こす可能性のある操作を避けるために人間の外科で臨床的に使用されるプロシージャを採用しました。この手術は、任意の重要な聴力損失には至らなかった。外側半規管、顔面神経の垂直部分を慎重に検討する必要がありますが、このアプローチは共通マーモセットの大きな嚢胞構造のために可能だった。この手術方法では、前臨床トランスレーショナルリサーチの概念実証を得ることに非常に重要なは、聴覚の損失、薬剤の安全で正確な管理を実行することが出来ます。
Introduction
難聴 (SNHL) は、損傷や、蝸牛の欠乏から主に発生します。SNHL の一般的な原因は、高齢化 (例えば老人性難聴)、遺伝的欠陥、耳毒性薬物1感染症、騒音への暴露。世界保健機関 (WHO) は、以上 3 億 6000 万人、世界の人口の 5.3% を表すが損失2を聞いて苦しむ推定されます。1 で 2,500 新生児に 900 の 1 が中等度、重度と先天性重度の永続的な難聴、および 65 歳以上の約 3 つの大人はある程度聴力損失3とも推定されます。ただし、これらの患者の難聴の効果的な治療はありません。
聴覚研究はネズミやモルモット モデルを使用して実行されて長いが、難聴の新しい治療法として遺伝子治療や再生療法などさまざまな方法が提案されています。しかし、人間および齧歯動物聴覚システムの面で大きな差がある、人間のアプリケーションに動物モデルを変換する非常に困難であります。コモンマーモ (C. 用いた)、アマゾンから発信された新しい世界猿いくつかの理由のための様々 な基礎調査研究魅力的な非ひと霊長類モデルとなっています。まず、その解剖学と生理学よりこれらの齧歯動物ではなく人間に似ています。第二に、基本的な生物学的疾患、神経回路網、動作、およびゲノムを含むこの種についてはよく特徴付けられます。聴覚とボーカルの処理、周期、ピッチの表現、コモンマーモ セットの聴覚音声相互作用の皮質コーディングもされている報告4,5,6,7,8,9,10. 最近の組織学的研究で研究者 20 の難聴遺伝子と共通のマーモセットの蝸牛における陰イオン交換器の特徴的な発現パターンを識別・発見 5 進行性難聴と 3 つの原因である遺伝子陰イオン交換器、齧歯動物11,12の異なる発現パターンを持っていた。これらのプロファイルは、共通のマーモセットが聴覚研究の強力なツールであることを信じる私たちを導きます。
実験動物としてコモンマーモの最も顕著な属性は次のとおりです。
- 小さなボディサイズと簡単に処理に比べていくつかの種の古い世界のサル: アダルト マーモセット 300 から 400 グラムの重量を量る、ラットに似ている、高さ約 60 cm。
- 高度生殖霊長類: マーモセット 18 ヶ月の頃に性的に成熟を達成してクマの年 2 回、毎年 4 に 6 の子孫を生産することができます。
- 遺伝の修正が利用可能な: 佐々木 Eらは、トランスジェニック13とノックアウト14霊長類のマーモセットを用いた神経疾患 (例えばパーキンソンに関与する遺伝の修正の作成に成功病やアルツハイマー病)。
- 胚性幹 (ES) 細胞と多能性幹 (iPS) 細胞の両方は、確立された15,16をされています。むしろげっ歯類に比べてするマーモセットの同じ番号を維持することは困難であるが、幹細胞や iPS 細胞の可用性は、生体内のアッセイに必要な数を削減するの in vitroアッセイを提供します。
難聴とその潜在的な療法の分野でより良い橋渡し研究を容易にするために、CT と MRI、全身麻酔と聴性脳幹反応 (Abr) を使用して聴力検査を用いたイメージングの研究プロトコルを設立しました。これらの実験システムが齧歯動物の研究と臨床試験の間のギャップを埋めるために不可欠な概念研究前臨床証拠を取得するより多くの機会を提供します。ここでは、丸い窓の膜をコモンマーモの内耳に薬を管理する手術法を報告します。伝導性の聴力損失を引き起こす可能性があります鼓膜を操作することがなく丸い窓周りの明確なビューを取得するには、便利ですアプローチに乳様突起の空洞から。臨床的に、このアプローチに呼ばれます「後部鼓膜」の確立し、蝸牛注入と真珠手術に用い。その後鼓膜聴力損失を引き起こすことがなく薬の正確な管理を実行することができます考えています。
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Protocol
すべての実験手順は、東京慈恵会医科大学、東京都で行われました。機関動物ケアおよび使用委員会東京慈恵会医科大学の動物取り扱いと実験プロシージャを承認 (承認なし: 26-060)、慈恵で実験動物の使用のための機関のガイドラインに沿って行われ、大学: 日本学術会議 (2006 年) で動物実験の適切な実施のためのガイドラインに同意します。ケアと実験動物の使用 (資源研究所の実験動物、1996) のガイドの推奨事項に従って動物のケアを行った。
1. 術前検査
- 少なくとも 1 ヶ月個々 の解剖学的構造の識別を容易にするため手術の前に動物 (コモンマーモ セット) の頭蓋の計算された断層レントゲン写真撮影 (CT) スキャンを取る。
- 聴力検査手術の前に、少なくとも 1 ヶ月を実行します。
注: ここでは、聴覚の状態を評価するために、ABR を使用しました。簡単に言えば、肯定的な電極は、頂点と刺激耳背下部参照否定的な電極で皮下置かれました。接地電極は首の背の部分に皮下配置されました。17,18 Abr をトーン バーストと誘発した (1.0 ms トーン バースト 0.1 ms の上昇と持続時間と立下り時間)。音圧レベルは最大振幅から 10 dB ステップで、減った。各音のレベルで 512 応答を (交互刺激の極性) を平均しました。ABR 閾値はであらゆる波を検出できる最小の音圧レベル (SPL) として定義されました。
2. 麻酔
- 全身麻酔下で手術前に、の晩から高速の動物。
- 顔にマスク換気または低速誘導 (図 1 a) の誘導の商工会議所で 4% イソフルランと 5-6 mL/分で周囲の空気を管理します。動物はつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に応答しないことを確認します。
- Anesthestize コモンマーモ セット メデトミジン 0.04 mg/kg, ミダゾラム (0.4 mg/kg)、およびブトルファノール (0.4 mg/kg) の組み合わせ (大腿筋) に筋肉注射をします。
- アンピシリン (0.08 mg/g) を皮下注入術前抗生物質として皮膚切開前 30 分以上。
- 上部で、その頭を仰臥位でマーモセットを置き、頭と首を拡張します。ナイロン糸をテーブルに上顎を修復良いビューを取得する舌を引くか、喉頭鏡を使用して、また、喉頭蓋、喉頭のエントリを視覚化 (図 1 b)。
- 喉頭蓋は喉頭の表面に沿って気管内チューブを挿入します。
注: 16 ゲージの静脈のカテーテルを使用することがまたは 6 フランス語ゲージ栄養チューブの気管内チューブ (図 1)。 - 気管に配置されて正しくいることを確認するために気管内チューブから EtCO2を確認してください。チューブが配置されている呼吸ガスの動きをチェックした後、テープでマーモセットの顔に気管内チューブを固定します。
- 操作中に 1-3% イソフルランの麻酔を維持します。
- 操作中に SpO2EtCO2体温、直腸の温度を監視します。体温の低下を防ぐために暖房のマットですべての手順を実行します。
3. 術前準備
- 仰臥位でセットを準備し、頭を非手術側 (図 2 a) に 30-45 度の角度に傾斜します。
- 手術側の後耳介領域を剃る。
- アルコール、ポビドン ヨード、後耳介や外耳道の両方の外科的領域を消毒します。
- マーモセット (図 2 b) に円形孔を有する手術用覆布シートを配置します。
4. 手術
- 1% 塩酸リドカインを注入 (1: 100,000 エピネフリン 0.1 から 0.2 で mL) 皮下に皮膚切開部位。第 15 円形の刃を持つ、耳介後部の皮膚切開を行います。
- 止血、1:5,000 希釈エピネフリンに浸したガーゼを使用して出血領域に圧力を適用します。バイポーラ熱傷も効果的です (図 2)。
- だからその耳介軟骨 (c) の後耳介領域の軟部組織に開くし、後耳介筋 (m) を認識することができます。外耳道骨軟骨 (図 3 a) の奥深くに表示すべきを公開します。
- 鼓膜の深さを確認するため後方の外耳道の最深部で骨と皮の付着として認識されることができます鼓膜の縁の骨の一部を公開します。
