Summary
Цель этого исследования заключалась в оценке в vitro Гиполипидемические эффекты наркотиков в модуляции морфологией частиц холестерина. Сравнение гиполипидемические препараты выявили различия в их эффект в модуляции морфологических особенностей холестерина частиц.
Abstract
Лечение больных дислипидемия гиполипидемические препараты приводит к значительному снижению уровня липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и низкого до умеренного уровня увеличение липопротеидов высокой плотности (HDL) холестерина в плазме крови. Однако плохо понимается возможная роль этих препаратов в изменяя морфологию и распределение частиц холестерина. Здесь мы описываем в vitro оценки Гиполипидемические эффекты наркотиков в модуляции морфологические особенности холестерина частиц с помощью метода массив налета в сочетании с imaging проточной цитометрии. Анализ изображения частиц холестерина указал, Ловастатин, СИМВАСТАТИН, Эзетимиб и аторвастатина вызвать образование шаровых и линейные нити образный частиц, в то время как ниацин, фибраты, флувастатин и Розувастатин побудить формирование только шарообразную форму частиц. Следующая, очень чистые должностей липопротеинов низкой плотности (ЛОНП) и частицы ЛПНП, инкубировали с этими препаратами показали изменения в морфологии и изображения текстуры холестерина частицы субпопуляции. Кроме того показ 50 образцов сыворотки показали наличие более высокого уровня линейной формы частиц холестерина HDL предметам с дислипидемии (среднее 18,3%), по сравнению с образцами возраст соответствует нормальной (среднее 11,1%). Мы также отметил, что значительные вариации в Гиполипидемические эффекты наркотиков на снижение линейной форме ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что гиполипидемические препараты, в дополнение к их клеточный Гиполипидемические эффекты, могут непосредственно модулировать морфологией частиц холестерина неферментативного механизмом действий. Итоги этих результатов имеют потенциал для информирования диагностика атеросклероза и предсказать оптимального липид понижая терапии.
Introduction
Многочисленные клинические исследования показали благотворное влияние гиполипидемические препараты в сокращении плазменные уровни холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и низкого до умеренного уровня повышения холестерина липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), который предотвращает первичных и вторичных случаев неблагоприятных сердечно-сосудистых событий, связанных с атеросклерозом1,2,3,4,5. Статины, Группа фермента HMG-CoA редуктазы, блокирует синтез эндогенных холестерина в печени, что в свою очередь приведет к снижению циркулирующие уровни холестерина ЛПНП в крови6,7. Аналогичным образом липидов, снижение эффекта ниацина при посредничестве его прямого и неконкурентных ингибирование диацилглицерол ацилтрансфераза гепатоцито-2, ключевых печеночных ферментов, участвующих в синтезе триглицеридов8. Сравнительно Эзетимиб снижает плазменный уровень ЛПНП, ограничивая всасывание холестерина экзогенные путем связывания белка Нимана-пика C1-Like 1 (NPC1L1), расположенный в эпителиальные клетки тонкой кишки9. Фенофибрат, другой препарат для снижения уровня липидов, существенно снижает плазменные концентрации триглицеридов и также умеренно снижается LDL холестерина через Пероксисома рецепторов, активируемых иным путь10. Кроме того Омега-3 жирных кислот, как сообщается, имеют анти атеросклеротической эффект из-за его способность снижать плазменного уровня ЛПНП11.
Гиполипидемические препараты, в дополнение к их основной эффект на снижение ЛПНП, имеют целый ряд полезных плейотропный эффектов, включая повышение уровня ЛПВП, улучшение функции эндотелия сосудов, уменьшая воспаление и ингибирующих тромбоцитов Агрегаты в12,,1314. Однако основной механизм этих препаратов в повышение ЛПВП холестерина частиц и изменяя их структурных особенностей полностью не поняты. Поскольку эти лекарства широко применяются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с атеросклерозом (ССЗ), крайне важно для дальнейшего расследования их возможной роли в определении морфологические особенности и распределения липидных частиц. Человеческой плазмы lipidome состоит из около 600 различных липиды и 22 различных молекулярных видов ЛПОНП, которые присутствуют в различных размеров, форм, плотности и композиции15,16,17 . Аналитические методы, такие как ультра центрифугирования, ЯМР и электрофорез геля градиента используются для характеристики частицы ЛПНП и ЛПВП и их подфракций18,19. Однако применение этих методов ограничивается исследования, направленные на определение влияние препаратов в модуляции морфологии и Ассамблеи липидных частиц. Потока цитометр основе доска массив является функциональной Биохимические пробы разработан для обнаружения и визуализации сыворотки производных липидов и амилоид частицы зубного налета20. Преимущества в vitro imaging метода, описанного в настоящем исследовании включить выявление липидов модулирующих наркотиков эффекты в изменяя морфологию и распределение частиц холестерина в образцах буфер и сыворотки.
Protocol
1. Подготовка флуоресцентный-меченых холестерина и гиполипидемические препараты
Примечание: люминесцентные меченых холестерина агрегатов и статинов были подготовлены как описано в нашей предыдущей статье 21. Пожалуйста, смотрите Таблицу материалов для деталей реагентов, изображений проточный цитометр, анализаторы химии и программное обеспечение анализа данных, используемые в данном исследовании.
- Солюбилизировать последнего дневного меченых лиофилизированные холестерина (1 мг, Ex / Em = 495 нм/507 Нм) порошка в 1 мл 100% спирта.
- Центрифуга образца 3 мин в 2040 x g и использовать supernatants, содержащий водорастворимые флуоресцировани обозначенного холестерина агрегатов в массив assay металлической пластинкы.
- Для приготовления наркотиков, индивидуально солюбилизировать последнего порошков (2 мг) препарата СИМВАСТАТИН, Ловастатин, аторвастатин, Эзетимиб и Омега-3 жирные кислоты в 1 мл 100% спирта.
- После центрифугирования 3 мин в 2040 x g, используйте supernatants, содержащих наркотики в assay.
- Аналогично, солюбилизировать последнего индивидуально порошков (2 мг), флувастатин, Розувастатин, ниацин, фибратов в деионизованной воды, чтобы сделать Стоковый раствор 2 мг/мл 1 мл и.
- После центрифугирования 3 мин в 2040 x g, используйте supernatants, содержащих наркотики в массив assay металлической пластинкы.
2. Assay металлической пластинкы массив для изучения In Vitro холестерина частицы формирования
- использования химии анализатор-1 (см. таблицу материалы), чтобы настроить массив assay металлической пластинкы для формирования частицы холестерина. Выполнение анализа в круглым дном, низкое содержание белка привязки 96-луночных пластины с использованием реагентов, подготовленный в разделе 1. Поддерживать объем окончательной реакции в каждой скважине на 200 мкл и выполнять все анализы в трех экземплярах.
- Во-первых, нагрузки 194,5 мкл фосфата буфер солевой раствор (PBS) для каждой скважины.
- Каждый хорошо, добавить 2,5 мкл (5 мкг) каждого решения гиполипидемические наркотиков и поколебать пластину для 30 s, поместив его на плите анализатор-1 реакции химии равномерно смешать препарат в решение. Без наркотиков добавляется отрицательный контроль образцов.
- Наконец, добавить 2 мкл (2 мкг) люминесцентные меченых холестерина совокупного решения для каждой скважины и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на плите химии реакция анализатор-1.
- Инкубировать пластину на лаборатории шейкер 2 h 37 ° C и 200 об/мин.
- После инкубации, получить изображения частиц путем визуализации проточной цитометрии.
3. Захват изображения из холестерина частиц с помощью визуализации потока цитометрии
- Открыть шаблон сбора данных, чтобы загрузить правильный инструмент настройки. Щелкните " файл ", затем выберите " открыть шаблон … " и выберите файл шаблона.
- Нажмите " флеш, замок, нагрузка " подготовить документ для загрузки образца.
- Когда " загрузить образец " диалога окно, нажмите " ОК " для загрузки 50 мкл проб от каждой хорошо подготовлены в разделе 2 во изображений проточный цитометр. Нажмите
- " запустить | Установка " для просмотра частицы в области обработки изображений в режиме реального времени.
- Когда частицы в области обработки изображений находятся в хороших фокус, нажмите " запустить | Приобрести " получить изображения каждого объекта одновременно в духе высокой пропускной способности для темного поля (сторона разброс/SSC), светлые области (BF), зеленая Флуоресценция и желтый флуоресцирования.
- Повторите шаги 3,2-3,5 приобрести 5000-10 000 частиц от каждого образца.
- Анализ всех файлов raw изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений для определения интенсивности флуоресценции объекта и морфологические вариации.
- Нажмите " инструменты " кнопку в верхней части программного обеспечения для анализа изображений, а затем выберите " пакетных данных файлов " из раскрывающегося меню, которая будет открыта " пакетов " окно.
- В " пакетов " окно, нажмите " добавить пакет " кнопку, которая откроет " определить пакет " окно.
- В " определить пакет " окно, нажмите " добавить файлы " кнопку и выберите файлы raw изображений, нажмите кнопку " шаблон " кнопку и выберите файл шаблона анализа соответствующих данных, а затем выберите " ОК " и " отправить пакеты " чтобы начать обработку и анализ изображений raw файлов.
4. Доска массив Assay основанный оценки из гиполипидемические препараты влияние на очищенного холестерина частицы
- , как описано в шаге 2.1, выполняют пробирного формирования частицы холестерина, с использованием очищенного липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП липопротеинов/частиц. Выполните массив assay металлической пластинкы в плиту 96-луночных.
- Сначала загрузить все скважины с PBS; 200 мкл окончательный объем использования для каждой скважины.
- Для отрицательного контроля, добавить 4 мкг липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП, или HDL белков/частиц индивидуально в каждом хорошо без наркотиков и встряхнуть пластину для 30 s.
- Для изучения гиполипидемические наркотический эффект, добавить 4 мкг липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП, или HDL белков/частиц индивидуально к каждому хорошо и поколебать пластину для 30 s.
- Для скважин с 4 мкг липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП или HDL, добавить 2,5 мкл (5 мкг) Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН или Никотиновая кислота раствор и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его в химии анализатор-1.
- Наконец, добавить 2 мкл (2 мкг) флуоресцировани обозначенного холестерина совокупного решения для всех скважин и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на плите химии реакция анализатор-1.
- Инкубировать пластину для 2 h в шейкере лаборатории на 37 ° C и 200 rpm.
- Приобрести образцы с использованием изображений проточной цитометрии, следующие шаги 3.1-3.5.
- Анализ файлов raw изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано в шаге 3.7.
- В шаблоне анализа, используйте следующие стробирования схему для определения холестерина частицы субпопуляций.
- На участке количество пикселей зеленого канала насыщенных (ось x) и темное поле channel количество насыщенных пикселей (ось y), отклонить объекты с одним или более насыщенный пикселов в любом канале.
- Участок частицы объекты без насыщенных пикселей с использованием зеленого канала интенсивности (ось x) и ККК (ось y): объекты попадают в одну из трех регионов (липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП, ЛПВП) на основе их зеленый канал и интенсивности SSC.
Примечание: Эти ворота были созданы на основании данных, полученных от управления эксперименты, проведенные с использованием очищенного липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП частиц/белков без препарата.
- Для определения гиполипидемические наркотический эффект для каждого образца, вычислить общее липопротеинов концентрации частиц, а также процент каждого субпопуляция (липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП, ЛПВП) как описано в шаге 6.5.
- Calculate частиц концентрации (частиц/мл) с помощью следующего уравнения:
Примечание: липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП стробирования регионов в точка участок флуоресценции обнаружения ~ 80% от их соответствующих субпопуляций и оставшиеся ~ 20% частиц перекрываются с другими регионами стробирования.
- Calculate частиц концентрации (частиц/мл) с помощью следующего уравнения:
5. Измерение концентрации липидов в пробах сыворотки
- для определения концентрации ЛПНП, ЛПВП, холестерина и триглицеридов в химии анализатор-2, используйте образцы сыворотки, полученные от возраст соответствует нормальной и дислипидемия субъектов.
- Определять аномальные концентрации ЛПНП, ЛПВП, холестерина и триглицеридов, основанные на их концентрации, выявленные за пределами верхнего и нижнего контрольные значения в образцах сыворотки.
- Следовать нормальной ссылка значение реDED производителем реагентов: холестерин (4-200 мг/дл), HDL (3.0-65 мг/дл), ЛПНП (4-100 мг/дл) и триглицеридов (9-200 мг/дл).
- Определения образцов сыворотки, которые имеют ненормального значения как ниже значение ссылки ниже или выше выше ссылки соотношение холестерина и триглицеридов и использовать их для проверки на наличие и отсутствие гиполипидемические препараты.
6. Анализируя эффект препаратов на формирование частиц холестерина в образцах сыворотки
- использования химический анализатор-1 чтобы настроить массив assay металлической пластинкы для формирования частицы холестерина в образцах сыворотки. Выполните assay круглым дном, низкое содержание белка привязки 96-луночных пластины. Использовать окончательный реакции объем 200 мкл/Ну и выполнять все анализы в трех экземплярах.
- Подготовить пластину, загрузив реагентов на основе поэтапного.
- Подготовить управления Уэллс.
- Нагрузки 193 мкл PBS в каждой скважине.
- Добавить 2,5% (v/v) пациента сыворотки (только одна сыворотка образец за хорошо) и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на плите реакции анализатор химии.
- Добавить 2 мкл (2 мкг) флуоресцировани обозначенного холестерина объединить решения в каждой скважине и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на тарелку химии реакция анализатор-1.
- Подготовить лунки с препаратами.
- Нагрузки 191 мкл PBS в каждой скважине.
- Добавить 2,5% (v/v) пациента сыворотки (только одна сыворотка образец за хорошо) и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на тарелку химии реакция анализатор-1.
- Добавить 2 мкл Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН или Никотиновая кислота раствор (4 мкг) для всех скважин за исключением отрицательный контроль скважины. Добавить только одного препарата на колодец и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на тарелку химии реакция анализатор-1.
- Добавить 2 мкл флуоресцировани обозначенного холестерина объединить решение (2 мкг) в каждую лунку и встряхнуть пластину для 30 s, поместив его на плите химии реакция анализатор-1.
- Загрузить наркотики только после всех скважин (контроль и лечение наркотиков) были загружены с их соответствующих образцов и добавить в конце этого шага флуоресцировани обозначенного холестерина.
- Инкубировать пластину для 2 h в шейкере лаборатории на 37 ° C и 200 rpm.
- Получить образцы изображений проточный цитометр следующие параметры, описанные в шагах 3.1-3.6.
- Использовать изображение, анализ программного обеспечения для пакетной обработки всех файлов изображений, используя тот же шаблон, как описано в шагах 3.7.
- Анализ данных путем рисования ворота на участке, как описано в шагах 4.5 и 4.6.
- Для определения гиполипидемические наркотиков эффект/реакции (низкой, средней и высокой) для каждого образца, вычислить общее липопротеинов концентрации частиц, а также процент всего частицы в составе липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП субпопуляций.
- Участок липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП населения на гистограмму объекта ' s светлые области изображения, ширина вычитается из (длина - ширина) и ворота в шаровидные или линейной регионы: объекты с (длина - ширина) ≤ 2 мкм попадают в шаровидных области исчисления доли шаровых и линейной формы частиц.
- Сравнить процент шаровых и линейные формы ЛПНП и ЛПВП холестерина частиц для каждого образца сыворотки, инкубировали с и без каждого препарата. Среди трех экземплярах значения, полученные для каждого образца сыворотки, принять процент шаровых и линейной форме частицы ЛПНП и ЛПВП, которые попадают в диапазон ±2 SD для определения эффекта препарата.
Representative Results
Assay металлической пластинкы массива на основе анализа Гиполипидемические эффекты наркотиков на формирование частиц холестерина:
Для оценки эффекта статинов в модуляции морфологией частиц холестерина, флуоресцентный меченых холестерина агрегатов индивидуально инкубировали с Ловастатин, СИМВАСТАТИН, аторвастатин, Розувастатин и флувастатин в буфере. Все эти образцы были приобретены с помощью тепловизионных проточной цитометрии для захвата изображений холестерина частиц для анализа морфологии как показано на рисунке 1 и на рисунке 2. Интересно, что анализ наркотиков воздействие на формирование частиц холестерина в буфере указал, что Ловастатин, СИМВАСТАТИН и аторвастатина вызвать образование населения гетерогенных частиц холестерина, отображение различных размеров и форм, На рисунке 3a -c. И наоборот холестерин частицы формируется при наличии rosuvastatin, флувастатин, и отрицательный контроль (без препарата) были неоднородны по форме и морфологии, как показано на рисунке 3d-f. Кроме того было отмечено, что Ловастатин, СИМВАСТАТИН и аторвастатина индуцированной образование холестерина частиц экспонируется оба шаровых и линейные нити морфологии, Розувастатин и флувастатин индуцированной образование холестерина, в то время как частицы с только шаровидных морфологии. Влияние статинов на вызывающие формирования линейные нити было установлено порядка 16% для Ловастатин, 2% для СИМВАСТАТИН и 0,2% аторвастатина.
Для дальнейшей оценки воздействия гиполипидемические препараты на формирование частиц, флуоресцентный меченых холестерина агрегатов индивидуально инкубировали с Эзетимиб, фибратов, ниацин и Омега-3 жирных кислот. Как заметил со статинами, эти наркотики индуцированных образование холестерина частиц с гетерогенными размеров и форм, как показано в рисунке 4a-d. Среди них, Эзетимиб индуцированной образование холестерина частиц экспонируется оба шаровых и линейные нити морфологии, тогда как фибратов, ниацин и Омега-3 жирные кислоты индуцированной формирование частиц только шаровидных образный холестерина. Таким образом, влияние препаратов на стренги линейной форме холестерина частицы формирования была порядка 3% для Эзетимиб, 0% для фибратов, 0% для ниацина и 0% для омега-3 жирные кислоты.
Морфологический анализ показал, каждая частица холестерина шаровидных или линейной прядь форме состоит из многих мелких частиц, связанных вместе. Размеры частиц флуоресцентные позитивные шаровидных холестерина определены находятся в диапазоне от ~ 2-30 мкм2, тогда как размеры линейной формы частиц находятся в диапазоне от ~ 2-60 мкм2.
Анализ влияния гиполипидемические препараты на очищенный ЛПОНП и ЛПНП частиц:
Для дальнейшего изучения формирования частицы холестерина в присутствии липопротеинов, флуоресцентный меченых холестерина агрегатов индивидуально инкубировали с очищенной липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП белков/частиц. Результаты показали, по сравнению с инкубации с ЛПНП и ЛПВП частицы, которые холестерина агрегатов инкубировали с белков липопротеинов очень низкой плотности, причиной формирования большее количество холестерина частиц, Рисунок 5. Кроме того два главных фракций холестерина частиц наблюдались в липопротеинов очень низкой плотности населения, предполагая их частичной трансформации в ЛПНП фракция во время инкубации с люминесцентной меткой холестерина агрегатов. Анализ изображений, частиц указано наличие шаровых (~ 97%) и линейной формы частиц (~ 3%) среди населения липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП. Типоразмеры шаровидных частиц являются ~ 2-30 мкм2, тогда как размер диапазоны линейной частиц ~ 2-60 мкм2.
Для изучения гиполипидемические наркотический эффект на очищенный частиц, частиц ЛПОНП и ЛПНП индивидуально инкубировали с Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН и ниацин. В результате по сравнению с контроля эксперименты без наркотиков, наблюдаемый на формирование частиц ЛПОНП эффект препарата была выше в Эзетимиб, СИМВАСТАТИН, ловастатин и ниацин. Частицы ЛПНП, инкубировали с наркотиками показал основных одной фракции и лекарственно индуцированные воздействие на формирование частиц был выше в Эзетимиб, СИМВАСТАТИН, ловастатин и ниацин, Рисунок 6.
Вариации Гиполипидемические эффекты наркотиков в изменяя распределение частиц холестерина в образцах сыворотки:
Предыдущие эксперименты были проведены в буферном растворе с очищенной липопротеинов для оценки эффекта препарата. Таким образом на следующем шаге, эффективность гиполипидемические препараты на формирование частиц холестерина был рассмотрен с использованием 50 образцов сыворотки, собранных из 25 предметов с дислипидемии и 25 соответствует возрасту обычные предметы. Ответ наркотиков в каждом образце сыворотки была измерена на основании изменений в профиль холестерин частицы формирования в присутствия и отсутствия лекарств. В assay металлической пластинкы массива был показан каждый образец сыворотки против Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН и ниацин наркотиков. Результаты показали различия между эти препараты в модуляции распределения частиц липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП в образцах сыворотки, особенно их воздействие на снижение ЛПНП и повышение ЛПВП холестерина частицы формирования. Три представителя образцов сыворотки дислипидемия, экспонируется уникальная ответы на гиполипидемические препараты показаны на рисунке 7.
Идентификация наркотиков эффекта на модулирующих морфология сыворотки производные ЛПНП и ЛПВП частиц:
Анализ фенотипа производные сыворотки холестерина частиц показали наличие линейной пряди и шаровидных формы липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП, и HDL субпопуляций, подтвердив тем самым аналогичными морфологии, выявленных в ходе экспериментов выполнена как в буфере и с очищенной липопротеинов частицы, как показано на рисунке 8. Однако распределение субпопуляций частицы шаровых и линейные формы холестерина широко различались дислипидемии и соответствует возрасту обычные предметы. В частности управления анализов, выполненных без наркотиков показало, что различия в распределении линейной прядь форме LDL холестерина частиц между дислипидемии (среднее 2,0%) и возраст соответствует нормальной (среднее 1,3%) образцы сыворотки. Аналогичным образом, повышенный уровень линейной прядь форме частицы HDL холестерина было отмечено в образцах дислипидемия (среднее 18,3%), по сравнению с возраст соответствует образцы сыворотки (среднее 11,1%). В корреляции анализы выполняются в присутствии наркотиков в образцах сыворотки дислипидемия, показали значительное снижение в линейной форме HDL холестерина частицы формирования симвастатин (среднее 8,3%), Эзетимиб (среднее 11,5%), ловастатин (средний 11,7%), и не сокращение для ниацина (среднее 18,3%). Кроме того было отмечено снижение в формировании линейной формы частиц холестерина LDL в образцах сыворотки дислипидемия при инкубировали с препаратами, отображается в таблице 1.
Кроме того анализов осуществляется при наличии препаратов в samp сыворотку соответствует возрасту управленияLes показали значительное снижение в линейной форме частиц HDL холестерина в симвастатин (среднее 5,0%), Эзетимиб (средняя 8,2%), ловастатин (средняя 8,7%) и ниацин (средняя 10,8%), как показано в таблице 2. Дислипидемии и возраст соответствует нормальной сыворотки образцов экспонируется лекарственно индуцированные сокращения в линейной форме ЛПНП и ЛПВП холестерина частиц показали относительное увеличение шарообразную форму холестерина частиц (данные не показаны).
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая процесс визуализации в vitro холестерина частицы морфологии. (a, b) Добавление гиполипидемические препарата в буфер или сыворотки образцов. (c) добавлением флуоресцировани обозначенного растворимых холестерина агрегатов к образцам. (d) приобретения результате образцы для морфологического анализа холестерина нерастворимых частиц с помощью тепловизионных проточной цитометрии. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: определение двух отдельных морфологии холестерина частиц с помощью тепловизионных проточной цитометрии. () частицы отделяются в линейной или шаровых населения на основе текстурного анализа светлые области изображения. В частности точка участок означает H однородность (ось x) и означает H энтропии (ось y) содержит два закрытых регионов для обнаружения шаровых (красный) и линейной прядь форме частиц (синий) холестерина. (b) образы отображения морфология шаровидных формы частиц, выявленных в области народонаселения 1. (c) изображения линейных стренги форме частиц, выявленных в населения 2. (d) гистограмме показано распределение всех частиц флуоресцентные положительный холестерин используется для определения их концентрации и субпопуляции. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: изображения галереи, отображение эффект статинов в модулирует образование частиц холестерина. Яркие области относится к области аналогичны FSC в обычных проточный цитометр. Зелёный канал относится к флуоресцирования выбросов, обнаруженных в 505-560 Нм, и желтый канал относится к флуоресцирования выбросов, обнаруженных в 560-595 Нм. (a-e) Галереи изображений, отображение морфология холестерина частиц, образующихся при наличии Ловастатин, СИМВАСТАТИН, аторвастатин, Розувастатин и флувастатин, соответственно. (f) формирование частиц холестерина в отсутствие статинов (отрицательный контроль). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: демонстрируя дифференцированный эффект гиполипидемические препараты в модулирует образование частиц холестерина. (a-d) Галереи изображений, отображение морфологией частиц холестерина сформированы присутствии Эзетимиб, ниацин, фибратов и Омега-3 жирных кислот, соответственно. Зелёный канал относится к флуоресцирования выбросов, обнаруженных в 505-560 Нм, и желтый канал относится к флуоресцирования выбросов, обнаруженных в 560-595 Нм. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: анализ формирования липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП холестерина частиц в отсутствие препарата. Точка участки: Оси x отображается спектр частиц холестерина, обнаруженных в зеленой флуоресценцией канал (505-560 Нм) и ось y отображает стороне скаттер. Строб показывает регионов липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП частиц, обнаруженных в точка участки флуоресценции. () формирование частиц холестерина при наличии очищенная ЛПОНП. (b) представитель изображения частиц ЛПОНП. (c) формирование частиц холестерина при наличии очищенная ЛПНП. (d) представитель изображения частиц ЛПНП. (e) формирование частиц холестерина при наличии очищенная HDL. (f) представитель изображения HDL частиц. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: продемонстрировать эффект липидов, снижение наркотиков на очищенный частиц ЛПОНП и ЛПНП холестерина. () липопротеинов очень низкой плотности частиц, без наркотиков. (b) липопротеинов очень низкой плотности частиц инкубировали с Эзетимиб. (c) липопротеинов очень низкой плотности частиц инкубировали с lovastatin. (d) липопротеинов очень низкой плотности частиц инкубировали с симвастатин. (e) липопротеинов очень низкой плотности частиц инкубировали с ниацин. (f) ЛПНП частицы инкубировали без наркотиков. (g) ЛПНП частицы инкубировали с Эзетимиб. (h) ЛПНП частицы инкубировали с lovastatin. (я) ЛПНП частицы инкубировали с симвастатин. (j) ЛПНП частицы инкубировали с ниацин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: флуоресценции точка участки дифференцированный эффект липидов, снижение наркотиков в модуляции липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц в образцах сыворотки. Верхняя строка, скрининга сыворотки 1 показаны низкого уровня наркотиков реакции в увеличении 0 до 15% HDL частицы формирования; средний ряд, скрининга сыворотки 2 показаны умеренный уровень наркотиков реакции в увеличении 16 – 50% HDL частиц; Нижний ряд, скрининга сыворотки 3 показаны выше уровня наркотиков реакции в увеличении 51 до 100% HDL частиц. (, f, k) В образцах сыворотки без наркотиков. (b, g, l) Образцы сыворотки инкубировали с Эзетимиб. (c, h, m) Образцы сыворотки инкубировали с lovastatin. (d, i, n) Образцы сыворотки инкубировали с симвастатин. (e, j, o) Образцы сыворотки инкубировали с ниацин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: изображения галереи, отображение морфологией частиц холестерина в сыворотке образца 1. Зелёный канал показывает изображения флуоресценции выбросы частиц; сторона точечной (голубого канала) показывает изображения возбуждения лазерного света рассеяны частицы. () шаровых и линейные формы холестерина частицы сформирован без наркотиков. (b, c, d, e) Холестерин частицы сформированы присутствии Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН и ниацин, соответственно. Масштаб бары= 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Сыворотка ID | Без наркотиков (контроль) | С Эзетимиб | С ловастатин | С СИМВАСТАТИН | С ниацин | |||||
| Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | |
| НАВИГАТОРОВ-01 | 1.73 | 45.2 | 0,81 | 18.1 | 0,61 | 16.1 | 0,59 | 13,9 | 2.26 | 33,6 |
| НАВИГАТОРОВ-02 | 2.86 | 35,9 | 1.26 | 30,9 | 1.27 | 22.7 | 0,73 | 15.2 | 3.03 | 37,7 |
| НАВИГАТОРОВ-03 | 2.04 | 35,8 | 0.87 | 4.82 | 1.02 | 4.14 | 0,36 | 3.06 | 0,45 | 9.57 |
| НАВИГАТОРОВ-04 | 2.56 | 32,9 | 1.15 | 21,8 | 1.12 | 18.6 | 0,77 | 17.2 | 3.37 | 36,5 |
| НАВИГАТОРОВ-05 | 0.42 | 29.2 | 0,24 | 5,62 | 0,22 | 8.72 | 0.16 | 9.91 | 0,35 | 22.2 |
| НАВИГАТОРОВ-06 | 1.8 | 28.1 | 0.4 | 16,8 | 0.62 | 15 | 0.42 | 9.27 | 2.28 | 38,4 |
| НАВИГАТОРОВ-07 | 1.8 | 26.5 | 0,85 | 10.5 | 1.18 | 19,9 | 0.62 | 7.32 | 1.29 | 23.4 |
| НАВИГАТОРОВ-08 | 0,98 | 22.8 | 0,86 | 7.28 | 1.55 | 10.2 | 0,14 | 5.98 | 0,59 | 13.3 |
| НАВИГАТОРОВ-09 | 3.87 | 22,1 | 1,98 | 9.56 | 1,87 | 10.3 | 1.46 | 7.96 | 2.86 | 9.88 |
| НАВИГАТОРОВ-10 | 4.46 | 21,9 | 2.57 | 13.6 | 4.04 | 17.1 | 2.28 | 11,9 | 0.71 | 25,7 |
| НАВИГАТОРОВ-11 | 1,57 | 19.2 | 1.15 | 9.24 | 1.37 | 6.98 | 0.74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| НАВИГАТОРОВ-12 | 1.06 | 16,7 | 0.66 | 4.38 | 0,7 | 4.74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4.73 |
| НАВИГАТОРОВ-13 | 4,85 | 16,6 | 1.28 | 30,4 | 1.4 | 32.6 | 0,8 | 16,6 | 4.02 | 31 |
| НАВИГАТОРОВ-14 | 2.08 | 16 | 0,68 | 15.4 | 0,64 | 16,5 | 1.97 | 10.2 | 1.25 | 20.11 |
| НАВИГАТОРОВ-15 | 1.5 | 11,9 | 1.14 | 13.3 | 1.21 | 11.4 | 0,8 | 6.12 | 1.38 | 4.59 |
| НАВИГАТОРОВ-16 | 1.82 | 10.4 | 2.04 | 9.59 | 1.24 | 5,62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| НАВИГАТОРОВ-17 | 1.05 | 10.3 | 1.02 | 4.7 | 1,78 | 15.1 | 0.93 | 7.81 | 1.27 | 13 |
| НАВИГАТОРОВ-18 | 1.11 | 8.76 | 0.54 | 3.68 | 0,61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6.69 |
| НАВИГАТОРОВ-19 | 1 | 8.52 | 0.75 | 6.67 | 0,76 | 5.86 | 0.91 | 8.36 | 1.22 | 11,9 |
| НАВИГАТОРОВ-20 | 3.54 | 7.92 | 3.78 | 12 | 3.56 | 5.81 | 3.28 | 8.28 | 3.44 | 12.3 |
| НАВИГАТОРОВ-21 | 1,88 | 7.69 | 2.12 | 11.4 | 1.73 | 9.54 | 1.77 | 8.34 | 2.32 | 16,7 |
| НАВИГАТОРОВ-22 | 1.64 | 7.17 | 0,35 | 5.75 | 0.56 | 13.2 | 0,14 | 4.33 | 1.23 | 17,8 |
| НАВИГАТОРОВ-23 | 1.54 | 6.27 | 1.25 | 7.24 | 1.02 | 6.12 | 0,73 | 3.58 | 1.42 | 6.69 |
| НАВИГАТОРОВ-24 | 0,53 | 6.22 | 0,52 | 4.49 | 0.91 | 5.57 | 0.54 | 4.01 | 0,65 | 10.5 |
| НАВИГАТОРОВ-25 | 2.97 | 5.1 | 1,59 | 11 | 1,88 | 9 | 1.03 | 6.54 | 2.61 | 29.1 |
Таблица 1: скрининг дислипидемия образцов сыворотки в assay металлической пластинкы массив Показать дифференцированный эффект гиполипидемические препараты. По сравнению с элементами управления без наркотиков (колонок 2, 3), образцы сыворотки инкубировали с Эзетимиб (колонки 4, 5), ловастатин (колонки 6, 7), симвастатин (колонки 8, 9) и ниацин (колонки 10, 11) показал вариации на склонение линейной форме ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц.
| Сыворотка ID | Без наркотиков | С Эзетимиб | С ловастатин | С СИМВАСТАТИН | С ниацин | |||||
| Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | Линейная, частицы ЛПНП % | Линейная, HDL частицы % | |
| НПП-01 | 2.05 | 26.8 | 0.62 | 11,9 | 0.56 | 16,9 | 0,52 | 9.28 | 1.4 | 11,9 |
| НПП-02 | 1.35 | 26,3 | 1,68 | 21,8 | 2.59 | 23.6 | 0,79 | 6.92 | 2.16 | 29,7 |
| НПП-03 | 2.4 | |||||||||
Таблица 2: скрининг соответствует возрастной контроль образцов сыворотки в assay металлической пластинкы массив показывают дифференцированный эффект гиполипидемические препараты. По сравнению с элементами управления без наркотиков (колонок 2, 3), образцы сыворотки инкубировали с Эзетимиб (колонки 4, 5), ловастатин (колонки 6, 7), симвастатин (колонки 8, 9) и ниацин (колонки 10, 11) показал вариации на склонение линейной форме ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц.
Discussion
В общем распределения и функциональные свойства липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП холестерина частиц в циркуляцию крови главным образом определяются метаболических, генетические, эпидемиологических, сотовых и плазменных факторов22,23. В настоящем исследовании, изучения влияния изменения липидного наркотиков в буфере показали весьма липофильных препараты, такие как Эзетимиб, Ловастатин, СИМВАСТАТИН и аторвастатина индуцированной высшего уровня сложности на морфологию холестерина частиц по сравнению с нижнего уровня эффект наблюдается с высоко гидрофильным Розувастатин и флувастатин наркотиков. Эти результаты находятся в хорошем согласии с нашего предыдущего исследования, описывающие неферментативного механизм, основанный эффект статинов в модуляции ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц в буфер и сыворотки образцы21. Соответственно результаты настоящего исследования показали неферментативного механизм действий Эзетимиб, ниацин, фибратов и Омега-3 жирные кислоты препаратов, которые могут играть непосредственную роль в модуляции формирование частиц холестерина. Вполне возможно, что взаимосвязи между наркотиками и холестерина агрегатов приводит к Ассамблее большого размера холестерина частиц, которые являются 2-60 мкм2, экспонирование шаровых и линейные нити морфологии.
Кроме того результаты, полученные с использованием очищенного липопротеинов частицы предложить взаимодействий между холестерина агрегатов и плазменных факторов, включая липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП белков, которые могут изменить композиции и Морфологические свойства холестерина частицы. Результаты лечения наркотиков с участием очищенный липопротеинов частицы указано выше уровня наркотический эффект на формирование частиц ЛПОНП, по сравнению с их влияние на формирование частиц ЛПНП холестерина. Ловастатин, СИМВАСТАТИН и Эзетимиб наркотиков использовались как про препаратов и их доз в анализов могут быть выше, чем физиологических концентрациях.
Интересно, что отбор образцов сыворотки, показала вариации влияние наркотиков на изменяя профили липопротеинов очень низкой плотности, ЛПНП и ЛПВП холестерина частицы формирования, особенно их влияние на формирования линейной форме частицы ЛПНП и ЛПВП. Эти препараты индуцированной снижение на линейной форме ЛПНП и ЛПВП холестерина формирование частиц в дислипидемии и образцы возраст соответствует нормальной сыворотки. Эффекты наркотиков, наблюдается на снижение линейной формы частиц формирования был выше в СИМВАСТАТИН, Эзетимиб, ловастатин и ниацин. Определение холестерина частиц с морфологии шаровых и линейные нити в образцах сыворотки крови нормальный и дислипидемия свидетельствует о том, что частицы с аналогичными морфологии может образовывать в условиях в естественных условиях . Предыдущие исследования выявили наличие диска и холестерина игольчатые кристаллы в атеросклеротических бляшек и человека и ароЕ- / - LDLR- / - мышей модели24,25,26 ,27,28.
Частицы ЛПВП, циркулирующих в крови существует как гетерогенная смесь и на уровне малых и больших размеров HDL частиц наряду с функциональной активности являются важными факторами приложить их кардио защитный эффект через обратный холестерина транспорт путь29,30. Недавние исследования показали важность выявления HDL холестерина частиц подфракций для выяснения их роли в нескольких биологических функций, таких как холестерин измеряем, противовоспалительным, анти тромботических и антиоксидантным31 . Кроме того ряд исследований сообщили эффект гиполипидемические терапии повышения низкого до умеренного уровня ЛПВП в плазме1,5,21. Соответственно результаты этого исследования обеспечивают новые идеи на морфологические особенности холестерина частиц. Примечательно, обнаружение более высокий уровень линейной формы частиц холестерина HDL в образцах сыворотки дислипидемия субъектов свидетельствует о том, что они могут быть надежным biomarker для диагностики и оценки последствий изменения липидного препаратов у больных. Однако дальнейшие расследования требуется с помощью крупных клинических образцов для лучшего понимания холестерина частиц с собственный морфологии и их ассоциации сердечно-сосудистых заболеваний.
В assay металлической пластинкы массив для изучения наркотический эффект на Ассамблее холестерина частиц, мы использовали 2 мкг флуоресценции помечены холестерина агрегатов и 5 µgof наркотиков, потому что: (1) препараты конкурсно связать оба флуоресценции помечены холестерина и эндогенные липиды присутствуют в образцах сыворотки; (2) от каждого образца мы приобрели 5000 до 10000 холестерина частицы, которые собираются в больших размеров и форм, начиная от ~ 2-60 мкг2; (3) мы наблюдали широкие вариации ответ наркотиков среди образцов сыворотки, инкубировали с наркотиками (доз 300 нг 5 мкг) и ~ 1-5% из них инкубировали с высокими дозами показала не обнаружить изменения в профиле формирования частицы холестерина; и (4) взаимодействия между холестерина агрегатов и гиполипидемические препараты при посредничестве неферментативного процесса. Таким образом концентрации реагентов, используемых в assay может быть выше, чем их физиологического уровня.
В заключение мы успешно продемонстрировали преимущества в vitro imaging метода, описанного в настоящем исследовании для определения воздействия широкого спектра гиполипидемические препараты на модуляции морфологии и состава холестерина частицы. Подход визуализация и количественной морфологии липидных частиц, применяя созвездие алгоритмов анализа изображений может помочь диагноз атеросклероз и оценить результаты липидов понижая терапии у больных.
Disclosures
Д-р Madasamy получил грант поддержки от Plaxgen, Inc и конкурирующие финансовый интерес. Другие авторы имеют не конкурирующих финансовых интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Plaxgen исследования гранта для SM (PLX-1008). Мы благодарим Пало-Альто медицинский исследовательский фонд научно-исследовательский институт для сбора образцов сыворотки от атеросклероза субъектов под номером официального утверждения IRB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measurement | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
References
- Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
- Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
- Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
- Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
- Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
- Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
- Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
- Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
- Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
- Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
- Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
- McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
- Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
- Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
- Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
- Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
- Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
- Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
- Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
- Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
- Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
- Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
- Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
- Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
- Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
- Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
- Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
- Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).
