Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Differential virkninger af Lipid-sænkende stoffer i modulerende morfologi af kolesterol partikler

Published: November 10, 2017 doi: 10.3791/56596
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1,4, 5
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere i vitro lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologi af kolesterol partikler. Sammenligning af lipid-sænkende stoffer viste variationer i deres virkning i modulerende de morfologiske træk af kolesterol partikler.

Abstract

Behandling af dyslipidæmi patienter med lipid-sænkende stoffer fører til en betydelig reduktion i low-density lipoprotein (LDL) niveau og et lavt til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Dog er en mulig rolle for disse stoffer i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler dårligt forstået. Her beskriver vi in vitro- vurderingen af lipid-sænkende narkotika effekter i modulerende morfologiske træk af kolesterol partikler ved hjælp af metoden plaque array i kombination med imaging flowcytometri. Billede analyser af kolesterol partikler angivet at lovastatin, simvastatin, ezetimibe, og atorvastatin inducere dannelse af kugleformede og lineær strand-formede partikler, der henviser til, at niacin, fibrater, fluvastatin og rosuvastatin fremkalde den dannelsen af kun kugleformede-formet partikler. Næste, renset meget low-density lipoprotein (VLDL) og LDL partikler inkuberes med disse stoffer viste ændringer i kolesterol morfologi og image tekstur partikler delpopulationer. Derudover afslørede screening af 50 serumprøver tilstedeværelsen af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i fag med dyslipidæmi (gennemsnit af 18,3%) i forhold til alder-matchede normal (gennemsnit af 11,1%) prøver. Vi bemærkede også betydelige variationer i lipid-sænkende narkotika virkninger på at reducere lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Disse resultater viser, at lipid-sænkende medicin, ud over deres celle-medieret hypolipidemic effekter, direkte kan modulere morfologi af kolesterol partikler af en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme. Resultaterne af disse resultater har potentiale til at informere diagnose af åreforkalkning og forudsige optimal lipid-sænkende behandling.

Introduction

Talrige kliniske undersøgelser har påvist gavnlige virkninger af lipid-sænkende medicin til at reducere plasmaniveauer af low-density lipoprotein (LDL) kolesterol og en lav til moderat niveau stigning i high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som forhindrer både primære og sekundære forekomster af åreforkalkning-relaterede negative kardiovaskulære hændelser1,2,3,4,5. Statiner, en gruppe af HMG-CoA reduktase enzym-hæmmere, blokere endogent kolesterol syntese i leveren, i tur fører til lavere cirkulerende niveauer af LDL kolesterol i blodet6,7. Ligeledes, den lipid sænkende effekt af niacin er medieret af sin direkte og noncompetitive hæmmer af hepatocyt diacylglycerol acyltransferase-2, en nøgle leverenzym involveret i triglycerid syntese8. Relativt, reducerer ezetimibe plasma niveau af LDL ved at begrænse absorption af eksogene kolesterol ved binding til Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein beliggende i epitelceller af tyndtarmen9. Fenofibrate, en anden lipid-sænkende medicin, reducerer betydeligt plasmakoncentrationer af triglycerider og også moderat mindsker LDL kolesterol gennem Peroxisom proliferator-aktiverede receptorer vej10. Desuden er omega-3 fedtsyrer rapporteret at have anti-aterosklerotisk virkning på grund af dens evne til at sænke plasmaniveauer af LDL11.

Lipid-sænkende medicin, ud over deres primære virkning på at sænke LDL-kolesterol, har en række gavnlige pleiotrope effekter, herunder øge HDL-niveau, forbedrer endotel funktioner, reducere inflammation og hæmme trombocyttal sammenlægninger12,13,14. Men, den underliggende mekanisme af disse stoffer for at øge HDL kolesterol partikler og ændre deres strukturelle træk er ikke fuldt forstået. Da disse lægemidler er almindeligt ordineret til behandling af åreforkalkning-relaterede hjerte-kar-sygdomme (lidelser), er det vigtigt for yderligere at undersøge deres mulige roller i fastsættelsen af morfologiske træk og distribution af lipid partikler. Humant plasma lipidome består af cirka 600 forskellige lipider og 22 forskellige molekylære former af cholesterols, der er til stede i forskellige størrelser, former, tætheder og kompositioner15,16,17 . Analytiske metoder såsom ultra-centrifugering, NMR og gradient gelelektroforese bruges til at karakterisere LDL og HDL partikler og deres subfractions18,19. Anvendelsen af disse metoder er dog begrænset til undersøgelser med henblik på bestemmelse af virkningen af lægemidler i modulerende morfologi og samling af lipid partikler. Flow Flowcytometret baseret plaque array er en funktionel biokemiske assay udviklet til påvisning og visualisering af serum fremstillet lipid og amyloid plaque partikler20. Fordele ved in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse aktiverer identifikation af lipid-modulerende medicin effekter i at ændre morfologi og fordeling af kolesterol partikler i buffer og serum prøver.

Protocol

1. forberedelse af fluorescerende-mærket kolesterol og Lipid-sænkende medicin

Bemærk: lysstofrør-mærket kolesterol aggregater og statiner blev forberedt som beskrevet i vores tidligere artikel 21. se Tabel af materialer for detaljer af reagenser, imaging flow forskellige, kemi analysatorer og data analyse software, der anvendes i denne undersøgelse.