注: この手順は、どのように深い中耳腔の外側の部分である (図 3 a) を認識することが出来ます。 - 側頭骨から分離、尾の側面に向かって後耳介筋 (胸鎖乳突筋、頭板状筋、顎二腹筋の後部の腹) の皮をむきます。側頭骨 (図 3Bのアスタリスク) の外側表面は、公開します。
- 1.0 mm ダイヤモンド bur. (図 3) と外耳道の後ろに約 5 mm の穴を作る。掘削サイトに応じてドリル回転数 1,000-8,000 rpm を使用します。
注: 低速の半規管や顔面神経の近くの繊細な操作に適しています。掘削サイト熱損傷を防止するために適切に生理食塩水を点滴します。 - ドリルで穴を拡大し、水平半規管 (HSC) では、(図 3 D) の乳様突起の空洞に向かって隆起の位置を確認します。
- 垂直部分実行 HSC の前方顔面神経の位置を確認します。ドリルし、顔面神経と鼓索神経との間の三角形の面積の中心に位置している顔の凹部の明確なビューを取得する、存在する場合、すべての骨の隔壁を削除します。
- 顔面神経と、鼓膜の垂直部分の間にドリルで小さな穴を作り 1,000 rpm で 0.6 mm 径ダイヤモンド バールとリム (図 4 aのアスタリスク)。
- 薄くなった骨をピンクの線と見ることができる顔面神経を損傷しないように後部運河の壁と平行、バールに移動します。神経は白い線構造 (図 4 b) として公開する直前に、掘削を停止します。
- 丸い窓のニッチが穴 (図 4) を視覚化できることを確認します。その後、25 ゲージまたは細い針でニッチに薬を管理します。丸い窓のニッチ市場で薬を保持するためにニッチ (図 4) 粘性ソリューションを配置します。
- その止血がしっかりと確認した後 6-0 吸収スレッドを使用して簡単な縫合と層 (表皮層と真皮層) を閉じる制御します。
- 手術の傷口にガーゼを修正し、包帯を貼る。
5. 術後のケア
- メデトミジンを敵に回した大腿筋に筋肉内塩酸アチパメゾール (0.15 mg/kg) を管理します。
- 自発呼吸の開始、気管内チューブを削除します。
- 30% O2覚醒を完了するために麻酔が切れるまで 29 度を記録、集中治療室における共通のセットを維持します。
- 眼振など前庭機能障害を示唆する所見がないことを確認し、飼育ケージに動物を返します。
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Representative Results
手術部位感染、血管の損傷や中耳の操作で発生する前庭障害と出血など合併症なく後部鼓膜を行った。7 歳コモンマーモの右の耳の後部の鼓膜を行い丸い窓のニッチに 1 μ L のリン酸緩衝生理食塩水を投与します。Abr は、前に、(図 5A B) 術後後 2 ヶ月を測定しました。波形と Abr のしきい値が以前研究17,18に匹敵して手術 (図 5C) 前後にこれらのパラメーターに変化はないです。したがって、我々 はその後の鼓膜は共通のマーモセットの丸い窓のニッチに薬の管理のための安全で有用なプロシージャを締結しました。
図 1: 気管挿管します。(A) 4% イソフルランと 5-6 mL/分顔にマスク換気で外気コモンマーモを麻酔します。また、誘導室に共通のマーモセットを配置します。(B)は上部で、その頭を仰臥位で共通のマーモセットを置き頭と首を拡張します。テーブルにナイロン糸で上顎を固定、喉頭蓋 (矢印) と喉頭のエントリを視覚化する舌引き上げます。(C)は、喉頭蓋喉頭表面に沿って気管内チューブを挿入します。16 g 静脈内カテーテルやチューブ 6 フランス語ゲージは、気管内チューブとして使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 皮膚切開します。(A) 仰臥位で共通のマーモセットを配置し、頭を非手術側に 30-45 度の角度に傾斜します。操作側の後耳介領域を剃るし、ポビドン ヨードで消毒します。Cr、Ca、頭蓋側尾側では、L、R、左側右側。(B)黒線は皮膚の切開線を示します。皮膚切開の前に 1% 塩酸リドカインを注入 (1: 100,000 エピネフリン 0.1 から 0.2 で mL) 皮下。(C)カットは、耳介軟骨 (c) を昇格するまでに皮下組織を開きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 乳様突起の空洞に穴あけ。(A)軟部組織を除去した後、後耳介筋は表示されます。m、後耳介筋、c、耳介の軟骨。(B)頭骨表面 (アスタリスク) は、後耳介筋、尾の側面に向かって骨から剥離するときに公開されます。Pneumatized の構造は、側頭骨を簡単に認識できます。(C)穴は、1.0 mm ダイヤモンド バール外耳道の骨の後ろに約 5 mm の掘削によって作られました。(D)共通のマーモセットの乳様突起の空洞はほとんど単一キャビティので構成されます。ドリルの穴を拡大して、乳様突起の空洞に向かって水平半規管 (HSC と点線) バルジを簡単に認識できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 後部の鼓膜。(A)顔面神経 (FN) 顔射管と呼ばれる骨の通路を通過し、外耳道骨 (PAC) の後壁と水平半規管 (HSC) の間で実行します。神経の前歯は顔の凹部 (アスタリスク) です。(B)は、0.6 mm 径ダイヤモンド バーと顔の凹部をドリルで穴を作る。(C)穴を拡大して丸い窓のニッチ (RWN) が表示されます。(D)顔の凹部の穴は、を介してだ 25 ゲージまたは薄く針 RWN (矢印) にソリューションを管理することが可能。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 聴性脳幹反応 (ABR) 評価します。7 歳のコモンマーモ後部鼓膜を行ったし、丸い窓のニッチに 1 μ L のリン酸緩衝生理食塩水を投与します。Abr は、外科の前後に測定した、代表的な波形がそれぞれ(A)と(B)に示すように。波形とトーン バーストで六つの周波数を誘発、Abr のしきい値は、以前研究17,18に匹敵しました。(C)手術後 ABR 閾値から前に変更はないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
蝸牛の血流の量が非常に小さい 1/1,000,000 人間の総心臓出力の順番になっていると推定される、一般的な循環19 から内耳を隔てる血蝸牛バリアの存在によってアクセスを制限 ,20。これらの理由から、薬物や内耳へのウイルスのベクトルの管理は直接管理ではなく、全身投与ではなく、良好です。マウス、モルモット実験で様々 なアプローチが報告されているトランス後耳介による丸窓や腹側アプローチ、cochleostomy、内リンパ嚢配信、および半規管に近づく21, 22,23,24,25,26。
本研究では橋渡し研究の潜在的な方法として後部の鼓膜と丸い窓管理を使いました。後部鼓膜は臨床外科プロシージャの確立されたアプローチ、コモンマーモ セットに適した tympanic キャビティの解剖学的特性、人間のそれに似ているので、そのルートに乳様突起が大規模な主で構成されます。非常に薄い骨の隔壁を有する単一キャビティは。確かに、一般的なセットの任意の合併症や難聴のない後部鼓膜プロシージャのすべてを行った。後部鼓膜を実行すると、薬剤管理は半規管、顔面神経、アブミ骨などの重要な組織を中心に明確なビューの下で実行することができ、ウィンドウのニッチのラウンドします。注記のうち、蝸牛、HSC、後半規管、この単一のアプローチと丸い窓のニッチの基底回転を介してソリューションを管理できます。丸い窓管理と低侵襲のマウスを用いた研究によると、cochleostomy27よりも蝸牛外リンパのより均一なソリューション展開を提供します。また、半規管の遺伝子導入によるアデノ ウイルスの直噴が26前庭器官で主に遺伝子の伝達を示したことが報告されています。内リンパ嚢の配信は、endlymphatic スペースに直接噴射を提供し、前庭エンドの臓器と蝸牛25に達したウイルスのベクトルとして報告されます。ただし効率についての情報は不十分なようです。
安全な操作を実行するには、は、解剖学的な情報が不可欠です。中耳の鼓と内耳の基本的な解剖学的性格、人間と霊長類の社会性と比較すると似ています。中耳腔と乳様突起の空洞、小骨の位置と顔面神経と鼓索神経の位置間の接合などの操作を実行する重要な解剖学的な部分は、完全に人間に似ています。ただし、いくつかの違いがあります。人間の乳様突起の空洞が多くの空気電池で構成されています、我々 は内耳にアプローチするこれらの細胞をドリルする必要があります。臨床外科手術で「中耳」いいますと時間もかかりますし元形態を破壊します。その一方で、共通のマーモセット乳様突起空洞が非常に薄い骨の隔壁を有するほぼ単一キャビティと半規管が大きく、人体の解剖学と比較して乳様突起の空洞にアーチを。これらの違いは、内耳薬物投与のために有利です。内リンパに直接薬を管理している場合、小さなウィンドウをする HSC では、以前に他の種の26の報告で半規管アプローチが不可能です。この実験では、このアプローチは実行されませんでしたが、共通のマーモセットの HSC はそのサイズと簡単な感度のため簡単に実行できます。ただし、アプローチを採用する前にリンパ漏は、聴覚障害を引き起こすことができる、リスクが考慮されなければなりません。我々 は半規管のアプローチは術後後聴力レベルを評価するための理想的な実験システムではないと仮定します。一般に、リンパ液漏出を防ぐためには、脂肪組織とフィブリングルー ウィンドウを梱包するは、効果的です。
この場合、私たちは低侵襲の操作に重点を置いたし、穿刺しない丸い窓膜ソリューションを配置しました。ただし、外リンパに薬やウイルスのベクトルのための十分な線量を提供する効果的に単回投与しません。この問題の簡単な解決策は、丸い窓の膜に穴をあけるし、溶液に直接注入することです。前述のように、ただし、可能性がありますこれは臨床の現場に適用することは困難になりますので、聴力損失、人間の患者の前庭機能不全を引き起こすにおそらくリンパ液漏出は、内側の耳穴を作るします。また、齧歯動物とは異なりマーモセットはもともと木に住んでいたし、前庭機能障害は重大な合併症もありますので飼育ケージで立体的に移動します。したがって、今後、それに丸い窓の膜を貫通することがなく薬物の拡散の効率を改善するために重要ななります。1 つの可能性は、浸透圧ポンプと持続的な準備に使用しています。浸透圧ポンプは、カテーテルの先端には丸い窓膜落ち着きましたを介して継続的な管理を提供します。現時点では、ploxamer407 とゼラチンのゲルは、丸い窓膜ドラッグデリバリーのための持続的な準備として使えます。これらのデバイスと通信事業者は、臨床試験28,29,30,31で既に使用されています。
一言で言えば、この手術方法では橋渡し研究のための概念の前臨床証拠を得ることに非常に重要なは、霊長類の内耳の聴力損失なしに薬の安全で正確な管理を実行する私たちをことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
仕事は日本政府文部科学省科研費 (24592560, 15 H 04991、15 K 15624) から m. f. と m. f. に武田科学財団、東京慈恵会医科大学戦略的な優先順位付け研究基金 H.J.O. の補助金によってサポートされて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| common marmoset | CLEA Japan | EDM:C.Marmoset(Jic) | |
| isoflurane | Phizer | ||
| medetomidine | ZENOAQ | ||
| midazolam | astellas | ||
| butorphanol | Meiji Seika | ||
| ampicillin | Meiji Seika | ||
| lidocaine hydrochloride | AstraZeneca | ||
| 6-0 absorbent thread | ETHICON | RD-1 | |
| atipamezole hydrochloride | ZENOAQ | ||
| phosphate buffered saline | Wako | 045-29795 | |
| Surge Wave | Morita | TR-900-OR | |
| Diamond Bar 006 | Morita | 14070057 | |
| Diamond Bar 010 | Morita | 14070081 | |
| intensive care unit | Menix | P-100 |
References
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