Målet med denne studien var å vurdere i vitro lipidsenkende narkotika effekter i modulerende morfologi av kolesterol partikler. Sammenligning av lipidsenkende legemidler avslørte variasjoner virkning i modulerende den morfologiske funksjoner i kolesterol partikler.
Behandling av dyslipidemi pasienter med lipidsenkende legemidler fører til en betydelig reduksjon i low-density lipoproteiner (LDL) nivå og et lavt til moderat nivå av økningen i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Men er en mulig rolle av disse stoffene i å endre morfologi og distribusjon av kolesterol partikler dårlig forstått. Her beskriver vi i vitro evalueringen av lipidsenkende narkotika effekter i modulerende morfologiske funksjoner i kolesterol partikler med metoden plakk matrise i kombinasjon med imaging flowcytometri. Bildet analyser av kolesterol partikler indikerte at lovastatin, simvastatin, ezetimibe og atorvastatin indusere dannelsen av både globular og lineær strand-formet partikler, mens niacin, fibrater, fluvastatin og rosuvastatin induserer den dannelsen av bare globular-formet partikler. Neste, renset svært lav tetthet lipoprotein (VLDL) og LDL partikler inkubert med disse stoffene viste endringer i morfologi og bilde teksturen av kolesterol partikler subpopulasjoner. Videre avsløre screening av 50 serumprøver tilstedeværelsen av et høyere nivå av lineær formet HDL kolesterol partikler i fag med dyslipidemi (gjennomsnitt 18.3%) sammenlignet med alder-matchet normal (gjennomsnitt 11,1%) prøvene. Vi har også observert betydelige variasjoner i lipidsenkende narkotika effekter på å redusere lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i serumprøver. Disse funnene tyder på at lipidsenkende legemidler, i tillegg til sin celle-mediert hypolipidemic effekter, modulere direkte morfologi av kolesterol partikler av en ikke-enzymatisk virkningsmekanisme. Resultatene av disse resultatene har potensial til å informere diagnose av åreforkalkning og forutsi optimal lipidsenkende terapi.
Flere kliniske studier har vist gunstige effekter av lipidsenkende legemidler i å redusere Plasmanivåer av low-density lipoproteiner (LDL) kolesterol og lav til moderat nivå av økningen i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som hindrer både primære og sekundære forekomst av aterosklerose-relaterte kardiovaskulære bivirkninger,1,,2,,3,,4,,5. Statiner, en gruppe av HMG-CoA reduktasehemmere, blokkere endogene kolesterol syntese i leveren at i tur føre til lavere sirkulerende nivåer av LDL kolesterol i blodet6,7. Likeledes, lipid redusere effekten av niacin er formidlet av sin direkte og noncompetitive hemming av hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, en nøkkel leveren enzym involvert i triglyserider syntese8. Relativt, reduserer ezetimibe plasma nivå av LDL ved å begrense absorpsjon av eksogene kolesterol ved binding til Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein i epitelceller av tynntarmen9. Fenofibrate, et annet lipidsenkende stoff, reduserer betydelig plasma konsentrasjoner av triglyserider og også moderat reduserer LDL Kolesterol til peroxisome proliferator-aktivert reseptorer veien10. Dessuten, omega-3 fettsyrer er rapportert å ha anti-aterosklerotisk effekt på grunn av sin evne til å redusere Plasmanivåer av LDL11.
Lipidsenkende narkotika, i tillegg til deres primære effekt på å senke LDL Kolesterol, har en rekke gunstige pleiotropic effekter inkludert øke HDL-nivået, forbedre endothelial funksjoner, reduserer betennelse og hemme blodplater samlinger12,13,14. Men den underliggende mekanismen av disse stoffene i øker HDL kolesterol partikler og endre deres strukturfunksjonene er ikke fullt ut forstått. Siden disse legemidlene er vidt foreskrevet for å behandle aterosklerose-relaterte karsykdommer (karsykdommer), er det viktig å undersøke nærmere deres mulig rolle i å bestemme morfologiske funksjoner og distribusjon av lipid partikler. Humant plasma-lipidome består av ca. 600 forskjellige lipider og 22 molekylær ulike cholesterols som finnes i ulike størrelser, figurer, tettheter og komposisjoner15,16,17 . Analytiske metoder som ultra-sentrifugering, NMR og gradient gel geleelektroforese brukes til å karakterisere LDL og HDL partikler og deres subfractions18,19. Anvendelsen av disse metodene er imidlertid begrenset til studier for å bestemme effekten av stoffene i modulerende morfologi og montering av lipid partikler. Flow cytometer basert plakk matrisen er en funksjonell biokjemiske analysen utviklet for deteksjon og visualisering av serum avledet lipid og amyloid plakk partikler20. Fordelene med i vitro imaging metoden beskrevet i denne studien aktiverer identifisering av lipid-modulerende narkotika effekter i å endre morfologi og distribusjon av kolesterol partikler i bufferen og serum.
Distribusjon og funksjonelle egenskaper VLDL LDL og HDL kolesterol partikler i blodsirkulasjonen bestemmes, hovedsakelig av metabolsk, genetisk, epidemiologisk, cellular, og plasma faktorer22,23. Studien, undersøker virkningene av lipid-modifisere stoffer i bufferen avslørt at svært lipofile stoffer som ezetimibe, lovastatin, simvastatin og atorvastatin indusert en høyere nivå kompleksitet på morfologi av kolesterol partikler sammenlignet med lavere nivå effekten observert med svært hydrofile rosuvastatin og fluvastatin narkotika. Disse resultatene er i god avtale med våre tidligere study beskriver en ikke-enzymatisk mekanisme basert effekt av statiner i modulerende LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i bufferen og serum prøver21. Følgelig viste resultatene fra denne studien en ikke-enzymatisk virkningsmekanismen av ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fettsyrer stoffer som kan spille en direkte rolle i modulerende kolesterol partikler formasjon. Det er mulig at samspillet mellom narkotika og kolesterol aggregater fører til montering av stor størrelse kolesterol partikler som er 2-60 µm2, viser globular og lineære strand morphologies.
Dessuten foreslår resultatene med renset lipoprotein partikler interaksjoner mellom kolesterol aggregater og plasma faktorer inkludert VLDL LDL og HDL proteiner som kan endre komposisjoner og morfologiske egenskaper av kolesterol partikler. Narkotika behandling resultatene som involverer renset lipoprotein partikler indikerte en høyere nivå narkotika effekt på VLDL partikler formasjon sammenlignet med virkning observert på LDL Kolesterol partikler formasjon. Lovastatin og simvastatin ezetimibe narkotika ble brukt som pro-legemidler og deres doser i analyser kan være høyere enn de fysiologiske konsentrasjonene.
Interessant, formet screening av serumprøver viste varianter av narkotika effekt på endre profiler av VLDL LDL og HDL kolesterol partikler formasjon, spesielt deres effekt på formasjoner av lineær LDL og HDL partikler. Disse stoffene indusert reduksjon på lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler formasjon i både dyslipidemi og alder-matchet normal serumprøver. Narkotika effekter observert på å redusere lineær formet partikler formasjon var høyere i simvastatin, ezetimibe, lovastatin og niacin. Identifikasjon av kolesterol partikler med globular og lineære strand morphologies i serumprøver normal og dyslipidemi antyder at partikler med lignende morphologies kan danne i vivo forhold. Tidligere studier har identifisert plate og nål som kolesterol krystaller i aterosklerotisk plaketter av menneskelige og ApoE– /- og LDLR– / – mus modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partikler i blodet eksisterer som en heterogen blanding og nivået av små og store størrelse HDL partikler sammen med funksjonelle aktiviteten er viktige faktorer for å utøve sine cardio-beskyttende effekt via omvendt kolesterol transport Pathway29,30. Nyere studier har understreket viktigheten av å identifisere HDL kolesterol partikkel subfractions for Klargjørende deres rolle i flere biologiske funksjoner som kolesterol middelklasseinnbyggere, anti-betennelse, anti-trombotiske og anti-oksidativt31 . I tillegg har en rekke studier rapportert effekten av lipidsenkende terapi i økende en lav til moderat nivået av HDL i plasma1,5,21. Følgelig gir resultatene fra denne studien ny innsikt på morfologiske funksjoner i kolesterol partikler. Spesielt oppdagelsen av et høyere nivå av lineær formet HDL kolesterol partikler i serumprøver av dyslipidemi antyder at de kan være pålitelig biomarkør både diagnose og evaluere effekten av lipid-modifisere stoffer i pasienter. Imidlertid flere er undersøkelse nødvendig med store klinisk prøver for å forstå kolesterol partikler med forskjellige morphologies og tilknytningen til CVD.
Plakk array analysen for å undersøke narkotika effekten på montering av kolesterol partikler, brukte vi 2 µg av fluorescens merket kolesterol aggregater og 5 µgof narkotika fordi: (1) narkotika konkurransedyktig binde til både fluorescens merket kolesterol og endogene lipider i serumprøver; (2) fra hver prøve kjøpte vi 5000 til 10.000 kolesterol partikler som er samlet i store størrelser og figurer fra ~ 2-60 µ2; (3) vi observerte et bredt varianter av narkotika-respons blant serumprøver inkubert med narkotika (doser 300 ng til 5 µg) og ~ 1-5% av dem inkubert med høye doser viste ingen synlig endringer i profilen til kolesterol partikler formasjon; og (4) samspillet mellom kolesterol aggregater og lipidsenkende legemidler er formidlet av en ikke-enzymatisk prosess. Derfor kan konsentrasjonen av reagensene i analysen være høyere enn deres fysiologisk nivå.
I konklusjonen, har vi vist fordelene med en i vitro imaging metoden beskrevet i denne studien for å bestemme effekten av et bredt spekter av lipidsenkende legemidler på modulerende morfologi og sammensetningen av kolesterol partikler. Tilnærming visualisere og kvantifisere morfologi av lipid partikler ved å bruke en konstellasjon av bildet analysealgoritmer kan hjelpe både diagnosen åreforkalkning og evaluere resultatene av lipidsenkende terapi hos pasienter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en Plaxgen forskning tilskudd tildeles SM (PLX-1008). Vi takker Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute for innsamling serumprøver fra aterosklerose temaer under IRBS godkjenning.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |