Summary
本稿では dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTAV) の実験的プロトコルの修正と dimethyldithioarsinic 酸 (DMDTAV) の合成、DMAV の混合によってジメチルアルシン酸 (DMAV) なチオール化を誘導します。、Na2S と H24。修正されたプロトコルは、それにより定量分析における実験的障害を引き起こしている可能性が合成手順の制限の克服、実験ガイドラインを提供します。
Abstract
ジメチルアルシン酸 (DMAV) なチオール化の代謝経路によって生成される、dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTAV) などの欠損 thioarsenicals および dimethyldithioarsinic 酸 (DMDTAV) は最近ずっと環境だけでなく、人間の臓器で発見します。欠損 thioarsenicals と環境メディアの安定性の生態学的影響を判断する DMMTAV DMDTAVを定量化することができます。これらの化合物の合成法は標準化され、挑戦的な先行研究を複製することです。さらに、化合物種変換なしのストレージを含むストレージの技術についての情報の欠如があります。また、合成法について限られた情報のみが使用できる標準化学物質を合成し、定量分析を実行するのに実験的な困難がある可能性があります。ここに提示されたプロトコル欠損 thioarsenicals、DMMTAV DMDTAV、実質的に変更された合成方法を提供し、高速液体を使用して種の分離分析の定量化に役立つ誘導結合プラズマ質量分析法 (高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS) と組み合わせてクロマトグラフィー。化学試薬、ろ過方法、ストレージの準備に焦点を当てたこの手順の実験の手順が変更されました。
Introduction
ジメチルアルシン酸 (DMAV)、急性毒性とメチル化と摂取1,2時なチオール化による遺伝毒性の両方を展示する実証されているなチオール化ヒ素の代謝経路は集中的にされて学びの in vitroとin vivoの両方3,4同様環境メディア (例えば、埋め立て地の浸出水)5,6のように。以前の研究で発見した両方が減少し、リビングの DMAVのチオール類縁体細胞、dimethyldithioarsinic 酸 (dimethylmonothioarsinic 酸 (DMMTAV)、例, dimethylarsinous 酸 (DMAIII)DMDTAV)7,8,9, 欠損 thioarsenicals DMMTAV他の無機または有機ヒ素10知られているより大きい毒性の展示など。猛毒の thioarsenicals の豊富さは深刻な環境影響を以来、彼らは人間および高い硫化水素の条件11の下で環境に危険をもたらす可能性があります。ただし、DMMTAV DMDTAV (トランス) 形成と環境中運命のメカニズムもさらなる研究が必要です。したがって、thioarsenicals の定量分析は、DMMTAV DMDTAVの環境への影響の理解を改善するために必要です。
標準的な化学物質は、定量分析の重要な条件です、DMMTAV DMDTAVの基準が他の種に種変換の高危険のための先行研究を複製することによって得ることが困難と要員の合成手順12。さらに、参照されるメソッドには、標準化学物質を合成し、定量分析を実行する実用的な困難につながる可能性があります制限があります。DMMTAV DMDTAV一般的で一定モル比1またはバブリング H2S4ガス DMAV 13, 14のソリューションを通じて、DMAVナ2S、H2を混合して用意しています。酸素の毒性が高く経験の浅いユーザーの制御が困難な H2S ガスの直接供給を使用して硫黄のバブリング法機能置換。逆に、上記混合法1DMMTAV DMDTAV環境研究5,6,12の定性分析に広く使用機能のなチオール化H2S のため直接と比較して4 DMMTAV DMDTAV、対象化学物質を生成する化学量論的制御を簡単に作り出す Na2S と H2を混合することによって生成された DMAVH2S ガスを使用します。
つながる可能性があります彼らの重要な実験手順のいくつかでこの研究展示の制限に記載されている混合法手順1,3,4,8,15参照実験に失敗しました。たとえば、特定溶媒 (すなわち、脱イオン水) 準備と抽出の詳細と合成のヒ素の結晶化が過剰省略または十分な細部で記述されていません。このような分散し、手順についての限られた情報が thioarsenicals と信頼性の定量化分析の一貫性のない形成につながる可能性があります。したがって、ここに開発された変更されたプロトコルは、DMMTAVと DMDTAV定量的種の分離分析と原液の合成について説明します。
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Protocol
1. DMMTAVの合成
-
化学準備とモル比混合 DMAVナ2S、H2SO4
注: DMAV: Na2S:H24 = 1:1.6:1.6- 40 mL の脱イオンと N2の DMAVの 5.24 g を溶解-パージ (少なくとも 30 分はパージ) 50 mL 遠心管中の水。
- Na2S·9H2O で 50 mL の脱イオンと N2の 14.41 g を溶解することにより Na2S 試薬を準備-250 mL フラスコに水を削除します。
- 準備 H2純水 40 mL に濃硫酸 (96%) の 3.3 mL を追加して4試薬だと N2-50 mL の遠心管中の水をパージします。
注: DMAVの最終的なモル比: Na2S:H2SO4 = 1:1.6:1.6 1,3,4,8,15。 - DMAVソリューション (ステップ 1.1.1) の準備 40 mL を 250 mL のフラスコ (ステップ 1.1.2) に含まれる Na2S 溶液 50 mL に追加します。DMAV 10 mL のパージされた水で管内を洗浄し、250 mL フラスコを同様にこれを追加します。
- ガラス管が装備 3 つ穴ゴム栓付けフラスコを閉じます。ガラスを使用して、N2ガス流入、流出と H2SO4液入口それぞれチューブします。フラスコを閉じた直後にフラスコに N2ガスの流れを許可します。
注: 反応液の表面に飛散することがなく流れにガス圧を維持しなければなりません。 - 耐酸性チューブ H2のガラス チューブにその4液入口 H2の準備の 40 mL を追加しに 50 mL 注射器を接続4ソリューション (1.1.3 ステップ)。H2の 40 mL を追加し、4ソリューションでは、ゆっくりと段階的に。
注意:硫酸を追加するには、時に白い煙が生成されます。換気ヒューム フードを使用します。 - 定期的に硫酸を加えている間フラスコ内で反応混合物の色の変化を監視します。だから、H2の 4-5 mL の間隔が値下がりしましたを維持4;混合物は、白い曇りのソリューションにする必要があります。
注: 急速な濃硫酸添加による瞬時の黄色い沈殿物があります。 - 1.1.4 のステップの始まりから 1 時間立っている反応液を確認します。
-
DMMTAV抽出液-液抽出法を用いて
- 1 時間後に、ジエチル エーテルの約 200 mL を含む, 漏斗に反応液を注ぐ。
- 5-10 分、活栓を切り替えることによって数回ガスを放出の漏斗を振る。
注: 合成 DMMTAVはジエチル エーテル (0.713 g·mL-1) の上位層に転送されます。
注意:ジエチル エーテルのガスは有害かもしれない換気ヒューム フードを使用します。 - 、ビーカーに反応液を収集し、個別にボトルの DMMTAVを含むジエチル エーテルを収集します。同じ, 漏斗に反応液を置き、reshaking の新鮮なジエチル エーテルの約 200 mL を追加します。1.2.2 - 1.2.3 の手順を 3 回繰り返します。
- もう一度、同じ, 漏斗にステップ 1.2.3 から収集したジエチル エーテルを注ぐし、約 100 mL の N2を追加-脱イオン水を削除します。5-10 分のために振るし、N2破棄-純水と純度のためジエチル エーテルの数 mL をパージします。ガラス シャーレ (160 mm の最小内径) と最小の高さ 50 mm で残りのジエチル エーテルを収集します。
- 種変換を防ぐために N2雰囲気グローブ ボックスにガラス シャーレを転送します。
注意:パス ボックスのコンセントを通じて真空ポンプに溶媒を抜けないことを確認します。 - Dimethylmonothioarsinate の白色沈殿物まで乾燥 (結晶化 DMMTAV) は、ガラス シャーレに形成されます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
-
合成 DMMTAVおよび記憶域の検証
- DMMTAVの結晶の白色沈殿物を取るとを測定し、総重量を記録します。
注意:硫化水素ガスを吸入しないように換気の良いヒューム フードやグローブ ボックスを使用します。 - ディゾルブ N2の 50 mL の DMMTAVを結晶化-脱イオン水をパージ、0.2 μ m のシリンジ フィルターを介して黄色の沈殿物をフィルター処理します。
- 現在使用されている DMAV合計は DMMTAV、すなわち≈9、649 mg As· に変換されますと仮定L-1。DMMTAV ≈1 mg· に原液を希釈します。L-1と ≈40 µg·エレクトロ スプレー イオン化を用いた検証解析 L-1質量 Spectromtery (MS)、高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS、それぞれ。
- DMMTAV m/z 155 ポジティブ イオン モードで、 m/zマイナス イオン モード (表 1) で 153 MS11,16とフラグメントを使用してのm/zを分析します。
注: m/z (表 1) の参照値を参照してください。 - 適切な溶離液条件による高速液体クロマトグラフィー-誘導結合プラズマ質量11,16,17原液の DMMTAVのクロマト グラムを分析および確認に記載されている保存時に大きなピークが検出、文学。
注: 合成 DMMTAVの純度は、1.3.5 のステップから解析結果を用いた計算する必要があります。 - 酸分解11後 ICP-MS を用いた総砒素濃度を分析し、合成 DMMTAV原液希釈倍率と次式のように純度を使用して真の DMMTAVの濃度を計算します。
濃度 (µg· として分析された合計L-1) ·希釈係数 ·純度 (%) = True DMMTAV DMMTAV原液 (µg· 濃度L-1) - 暗闇のなかでさらに定量的なスペシエーション分析18DMMTAV 4 ° C で原液を保存します。
- DMMTAVの結晶の白色沈殿物を取るとを測定し、総重量を記録します。
DMDTAVの合成
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化学準備とモル比混合 DMAVナ2S、H2SO4
注: DMAV: Na2S:H24 = 1:7.5:7.5- 40 mL の脱イオン水 50 mL 遠心管中の DMAVの 1.38 g を溶解します。
- ナ2250 mL フラスコ 50 mL の脱イオン水 S·9H2O の 18.01 g を溶解することにより Na2S 試薬を準備します。
- 40 mL の脱イオン水に濃硫酸 (96%) の 4 つの mL を追加して4試薬は 50 mL の遠心管に含まれるように H2を準備します。
注: DMAVの最終的なモル比: Na2S:H2SO4 = 1:7.5:7.51,3,4,8,15。 - DMAVソリューション (ステップ 2.1.1) の準備の 40 mL を 250 mL のフラスコ (ステップ 2.1.2) に含まれる Na2S 溶液 50 mL に追加します。DMAV 10 mL の脱イオン水で管内を洗浄し、250 mL フラスコを同様にこれを追加します。
- H2の準備の 40 mL を追加し、4ソリューション (2.1.3 ステップ)、ゆっくりとフラスコに、段階的に。
- 定期的に硫酸を加えている間フラスコ内で反応液の色の変化を監視します。だから、H2の 4-5 mL の間隔が値下がりしましたを維持4;混合物は、白/黄色曇りソリューションをする必要があります。
注: 急速な濃硫酸添加により瞬時の黄色い沈殿物があります。
注意:硫酸を追加するには、時に白い煙が生成されます。風通しヒューム フードを使用します。 - カバーなし一晩フラスコ反応液を維持します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
-
DMDTAV抽出固相抽出 (SPE) を用いた
- 一晩立って反応後 C18 シリンジを使用して反応液をトラップするためにシリカ系の SPE の入力フィルターは合成樹脂に DMDTAVです。
注意:換気ヒューム フードを使用します。 - 10 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.3) を準備するには、1 L の脱イオン水に酢酸アンモニウム 0.77 g を溶解します。10 mM 酢酸アンモニウムの十分な量を溶出吸着 DMDTAVを抽出する C18 シリンジ (ステップ 2.2.1) を介して。ガラス シャーレ (160 mm の最小内径) と最小の高さ 50 mm でフィルター処理されたアンモニウム酢酸を収集します。
- 種変換を防ぐために N2雰囲気グローブ ボックスにガラス シャーレを転送します。
注意:パス ボックスのコンセントを通じて真空ポンプに溶剤を抜けないことを確認します。 - Dimethyldithioarsinate の白色沈殿物まで乾燥ガラス シャーレに (結晶化 DMDTAV) を結成します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
- 一晩立って反応後 C18 シリンジを使用して反応液をトラップするためにシリカ系の SPE の入力フィルターは合成樹脂に DMDTAVです。
-
合成 DMDTAVおよび記憶域の検証
- 結晶 DMDTAV、白色の沈殿物を取るし、総重量は、測定の記録を測定します。
注意:硫化水素ガスを吸入しないように換気のヒューム フードやグローブ ボックスを使用します。 - ディゾルブ N2の 50 mL の DMDTAVを結晶化-パージされた脱イオン水 50 mL にチューブを遠心し、0.2 μ m のシリンジ フィルターを介して任意の沈殿物をフィルター処理します。
- 現在使用されている DMAV合計は DMDTAV、すなわち≈2 539 mg As· に変換されると仮定します。L-1。DMDTAV ≈1 mg· に原液を希釈します。L-1と ≈40 µg·それぞれ MS と高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS を用いた検証解析 L-1 。
- DMDTAV m/z 171 ポジティブ イオン モードで、 m/zマイナス イオン モード (表 1) で 169 ESI MS11,16とフラグメントを使用してのm/zを分析します。
注: m/z (表 1) の参照値を参照してください。 - 適切な溶離液条件による高速液体クロマトグラフィー-誘導結合プラズマ質量11,16,17原液の DMDTAVのクロマト グラムを分析し、「保持時間ピークがあることを確認文学。
注: 合成 DMDTAVの純度は、2.3.5 のステップから解析結果を用いた計算する必要があります。 - 酸分解11後 ICP-MS を用いた総砒素濃度を分析し、次の式として希釈倍率と純度を使用して合成の DMDTAV在庫ソリューションで真の DMDTAV濃度を計算します。
濃度 (µg· として分析された合計L-1) ·希釈係数 ·純度 (%) = True DMDTAV DMDTAV原液 (µg· 濃度L-1) - 暗闇のなかでさらに定量的なスペシエーション分析18DMDTAV 4 ° C で原液を保存します。
- 結晶 DMDTAV、白色の沈殿物を取るし、総重量は、測定の記録を測定します。
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Representative Results
DMMTAVは、誤って DMAIII合成法19によって準備されている、合成 DMMTAV DMDTAVの検証は合成、抽出と理想的な基準を決定するための重要なステップ化学物質。合成化学物質はピークの DMMTAV (MW 154 g·mol-1)、エレクトロ スプレー イオン化質量のいずれかの正または負のイオン モードを使用して DMDTAV (170 MW g·mol-1) 質量電荷比 (m/z) で確認できます。リアルタイムの射出装置 (MS)。M/zの基準値は、表 1の19に表示されます。高速液体クロマトグラフィー-ICP-さん図 1 を使用して参照データに主要なピークの保持時間 (RT) の種の分離分析結果を比較することによって DMMTAV DMDTAVの成功の合成の追加検証を行った溶離液と C18 液体クロマトグラフィー (LC) として 5 mM ギ酸の 1.0 mL·min-1を使用してメジャーとマイナー ピーク、DMAVと DMMTAV (図 1 a)、DMDTAV (図 1 b) のような RT を示しています17で説明されているように列。主要なピークの RT がインストゥルメンタルと溶離液条件とで使用する LC の列によって異なる場合があります注意してください。DMMTAV DMDTAVの原液に含まれている種は、このプロトコルは、暗闇の中で、合成の DMMTAVと DMDTAを維持で 4 ° C の貯蔵条件を示唆しているすべての分析の前に検討すべきVと、分析 (図 2) の 13 週の間に、それぞれ 2.2% 5.8% と変換。
図 1: 合成の DMMTAV DMDTAVの高速液体クロマトグラフィー-ICP-MS のクロマト グラム。1: DMAV2: DMDTAV、および 3: DMMTAV Liらによって報告されたそれらに対応した 3.8 分、5.9 分、各 a: DMMTAVの貯蔵液および b: DMDTAV、8.0 分で主要なピークとして測定しました。201017。インストゥルメンタル ICP-MS のコンディションには、1550 V RF 電力と 50 μ L 注入量が。C18 カラムは、溶離液17として 5 mM ギ酸で使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DMMTAV DMDTAV暗闇の中で 4 ° C で安定性。13 週間の原液 DMMTAV (、) と DMDTAV (b) のそれぞれの種の分布の割合変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 原液を合成 | イオン モード | フラグメント | m/z | 参照 |
| DMMTAV | 肯定的です | [Me2As (SH) ああ] + | 155 | 13,14,19,17,21,24 |
| [Me2As (OH) 2] + | 139 | 19,17 | ||
| [Me2AsS] + | 137 | 13,19,17,24 | ||
| [Me2As (S) SAsMe2] + | 275 | 13 | ||
| 否定的です | [Me2AsOS]- | 153 | 17,5,23 | |
| [MeAsSO]- | 138 | 17, 5 | ||
| [朝来]- | 123 | 17, 5 | ||
| DMDTAV | 肯定的です | [Me2As (SH) 2] + | 171 | 19,17 |
| [Me2As (SH) ああ] + | 155 | 19 | ||
| [Me2AsS] + | 137 | 19,17 | ||
| 否定的です | [Me2AsS2]- | 169 | 20,17,5,22 | |
| [MeAsS2]- | 154 | 20,17,5 | ||
| [AsS2]- | 139 | 17,5,22 |
表 1: ESI さんの正または負のイオン モードで合成の DMMTAV DMDTAV、およびマイナーなフラグメント イオンの構造を提案した DMMTAVDMDTAV、およびマイナーなフラグメントm/z ESI-質量分析法による測定のリストは文献5,13,14,17,19 から再現しました。 ,,2021,22,23,24。楽器の条件および/または溶液の行列をm/zピークが異なることがありますに注意してください。
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Discussion
開発されたプロトコルが重要なステップ、前研究1,3,4,8,15省略または省略する難しさまたは中の障害になった可能性を明らかにDMMTAV DMDTAVの合成。DMMTAVは酸化に敏感な1、5その合成のための化学試薬調製 N2-DMAVの可能な遅滞を防ぐために脱イオン水 (ステップ 1.1.1 - 1.1.3) を削除なチオール化、DMMTAVの酸化。このプロトコルを使用して作製した DMMTAV 92% の純度を持っていた。参照 DMDTAV抽出法特集シリカ系 C18 カラム抽出アンモニウム酢酸またはリン酸緩衝液で溶離液、3,4,7,8参照研究3,4、8に記載はいない使用、列コンパートメントによって変動する従って準備 DMDTAVの純度。開発されたプロトコル (手順 2.2.1) で使い捨ての SPE が 88% の抽出に使用対照的に、純粋な DMDTAV。また、以前の DMDTAVの結晶化の方法のみ凍結乾燥手順20, を参照に対しこのプロトコル、単純な抽出 DMDTAV液 N2グローブの中の雰囲気の中での乾燥でボックス (手順 2.2.3) は、結晶 dimethyldithioarsinate の白い残留物を生産しました。
合成 DMMTAV DMDTAVの本人確認は、理想的な標準的な化学を決定するための重要なステップです。私たちの前で16 m/zポジティブ イオン モードで 155 で主要なフラグメントは、この議定書に基づくし、 m/zマイナス イオン モードで 169 として合成した DMMTAV DMDTAV、ESI 質量分析によって検出されました。それぞれ。後者のフラグメントのせいにしたいた [CH3]2AsS(=S) S]- (すなわち、[M-H]-)、以前結果5,17,20,22 とよく一致As(=S)(OH) + H、 m/z 155 でフラグメントが [CH3]2に割り当てられていたに対し、]+ (すなわち、[M + H]+)、再度、同意してを13,14、参照 17,19,21,24。DMMTAV DMDTAV在庫ソリューション高速液体クロマトグラフィー-誘導結合プラズマ質量によって得られたクロマト グラムの主要なピークが李らによって報告されたものと比較された ESI 質量分析が唯一の検証方法として使用できない、17 (図 1)。DMAIIIは、DMMTAV形成1,7,8,25の初期の段階で生成された中間物として知られているが、消えて、低安定性を発揮します。70 分19内したがってこのプロシージャ (図 1) によって検出不可能であります。
本研究のもう一つの目的は、DMMTAV DMDTAV少ない不純物を含む溶液硫化・酸化物の変換を妨げる、従って大きい安定性18を達成するための貯蔵条件を提案します。ここで使用されるストレージ条件 (すなわち、暗闇の中で 4 ° C) は、合成 DMMTAV DMDTAVの保全を主要種とを観測された急激な分解をしないと 4 週間の在庫ソリューション (図 2) で許可されます。後でさえも 13 週間。溶媒の pH (すなわち、脱イオン水) ネイティブ10と HS-など H2 化学試薬由来過剰硫化種の存在のために貯蔵の間に種の変換に影響を与える可能性がありますS、在庫ソリューションを維持 (図 2)、そこに含まれる種の大きな変革せず中性。したがって、定量的なスペシエーション分析の前に 13 週間、暗闇の中で 4 ° C で原液を格納できます。
この研究では、DMMTAV DMDTAV 1,3,4,8,15合成参照モル比混合方法を安定した DMMTAV を生成する修正しましたと高速液体クロマトグラフィー ICP-MS 定量分析のための DMDTAV在庫ソリューション。化学試薬調製、抽出、および結晶化の手順だけでなく DMMTAV DMDTAVの貯蔵条件を含む、重要なステップの詳細の不足のため原液は変更して最適化されていた。したがって、このプロトコルを使用して準備在庫ソリューションは、環境監視用 DMMTAV DMDTAVの定量分析のため十分に適用。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、基礎科学研究プログラムによって支えられた (プロジェクト番号: 2016R1A2B4013467) を通じて国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省 ICT ・将来計画 2016 によって資金を供給し、韓国基礎科学でもサポートされています。研究プログラム研究所 (プロジェクト番号: C36707)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cacodylic acid | Sigma-Aldrich | 20835-10G-F | |
| Sodium sulfide nonahydrate | Sigma-Aldrich | S2006-500G | |
| Sulfuric acid 96% | J.T.Baker | 0000011478 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A7262-500G | |
| Formic acid 98% | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 066-00461 | |
| Diethyl ether (Extra Pure) | Junsei Chemical | 33475-0380 | |
| Adapter cap for 60 mL Bond Elut catridges | Agilent Technologies | 12131004 | Syringe type of SPE |
| Bond Elut C18 cartridge | Agilent Technologies | 14256031 | Syringe type of SPE |
| HyPURITY C-18 | Thermo Scientific | 22105-254630 | 5 um, 125 x 4.6 mm |
| Glovebox | Chungae-chun, Rep. of Korea | Customized | |
| Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC | Agilent Technologies | DEAB600252, DEACH00245 | |
| Agilent Technologies 7700 Series ICP-MS | Agilent Technologies | JP12031510 | |
| Finnigan LCQ Deca XP MAX Mass Spectrometer System | Thermo Electron Corporation | LDM10627 |
References
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