  1. Solubilize fluorescerende-mærket frysetørrede kolesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) pulver i 1 mL 100% alkohol.
  2. Centrifugeres prøve for 3 min på 2,040 x g og bruge de supernatanter, der indeholder opløselige fluorescens-mærket kolesterol aggregater i plaque array assay.
  3. Til fremstilling af narkotika, individuelt solubilize pulver (2 mg) af simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe, og omega-3 fedtsyrer i 1 ml 100% alkohol.
  4. Efter centrifugering i 3 min. ved 2,040 x g, bruge de supernatanter, der indeholder stoffer i analysen.
  5. Ligeledes solubilize individuelt pulvere (2 mg) af fluvastatin, rosuvastatin, niacin, og fibrate i 1 mL deioniseret vand at gøre en stamopløsning af 2 mg/mL.
  6. Efter centrifugering i 3 min. ved 2,040 x g, bruge de supernatanter, der indeholder stoffer i plaque array assay.

2. Plaque Array Assay undersøgelse In Vitro kolesterol partikler dannes

  1. Brug kemi analysator-1 (se tabel af materialer) at oprette plaque array assay for kolesterol partikler dannelse. Udfør analysen i en rund bund, lav protein bindende 96-brønd plade ved hjælp af reagenser tilberedes i afdeling 1. Opretholde den endelige reaktion volumen i hver brønd på 200 µL og udføre alle assays i tre eksemplarer.
    1. Først, belastning 194.5 µL af phosphat bufferet saltvand (PBS) til hver brønd.
    2. Til hver godt tilføje 2,5 µL (5 µg) af hver lipid-sænkende drug opløsning og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade til ensartet Bland stoffet i løsning. Ingen stof er føjet til negative kontrolprøverne.
    3. Endelig tilføje 2 µL (2 µg) fluorescerende-mærket kolesterol samlede løsning til hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.
    4. Ruger plade på en lab shaker i 2 timer ved 37 ° C og 200 rpm.
    5. Efter inkubation, erhverve billeder af partikler af imaging flowcytometri.

3. Fange billeder af kolesterol partikler ved hjælp af Imaging Flow flowcytometri

  1. åben erhvervelse dataskabelon at indlæse indstillingerne korrekt instrument. Klik på " fil ", og vælg derefter " åbne skabelon … " og vælg skabelonfil.
  2. Klik " Flush, lås, belastning " at forberede instrument for prøven lastning.
  3. Når de " indlæse prøve " dialog boks åbnes, klik på " OK " at indlæse 50 µL af prøverne fra hver godt forberedt i afsnit 2 i de billeddiagnostiske flow Flowcytometret.
  4. Klik " køre | Installationsprogrammet " til at se partiklerne i det billeddiagnostiske område i realtid.
  5. Når partikler i det billeddiagnostiske område er i god fokus, klik " køre | Erhverve " at erhverve billeder af hvert objekt samtidigt i en høj overførselshastighed måde for mørkefelt (side scatter/SSC), lyse felt (BF), grønne fluorescens og gule fluorescens.
  6. Gentag trin 3.2-3.5 for at erhverve 5.000-10.000 partikler fra hver stikprøve.
  7. Analysere alle HUDLØS billedfiler ved hjælp af billede analyse software til bestemmelse af objektet fluorescens intensitet og morfologiske variationer.
    1. Klik på den " værktøjer " knappen øverst i billedet analyse software, og vælg derefter " Data batchfiler " fra drop-down menuen, som vil åbne de " partier " vindue.
    2. i de " partier " vindue, klik på den " tilføje Batch " knap, som vil åbne den " definere en Batch " vindue.
    3. i den " definere en Batch " vindue, klik på den " tilføje filer " knappen og vælg HUDLØS billedfiler, klik på den " skabelon " knappen og vælg den relevante data analyse skabelonfil, og vælg derefter " OK " og " indsende partier " til at begynde behandling og analyse af raw-billedfilerne.

4. Plaque Array Assay baseret evaluering af Lipid-sænkende stoffer effekt på renset kolesterol partikler

  1. som beskrevet i trin 2.1, udføre kolesterol partikler dannelse analyse ved hjælp af renset VLDL, LDL og HDL lipoproteiner/partikler. Udføre plaque array assay i en 96-brønd plade.
    1. Først, indlæse alle brønde med PBS, bruge en 200 µL endelige mængden for hver brønd.
  2. For negativ kontrol, tilføje 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler individuelt i hver godt uden narkotika og ryste plade for 30 s.
    1. For at undersøge effekten lipid-sænkende medicin, tilføje 4 µg VLDL, LDL, eller HDL proteiner/partikler individuelt til hver godt og ryste plade for 30 s.
    2. For wells tilføjet med 4 µg VLDL, LDL og HDL, tilføje 2,5 µL (5 µg) ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsning og ryste plade for 30 s ved at placere det i kemi analysator-1.
    3. Endelig tilføje 2 µL (2 µg) Fluorescens-mærket kolesterol samlede løsning til alle brønde og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.
  3. Inkuberes plade i 2 timer i en lab shaker indstillet på 37 ° C og 200 rpm.
  4. Erhverve prøver ved hjælp af billedbehandling flowcytometri efter trin 3.1-3.5.
  5. Analysere HUDLØS billedfiler ved hjælp af billede analyse software som beskrevet i trin 3.7.
  6. i analyse skabelon, bruger følgende gating ordningen for identifikation af kolesterol partikler delpopulationer.
    1. På et plot af grønne kanal mættet pixel count (x-aksen) og mørkefelt kanal mættede pixeltal (y-aksen), afviser objekter med en eller flere mættede pixels i enten kanal.
    2. Plot objekter/partikler uden mættede pixel ved hjælp af grøn kanal intensitet (x-aksen) og SSC intensitet (y-aksen): objekter falder ind under en af tre regioner (VLDL, LDL, HDL) baseret på deres grønne kanal og SSC intensiteter.
      Bemærk: Disse porte blev skabt på grundlag af data genereret fra kontrol eksperimenter udført ved hjælp af renset af VLDL, LDL og HDL af partikler/proteiner uden stoffet.
  7. For at bestemme den lipid-sænkende medicin effekt for hver prøve, beregne samlede lipoprotein partikler koncentrationer, som procentdelen af hver af de delpopulationer (VLDL, LDL, HDL) som beskrevet i trin 6.5.
    1. Beregn partiklen koncentrationer (partikler/mL) ved hjælp af følgende ligning:
      Equation
      NOTE: The VLDL, LDL og HDL gating regioner i fluorescens dot-plot opdage ~ 80% af deres respektive delpopulationer, og de resterende ~ 20% af partiklerne overlapper med andre gating områder.

5. Måling af Lipid koncentrationer i serumprøver

  1. til bestemmelse af koncentrationer af LDL, HDL, kolesterol og triglycerider af kemi analysator-2, bruge serumprøver fra alder-matchede normal og dyslipidæmi emner.
  2. Definerer unormal koncentration af LDL, HDL, kolesterol og triglycerider baseret på deres koncentration identificeret ud over de øvre og nedre værdier i serumprøver.
  3. Følg normale reference værdi KommisDED af reagens producent: kolesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) og triglycerider (9-200 mg/dL).
  4. Identificere serumprøver, der har en unormal værdi som enten under referenceværdien på lavere eller over referenceplanet, højere værdi for kolesterol og triglycerider, og bruge dem til screening i tilstedeværelse og fravær af lipid-sænkende stoffer.

6. Analysere effekten af narkotika på kolesterol partikler dannelse i serumprøver

  1. brug af kemi analysator-1 at oprette plaque array assay for kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Udfør analysen i en rund bund, lav protein bindende 96-brønd plade. Bruge en endelig reaktion volumen af 200 µL/brønd og udføre alle assays i tre eksemplarer.
  2. Forberede pladen ved at indlæse reagenser i en trinvis måde.
    1. Forberede kontrolhullerne.
    2. Belastning 193 µL af PBS i hvert hul.
    3. Tilføje 2,5% (v/v) patientens serum (kun én serumprøven pr. brønd) og ryst plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator reaktion plade.
    4. Tilføje 2 µL (2 µg) af fluorescens-mærket kolesterol samlet løsning i hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.
  3. Forberede brønde med narkotika.
    1. Belastning 191 µL af PBS i hvert hul.
    2. Tilføje 2,5% (v/v) patientens serum (kun én serumprøven pr. brønd) og ryst plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.
    3. Tilføje 2 µL ezetimibe, lovastatin, simvastatin eller niacin løsning (4 µg) i alle pladens huller, undtagen negative kontrolhullerne. Tilføj kun ét stof pr. brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på en kemi analysator-1 reaktion plade.
    4. Tilføje 2 µL af fluorescens-mærket cholesterol samlede løsning (2 µg) i hver brønd og ryste plade for 30 s ved at placere det på kemi analysator-1 reaktion plade.
  4. Indlæse narkotika kun efter alle brønde (kontrol og stof-behandlede) har været fyldt med deres respektive serumprøver, og tilføje fluorescens-mærket kolesterol i slutningen af dette trin.
  5. Ruger plade i 2 timer i en lab shaker indstillet på 37 ° C og 200 rpm.
  6. Erhverve prøverne af imaging flow Flowcytometret følgende indstillinger beskrives i trin 3.1-3.6.
  7. Bruger billedet analyse software til batch-behandling alle image filer ved hjælp af den samme skabelon, som beskrevet i trin 3.7.
    1. Udføre en dataanalyse ved tegning gates på plottet, som beskrevet i trin 4.5 og 4.6.
  8. For at bestemme den lipid-sænkende drug effekt/reaktion (lav, moderat og høj) for hver prøve, beregne den samlede lipoprotein partikel koncentration samt procentdelen af den samlede partikler bestående af VLDL, LDL og HDL delpopulationer.
  9. Plot i VLDL, LDL og HDL befolkninger på et histogram af objektet ' s lysfelt billede, bredde fratrækkes længde (længde - bredde) og gate i enten kugleformede eller lineær regioner: objekter med (længde - bredde) ≤ 2 µm falder ind under den kugleformede region til beregning af procentdelen af kugleformede og lineær formede partikler.
  10. Sammenlign procentdelen af kugleformede og lineær formet LDL og HDL kolesterol partikler identificeret for hvert serum prøve inkuberes med og uden hver enkelt drug. Blandt tredobbelt værdier opnået for hver serumprøven, acceptere procentdelen af kugleformede og lineær formet LDL og HDL partikler, der falder inden for SD ±2 interval for bestemmelse af narkotikamisbrug effekt.

Representative Results

Plaque Array Assay baseret analyse af Lipid-sænkende narkotika virkninger på kolesterol partikler dannelse:

For at vurdere effekten af statiner i modulerende morfologi af kolesterol partikler, var fluorescerende-mærket kolesterol aggregater individuelt inkuberes med lovastatin, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin og fluvastatin i bufferen. Alle disse prøver er anskaffet ved hjælp af billedbehandling flowcytometri for at fange billeder af kolesterol partikler for morfologi analyse som vist i figur 1 og figur 2. Interessant, angivet analysere drug indvirkning på kolesterol partikler dannelse i buffer at lovastatin og simvastatin atorvastatin inducere dannelse af en heterogen population af kolesterol partikler visning af forskellige størrelser og former, Figur 3a -c. Omvendt, kolesterol partikler dannet i overværelse af rosuvastatin, fluvastatin, og den negative kontrol (uden lægemidlet) var ensartet i form og morfologi som vist i figur 3d-f. Derudover blev det observeret, at lovastatin og simvastatin atorvastatin induceret dannelse af kolesterol partikler udstiller begge kugleformede og lineær strand morfologier, rosuvastatin og fluvastatin fremkaldte dannelsen af kolesterol partikler med kun kugleformede morfologi. Statiner effekt på overtalelse lineær tråde dannelse blev fundet omkring 16% for lovastatin, 2% for simvastatin og 0,2% for atorvastatin.

For at yderligere evaluere effekten af lipid-sænkende stoffer på partikler dannelse, var fluorescerende-mærket kolesterol aggregater individuelt inkuberes med ezetimibe, fibrate, niacin, og omega-3 fedtsyrer. Som observeret med statiner, induceret disse stoffer dannelse af kolesterol partikler med heterogene størrelser og figurer som vist i figur 4a-d. Blandt dem, ezetimibe induceret dannelse af kolesterol partikler udstiller begge kugleformede og lineær strand morfologier, hvorimod fibrate, niacin, og omega-3 fedtsyre induceret dannelse af eneste kugleformede-formet kolesterol partikler. Derfor, effekten af lægemidler på den lineære strand formet kolesterol partikler dannelse var omkring 3% for ezetimibe, 0% for fibrate, 0% for niacin, og 0% for omega-3 fedtsyrer.

Den morfologisk analyse afslørede hvert kugleformede eller lineær strand formet kolesterol partikel er sammensat af mange mindre partikler knyttet sammen. Størrelser af fluorescerende positive kugleformede kolesterol partikler identificeret er i rækken af ~ 2-30 µm2, størrelsen af de lineære formede partikler er i rækken af ~ 2-60 µm2.

Analysere effekten af Lipid-sænkende stoffer på renset VLDL og LDL partikler:

For at undersøge yderligere kolesterol partikler dannelse i overværelse af lipoproteiner, var fluorescerende-mærket kolesterol aggregater individuelt inkuberes med renset VLDL, LDL og HDL proteiner/partikler. Resultaterne viste, i forhold til inkubation med LDL og HDL partikler, at kolesterol aggregater inkuberes med VLDL proteiner forårsaget dannelsen af et højere antal kolesterol partikler, figur 5. Endvidere blev to store fraktioner af kolesterol partikler observeret i VLDL populationer tyder på deres delvis omdannelse til et LDL brøkdel under inkubation med fluorescerende-mærket kolesterol aggregater. Billedanalyse af partikler viste tilstedeværelsen af både kugleformede (~ 97%) og lineær formet (~ 3%) partikler blandt VLDL, LDL og HDL populationer. Intervallerne af kugleformede partikler er ~ 2-30 µm2, hvorimod intervallerne af lineære partikler er ~ 2-60 µm2.

For at undersøge den lipid-sænkende stoffer effekt på renset partikler, var VLDL og LDL partikler individuelt inkuberes med ezetimibe, lovastatin, simvastatin og niacin. Som et resultat, var sammenlignet med kontrol eksperimenter uden narkotika, narkotika effekt observeret på VLDL partikler dannelse højere i ezetimibe, simvastatin, lovastatin og niacin. LDL partikler inkuberes med narkotika viste en større enkelt fraktion og narkotika-induceret påvirkning partikler dannelse var højere i ezetimibe, simvastatin, lovastatin og niacin, figur 6.

Variationer af Lipid-sænkende narkotika effekter i at ændre fordelingen af kolesterol partikler i serumprøver:

De foregaaende forsøg blev udført i stødpudeopløsning med renset lipoproteiner til evaluering af effekten stof. Derfor, i det næste trin, effektiviteten af lipid-sænkende lægemidler på kolesterol partikler dannelse blev undersøgt ved hjælp af 50 serumprøver indsamlet fra 25 fag med dyslipidæmi og 25 alder-matchede normale individer. Drug svar i hver serumprøven blev målt baseret på ændringer i profilen for kolesterol partikler dannelse i tilstedeværelse og fravær af narkotika. I plaque array assay, blev hver serumprøven screenet af ezetimibe, lovastatin, simvastatin og niacin narkotika. Resultaterne viste forskel blandt disse stoffer i modulerende distribution af VLDL, LDL og HDL partikler i serumprøver, især deres indvirkning på at reducere LDL og øge HDL kolesterol partikler dannelse. Tre repræsentanter for dyslipidæmi serumprøver udstiller unikke svar til lipid-sænkende stoffer er vist i figur 7.

Identifikation af stof effekt på modulerende morfologi af Serum fremstillet LDL og HDL-kolesterol partikler:

Fænotype analyse af serum-afledt kolesterol partikler afslørede tilstedeværelsen af både lineære tråde og kugleformede formet VLDL, LDL, og HDL delpopulationer, hvilket bekræfter en lignende morfologi identificeret i forsøgene udført både i bufferen og med renset lipoprotein partikler som vist i figur 8. Men fordelingen af kugleformede og lineær formet kolesterol partikler delpopulationer bredt varieret blandt dyslipidæmi og alder-matchede normale individer. Især viste de kontrol-assays udføres uden narkotika forskelle i fordelingen af lineære strand formet LDL kolesterol partikler mellem dyslipidæmi (gennemsnit af 2,0%) og alder-matchede normal (gennemsnit 1,3%) serumprøver. Ligeledes en øget grad af lineære strand formet HDL kolesterol partikler blev observeret i dyslipidæmi prøver (gennemsnit af 18,3%) i forhold til alder-matchede (gennemsnit af 11,1%) serumprøver. I korrelation, assays udføres i nærværelse af narkotika i dyslipidæmi serumprøver viste en signifikant reduktion i lineære formet HDL kolesterol partikler dannelse for simvastatin (gennemsnit af 8,3%), ezetimibe (gennemsnit på 11,5%), lovastatin (gennemsnit på 11,7%), og ingen reduktion for niacin (gennemsnit af 18,3%). Derudover blev et fald i dannelsen af lineære formet LDL kolesterol partikler observeret i dyslipidæmi serumprøver når inkuberes med narkotika vises i tabel 1.

Desuden, assays udføres i nærværelse af narkotika i alder-matchede kontrol serum sampLes viste signifikant reduktion i den lineære formet HDL kolesterol partikler i simvastatin (middel 5,0%), ezetimibe (gennemsnitlig 8,2%), lovastatin (gennemsnitlig 8,7%) og niacin (Gennemsnitlig 10,8%) som vist i tabel 2. Både dyslipidæmi og alder-matchede normale serum prøver udstiller narkotika-induceret reduktion i de lineære formet LDL og HDL kolesterol partikler viste en relativ stigning i kugleformede formet kolesterol partikler (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Diagram illustrerer processen med in vitro- visualisering af kolesterol partikler morfologi. (a, b) Tilføjelsen af lipid-sænkende stoffer i buffer eller serumprøver. (c) tilsætning af fluorescens-mærket opløselige kolesterol aggregater til prøverne. (d) erhverve de resulterende prøver til morfologisk analyse af uopløselige kolesterol partikler ved hjælp af billedbehandling flowcytometri. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: identifikation af to særskilte morfologier kolesterol partikler ved hjælp af billedbehandling flowcytometri. (en) partikler er opdelt lineær eller kugleformede befolkning baseret på stoflige analyse af lysfelt billeder. Specifikt, dot-plot af betyde H homogenitet (x-aksen) og betyde H entropi (y-aksen) indeholder to indhegnede områder til påvisning af kugleformede (rød) og lineær strand formet (blå) kolesterol partikler. (b) billederne viser morfologi af kugleformede formede partikler identificeret i befolkningen 1. (c) billeder af lineære strand formede partikler identificeret i befolkningen 2. (d) histogrammet viser fordelingen af alle fluorescerende positive kolesterol partikler bruges til at bestemme deres koncentration og delpopulationer. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: billede gallerier vise effekt af statiner i modulerende kolesterol partikler dannelse. Lysfelt refererer til området ligner FSC i konventionel flow Flowcytometret. Grøn kanal refererer til fluorescens emission registreres i 505-560 nm, og gule channel refererer til fluorescens emission registreres i 560-595 nm. (a-e) Billedgallerier vise morfologi af kolesterol partikler dannet lovastatin, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin og fluvastatin, henholdsvis. (f) kolesterol partikler dannelse i mangel af statin (negativ kontrol). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: demonstrerer den differential virkning af lipid-sænkende stoffer i modulerende kolesterol partikler dannelse. (a-d) Billedgallerier vise morfologi af kolesterol partikler dannet ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fedtsyrer, henholdsvis. Grøn kanal refererer til fluorescens emission registreres i 505-560 nm, og gule channel refererer til fluorescens emission registreres i 560-595 nm. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: analyse af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i mangel af drug. Dot-plots: X-aksen viser et spektrum af kolesterol partikler blev fundet i den grønne fluorescens kanal (505-560 nm) og y-aksen viser side scatter. Gating viser regioner af VLDL, LDL og HDL partikler fundet i fluorescens dot-plots. (en) kolesterol partikler dannelse i overværelse af renset VLDL. (b) repræsentant billeder af VLDL partikler. (c) kolesterol partikler dannelse i overværelse af renset LDL. (d) repræsentant billeder af LDL partikler. (e) kolesterol partikler dannelse i overværelse af renset HDL. (f) repræsentant billeder af HDL partikler. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: demonstrere effekten af lipid sænke narkotika på renset VLDL og LDL kolesterol partikler. (en) VLDL partikler uden narkotika. (b) VLDL partikler inkuberes med ezetimibe. (c) VLDL partikler inkuberes med lovastatin. (d) VLDL partikler inkuberes med simvastatin. (e) VLDL partikler inkuberes med niacin. (f) LDL partikler inkuberes uden narkotika. (g) LDL partikler inkuberes med ezetimibe. (h) LDL partikler inkuberes med lovastatin. (jeg) LDL partikler inkuberes med simvastatin. (j) LDL partikler inkuberes med niacin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: fluorescens dot-plots viser en differentiel effekt af lipid sænke narkotika i modulerende VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i serumprøver. Øverste række, screening af serum 1 viser lavt niveau stof svar i stigende 0 til 15% HDL partikler dannelse; midterste række, screening af serum 2 viser moderat niveau stof svar i stigende 16 til 50% HDL partikler; Nederste række, screening af serum 3 viser højere niveau stof svar i stigende 51 til 100% HDL partikler. (a, f, k) Serumprøver uden narkotika. (b, g, l) Serumprøver inkuberes med ezetimibe. (c, h, m) Serumprøver inkuberes med lovastatin. (d, i, n) Serumprøver inkuberes med simvastatin. (e, j, o) Serumprøver inkuberes med niacin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Billedgallerier vise morfologi af kolesterol partikler identificeret i serum prøve 1. Grøn kanal viser billeder af fluorescens emission af partikler; side scatter (cyan kanal) viser billeder af excitation laser lys spredt af partikler. (en) kugleformede og lineær formet kolesterol partikler dannet uden narkotika. (b, c, d, e) Kolesterol partikler dannet ezetimibe, lovastatin, simvastatin og niacin, henholdsvis. Skala barer= 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Serum-ID Uden narkotika (kontrol) Med Ezetimibe Med Lovastatin Med Simvastatin Med Niacin
% Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler
PNDS-01 1.73 45,2 0,81 18.1 0,61 16.1 0,59 13,9 2.26 33.6
PNDS-02 2,86 35,9 1.26 30.9 1.27 22,7 0,73 15.2 3,03 37,7
PNDS-03 2.04 35.8 0.87 4,82 1,02 4.14 0,36 3,06 0,45 9.57
PNDS-04 2,56 32,9 1.15 21,8 1.12 18.6 0,77 17,2 3.37 36,5
PNDS-05 0,42 29.2 0,24 5,62 0,22 8.72 0,16 9.91 0,35 22,2
PNDS-06 1.8 28.1 0,4 16,8 0,62 15 0,42 9,27 2.28 38,4
PNDS-07 1.8 26,5 0,85 10.5 1.18 19,9 0,62 7,32 1.29 23,4
PNDS-08 0,98 22,8 0,86 7.28 1,55 10.2 0,14 5.98 0,59 13.3
PNDS-09 3,87 22,1 1,98 9.56 1,87 10.3 1,46 7,96 2,86 9.88
PNDS-10 4,46 21,9 2,57 13.6 4,04 17.1 2.28 11,9 0,71 25,7
PNDS-11 1.57 19.2 1.15 9,24 1,37 6.98 0,74 5,03 1,37 16
PNDS-12 1,06 16,7 0.66 4.38 0,7 4.74 0,99 6.36 1.14 4.73
PNDS-13 4,85 16.6 1.28 30,4 1.4 32.6 0,8 16.6 4,02 31
PNDS-14 2,08 16 0,68 15,4 0,64 16,5 1,97 10.2 1,25 20.11
PNDS-15 1.5 11,9 1.14 13.3 1.21 11.4 0,8 6.12 1.38 4.59
PNDS-16 mod 1,82 10.4 2.04 9,59 1.24 5,62 0,91 5.38 1.31 7.61
PNDS-17 1,05 10.3 1,02 4.7 1,78 15.1 0,93 7.81 1.27 13
PNDS-18 1.11 8.76 0,54 3.68 0,61 3.51 1,01 5,03 1,02 6.69
PNDS-19 1 8.52 0,75 6,67 0,76 5,86 0,91 8.36 1.22 11,9
PNDS-20 3,54 7,92 3,78 12 3,56 5.81 3.28 8.28 3.44 12.3
PNDS-21 1,88 7.69 2.12 11.4 1.73 9.54 1,77 8.34 2.32 16,7
PNDS-22 1,64 7.17 0,35 5,75 0,56 13.2 0,14 4.33 1.23 17,8
PNDS-23 1,54 6,27 1,25 7.24 1,02 6.12 0,73 3.58 1.42 6.69
PNDS-24 0,53 6,22 0,52 4.49 0,91 5.57 0,54 4.01 0,65 10.5
PNDS-25 2.97 5.1 1,59 11 1,88 9 1,03 6,54 2,61 29.1

Tabel 1: Screening af dyslipidæmi serumprøver i plaque array analysen viser den differentierede virkning af lipid-sænkende stoffer. I forhold til kontrol uden narkotika (kolonne 2, 3), inkuberes serumprøver med ezetimibe (kolonner 4, 5), lovastatin (kolonner 6, 7), simvastatin (kolonner 8, 9), og niacin (kolonne 10, 11) viste variationer på overtalelse lineær-formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse.

Serum-ID Uden narkotika Med Ezetimibe Med Lovastatin Med Simvastatin Med Niacin
% Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler % Lineær, LDL partikler % Lineær, HDL partikler
PNAN-01 2,05 26,8 0,62 11,9 0,56 16,9 0,52 9.28 1.4 11,9
PNAN-02 1,35 26,3 1,68 21,8 2,59 23,6 0,79 6,92 2.16 29,7
PNAN-03 2.4
24,9 0,53 7,54 0,57 13.8 0,55 5,82 1.7 4,71 PNAN-04 1.99 21,5 1,54 9.45 1,56 8.25 0.31 3.74 2,88 20,8 mio. PNAN-05 1,77 18,8 1.49 6,03 1,65 5.5 0,54 4,67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0,67 4.42 2,68 13.3 0,5 2.37 1,54 16.3 PNAN-07 1,03 14.4 0,79 6.83 1.45 7.91 0,67 5.36 1.57 12 PNAN-08 0,98 14.3 0,88 4.48 2 7.1 0,19 2.66 1,02 18.1 PNAN-09 2,85 14.1 1,95 12,6 2.34 12.5 0,7 6,24 1,84 18.7 PNAN10 1,01 10.4 0,8 5,07 0,51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 PNAN-11 0,92 12.4 0,21 9.94 0,29 3.31 0,29 6,52 0,58 10.4 PNAN-12 0,6 10.5 0,56 5,78 1,06 4.74 0,4 3,32 0,91 11.8 PNAN-13 1,25 10.3 0,45 3,79 0,67 6,53 0,27 3.17 0,8 6.28 PNAN-14 1,03 9.86 1.12 8,51 1,05 6,91 0,6 5.94 1,05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1,93 10.4 2.14 8.86 1,56 6,84 2.31 8,61 PNAN-16 1,98 7.69 0,45 4.36 1 5,46 0,27 2.89 0,49 4.12 PNAN-17 1,72 6,72 0,75 14,8 0,74 9.26 0,49 5,58 1,98 12.8 PNAN-18 2,45 6,38 0,85 16,8 0.89 14.2 0,58 5.9 1.8 20,6 PNAN-19 1,67 5.12 0,58 8.63 0,65 5.7 0,64 8.8 1,88 2,08 PNAN-20 1.17 4.41 0,85 7.77 0,91 6.43 0,69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0.31 4.18 0,48 6.95 0,19 5.09 0,15 2.1 0,29 5,93 PNAN-22 0,77 4,02 1.24 7,41 0,61 5.02 0,29 3.49 0,42 3,98 PNAN-23 0,4 1,25 0,75 6,25 0,88 5.91 0,9 5.06 0,82 6.71 PNAN-24 0,45 1.1 0,63 2.5 0,55 5,32 0,9 4.3 0,71 3.5 PNAN-25 0,36 1 0,73 2.4 0.66 5.1 0,82 4 0,7 3.4

Tabel 2: Screening af alder-matchede kontrol serumprøver i plaque array analysen viser den differentierede virkning af lipid-sænkende stoffer. I forhold til kontrol uden narkotika (kolonne 2, 3), inkuberes serumprøver med ezetimibe (kolonner 4, 5), lovastatin (kolonner 6, 7), simvastatin (kolonner 8, 9), og niacin (kolonne 10, 11) viste variationer på overtalelse lineær-formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse.

Discussion

I almindelighed, bestemmes distribution og funktionelle egenskaber af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler i blodcirkulationen hovedsagelig af metaboliske, genetiske, epidemiologiske, cellulære og plasma faktorer22,23. I den foreliggende undersøgelse, undersøge virkningerne af lipid-ændring narkotika i bufferen afslørede, at meget lipofile stoffer som ezetimibe, lovastatin, simvastatin og atorvastatin induceret en højere niveau kompleksitet på morfologi af kolesterol partikler i forhold til den lavere niveau effekt observeret med stærkt hydrofilt rosuvastatin og fluvastatin narkotika. Disse resultater er i god aftale med vores tidligere undersøgelse beskriver en ikke-enzymatisk mekanisme baseret effekt af statiner i modulerende LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i buffer og serum prøver21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra nærværende undersøgelse åbenbaret en ikke-enzymatiske virkningsmekanisme af ezetimibe, niacin, fibrate, og omega-3 fedtsyre lægemidler, der kan spille en direkte rolle i modulerende kolesterol partikler dannelse. Det er muligt, at samspillet mellem medicin og kolesterol aggregater fører til samling af store størrelse kolesterol partikler, der er 2-60 µm2, udstiller kugleformede og lineær strand morfologier.

Desuden foreslå resultaterne ved hjælp af renset lipoprotein partikler interaktioner mellem kolesterol aggregater og plasma faktorer herunder VLDL, LDL og HDL proteiner, der kan ændre kompositioner og morfologiske egenskaber af kolesterol partikler. Stof behandlingsresultater der involverer renset lipoprotein partikler viste et højere niveau stof effekt på VLDL partikler dannelse i forhold til deres effekt observeret på LDL kolesterol partikler dannelse. Lovastatin og simvastatin ezetimibe narkotika blev brugt som pro-stoffer og deres doser i assays kan være højere end de fysiologiske koncentrationer.

Interessant, formet screening af serumprøver viste variationer af narkotikamisbrug effekt på at ændre profiler af VLDL, LDL og HDL kolesterol partikler dannelse, især deres indvirkning på formationer af lineære LDL og HDL partikler. Disse stoffer induceret reduktion på lineære formet LDL og HDL kolesterol partikler dannelse i både dyslipidæmi og alder-matchede normale serumprøver. Narkotika effekter observeret på at reducere lineær formede partikler dannelse var højere i simvastatin, ezetimibe, lovastatin og niacin. Identifikation af kolesterol partikler med kugleformede og lineær strand morfologier i serumprøver normal og dyslipidæmi tyder på, at partikler med lignende morfologier kan danne i vivo betingelser. Tidligere undersøgelser har identificeret tilstedeværelsen af disken og nål-lignende kolesterol krystaller i de aterosklerotiske plaques af menneskelige og ApoE- /- og LDLR- / - mus modeller24,25,26 ,27,28.

HDL partikler cirkulerer i blodet findes som en heterogen blanding og niveauet af små og store størrelse HDL partikler sammen med funktionelle aktivitet er vigtige faktorer til at udøve deres cardio-beskyttende virkning via reverse kolesterol transport vej29,30. Nylige undersøgelser har fremhævet betydningen af at identificere HDL kolesterol partikel subfractions for belyse deres rolle i flere biologiske funktioner såsom cholesterol efflux, anti-betændelse, anti-trombotiske og anti-oxidative31 . Derudover har en række undersøgelser rapporteret effekten af lipid-sænkende behandling i stigende en lav til moderat niveau af HDL i plasma1,5,21. I overensstemmelse hermed, resultaterne fra denne undersøgelse giver ny indsigt om morfologiske træk af kolesterol partikler. Navnlig, påvisning af en højere grad af lineære formet HDL kolesterol partikler i serumprøver af dyslipidæmi fag tyder på, at de kan være den pålidelige biomarkør for både diagnose og evaluere virkningerne af lipid-ændring narkotika i patienter. Imidlertid yderligere er undersøgelse påkrævet ved brug af store klinisk prøver til bedre for at forstå kolesterol partiklerne med forskellige morfologier og deres tilknytning til CVD.

I plaque array analyse for at undersøge effekten stof på montering af kolesterol partikler, vi brugte 2 µg af fluorescens mærket kolesterol aggregater og 5 µgof hver enkelt drug fordi: (1) stoffer konkurrencedygtige binde til begge fluorescens mærket kolesterol og endogene lipider i serumprøver; (2) fra hver prøve erhvervet vi 5.000 til 10.000 kolesterol partikler, der er samlet i store størrelser og former fra ~ 2-60 µ2; (3) vi observeret en bred variationer af narkotika svar blandt serumprøver inkuberes med narkotika (doser 300 ng til 5 µg) og ~ 1-5% af dem inkuberes med høje doser viste ingen påviselige ændringer i profilen for kolesterol partikler dannelse; og (4) samspillet mellem kolesterol aggregater og lipid-sænkende stoffer er medieret af en ikke-enzymatisk proces. Koncentrationerne af de reagenser, der anvendes i analysen kan derfor være højere end deres fysiologiske niveau.

Afslutningsvis har vi med succes demonstreret fordele ved en in vitro- imaging metoden i denne undersøgelse til bestemmelse af effekten af et bredt spektrum af lipid-sænkende stoffer på modulerende morfologi og sammensætning af kolesterol partikler. Visualisere og kvantificere morfologi af lipid partikler ved at ansætte en konstellation af billede analyse algoritmer fremgangsmåde kan hjælpe både diagnosen af åreforkalkning og evaluere resultaterne af lipid-sænkende behandling hos patienter.

Disclosures

Dr. Madasamy modtaget tilskud fra Plaxgen, Inc og har en konkurrerende økonomisk interesse. Andre forfattere har ingen konkurrerende finansielle interesser til at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af en Plaxgen forskning tilskud tildeles SM (PLX-1008). Vi takker Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute for indsamling serumprøver fra åreforkalkning emner under IRB godkendelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measurement Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
  2. Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
  3. Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
  4. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
  5. Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
  6. Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
  7. Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
  8. Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
  9. Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
  10. Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
  11. Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
  12. Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
  13. Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
  14. McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
  15. Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
  16. Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
  17. Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
  18. Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
  19. Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
  20. Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
  21. Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
  22. Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
  23. Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
  24. Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
  25. Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
  26. Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
  27. Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
  28. Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
  29. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
  30. Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
  31. Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).

Tags

Medicin sag 129 kolesterol partikler morfologi lipid-sænkende medicin plaque array åreforkalkning imaging flowcytometri hjerte-kar-diagnose
Differential virkninger af Lipid-sænkende stoffer i modulerende morfologi af kolesterol partikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J.,… More

Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J., Alderete, B., Kong, R., Robinson, J. P., Wu, A. H. B., Amento, E. P. Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles. J. Vis. Exp. (129), e56596, doi:10.3791/56596 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter