Neurodevelopmental प्रक्रियाओं जैसे प्रसार, प्रवासन, और neurite की वृद्धि अक्सर neuropsychiatric रोगों में परेशान हैं । इस प्रकार, हम तेजी से प्रोटोकॉल वर्तमान और reproducibly मानव iPSC-व्युत्पंन NPCs में इन neurodevelopmental प्रक्रियाओं का आकलन । इन प्रोटोकॉल भी प्रासंगिक विकास कारकों और चिकित्सकीय एनपीसी विकास पर प्रभाव के आकलन की अनुमति ।
मानव मस्तिष्क विकास ठीक आर्केस्ट्रा प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से आय, पहले प्रसार, प्रवासन, और neurite वृद्धि से प्रतिष्ठित चरणों के साथ; और बाद के चरणों axon/dendrite वृद्धि और synapse गठन की विशेषता । neurodevelopmental विकारों में, अक्सर एक या इन प्रक्रियाओं के अधिक बाधित कर रहे हैं, मस्तिष्क के गठन और समारोह में विषमताओं के लिए अग्रणी. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, शोधकर्ताओं ने अब मानव कोशिकाओं है कि वस्तुतः किसी भी कोशिका प्रकार, ंयूरॉंस सहित में विभेदित किया जा सकता है की एक प्रचुर मात्रा में आपूर्ति की है । इन कोशिकाओं को सामान्य मस्तिष्क विकास और रोग रोगजनन दोनों का अध्ययन किया जा सकता है. hiPSCs मॉडल neuropsychiatric रोग का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का एक नंबर टर्मिनल विभेदित ंयूरॉंस का प्रयोग करें या 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग organoids । जबकि ये विधियां मानव रोग रोगजनन के अध्ययन में अमूल्य सिद्ध हुई हैं, इसमें कुछ कमियां हैं । न्यूरॉन्स और organoids की पीढ़ी में hiPSCs का भेदभाव लंबा और महंगा प्रक्रियाओं है कि प्रयोगों और चर का आकलन किया जा सकता है की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, जबकि पोस्ट-mitotic न्यूरॉन्स और organoids dendrite की वृद्धि और synaptogenesis सहित रोग-संबंधी प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं, वे प्रसार और प्रवास जैसे पहले प्रक्रियाओं का अध्ययन बाधा । ऐसे आत्मकेंद्रित के रूप में neurodevelopmental विकारों में, प्रचुर मात्रा में आनुवंशिक और पोस्टमार्टम सबूत जल्दी विकास प्रक्रियाओं में दोषों का संकेत है । तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (NPCs), एक उच्च प्रफलन कोशिका आबादी, एक उपयुक्त मॉडल है जिसमें ontogenetic प्रक्रियाओं और रोग दीक्षा के बारे में सवाल पूछने के लिए हो सकता है । अब हम मानव NPCs के लिए माउस और चूहे cortical संस्कृतियों में विकास का अध्ययन करने से सीखा के तरीके का विस्तार । NPCs का उपयोग हमें रोग से संबंधित phenotypes की जांच करने और परिभाषित कैसे विभिंन चर (जैसे, विकास कारकों, दवाओं) प्रभाव प्रसार, प्रवास सहित विकास प्रक्रियाओं, और केवल कुछ ही दिनों में भेदभाव की अनुमति देता है । अंततः, इस toolset एक reproducible और उच्च प्रवाह तरीके में इस्तेमाल किया जा सकता है neurodevelopmental विकारों में रोग विशेष तंत्र और phenotypes की पहचान ।
सरल जीवों और माउस मॉडलों के प्रयोग ने आधारभूत मस्तिष्क विकास के साथ-साथ रोग रोगजनन के तंत्र का आविर्भाव किया है. इन अग्रिमों के बावजूद, कई neuropsychiatric विकारों के एटियलजि मायावी रहता है क्योंकि सरल जीवों में नहीं सभी निष्कर्षों सीधे मानव रोग के जटिल पहलुओं के लिए प्रासंगिक हैं । इसके अलावा, मानव मस्तिष्क की अधिक से अधिक जटिलता अक्सर यह मुश्किल मानव विकास और पशुओं में विकारों के मॉडल के लिए बनाता है । विकास और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) प्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, दैहिक कोशिकाओं स्टेम कोशिकाओं में reऔर फिर मानव रोग का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है । hiPSCs में अग्रिम और “omic” प्रौद्योगिकियों (जीनोमिक्स, transcriptomics, प्रोटियोमिक्, metabolomics) मानव मस्तिष्क के विकास की समझ में क्रांतिकारी बदलाव के लिए वादा करता हूं । इन प्रौद्योगिकियों अब संभव एक “सटीक चिकित्सा” neuropsychiatric रोग के लक्षण वर्णन करने के लिए एक मामले पर दृष्टिकोण के आधार पर बनाते हैं ।
hiPSC रोग-मॉडलिंग क्षेत्र में वर्तमान प्रधान एक monolayer में विशिष्ट न्यूरॉन उपप्रकार में कोशिकाओं को अंतर करने के लिए या एक 3 डी संस्कृति प्रणाली मस्तिष्क विकास के दोहराऊंगा पहलुओं के लिए एक organoid बुलाया का उपयोग करने के लिए है1,2, 3. इन प्रणालियों का अध्ययन और मानव विकास और रोग4,5,6,7के अद्वितीय पहलुओं को उजागर करने में अविश्वसनीय रूप से मूल्यवान है । हालांकि, दोनों ंयूरॉंस संस्कृतियों और organoids अक्सर कहीं भी हफ्तों से संस्कृति में महीनों के लिए आवश्यकता से पहले वे अध्ययन के लिए तैयार हैं । इन प्रोटोकॉल की समय लेने वाली प्रकृति और इन संस्कृति प्रणालियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक संसाधनों की मात्रा अक्सर किया जा सकता है कि प्रयोगों की संख्या सीमित और चर की संख्या (जैसे विकास कारकों या दवाओं) है कि परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, कई अध्ययनों के बाद उपयोग mitotic न्यूरॉन्स और organoids ऐसी dendrite वृद्धि या synapse गठन, जो बाद में विकास में होने के रूप में प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि इन प्रक्रियाओं को ऐसे आत्मकेंद्रित और एक प्रकार का पागलपन के रूप में विकासात्मक विकारों की विकृति में फंसाया गया है, पहले विकास की घटनाओं है कि निश्चित ंयूरॉन भेदभाव से पहले होते है रोग रोगजनन के लिए भी महत्वपूर्ण है8 ,9,10,11,12,13. दरअसल, हाल के जीनोमिक अध्ययनों से पता चलता है कि मध्य भ्रूण अवधि, जो प्रसार के शामिल है, प्रक्रिया में वृद्धि, और प्रवास, autism रोगजनन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है11,14। इस प्रकार, यह तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए बेहतर इन पहले प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । Organoid प्रणालियों, जो अपने 3 डी प्रकृति और संगठित संरचना की वजह से बेहतर दोहराऊंगा मानव मस्तिष्क विकास के लिए विचार कर रहे हैं, एक जनक पूल है कि इन पहले की घटनाओं में से कुछ का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है शामिल । हालांकि, organoids में जनक जनसंख्या अक्सर विरल और अधिक तंत्रिका स्टेम या जनक कोशिकाओं से रेडियल glial कोशिकाओं की तरह है5,15. इस प्रकार, यह एक उच्च प्रवाह विधि के लिए एक सक्रिय रूप से प्रफलन कोशिका आबादी में neurodevelopment के प्रारंभिक दौर के अध्ययन के लिए फायदेमंद होगा ।
प्रयोगशाला में, हम एक प्रोटोकॉल है कि hiPSC-व्युत्पंन तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (NPCs), तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं है कि अत्यधिक प्रफलन है की एक मिश्रित जनसंख्या का उपयोग करता है बनाया है, प्रसार के रूप में neurodevelopmental प्रक्रियाओं का अध्ययन, सेल प्रवासन, और प्रारंभिक प्रक्रिया (neurite) एक्सटेंशन । इन परख हमारी प्रयोगशाला में दशकों के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों से विकसित करने के लिए सफलतापूर्वक चूहे और माउस cortical संस्कृतियों में neurodevelopment अध्ययन16,17,18,19,20, 21,22,23. महत्वपूर्ण रूप से, यह भी दिखाया गया है कि चूहे और माउस संस्कृति प्रणालियों में परिभाषित phenotypes और विनियामक संकेत तंत्र है कि vivo मेंसक्रिय है की अत्यधिक भविष्यवाणी कर रहे हैं, इन तकनीकों के मूल्य का संकेत16, १७,१८,१९,२४. NPCs के लिए hiPSCs के प्रारंभिक भेदभाव के बाद, इन तरीकों हमें दिनों के एक मामले में महत्वपूर्ण विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति । इन तरीकों कई फायदे हैं: (1) वे थोड़ा परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है और लागू करने के लिए आसान कर रहे हैं, (2) कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां समय की एक छोटी अवधि में आयोजित किया जा सकता है, परिणामों के reproducibility की तेजी से पुष्टि के लिए अनुमति, और (3) ऐसे कोटिंग मैट्रिक्स, विकास कारकों के प्रभाव के रूप में संस्कृति चर, और दवाओं की गतिविधि जल्दी और लागत प्रभावी ढंग से परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, हम विविध विकासात्मक प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में extracellular विकास कारकों की अच्छी तरह से स्थापित भूमिका का लाभ उठाते हैं । NPCs विकास संकेतों का चयन करें कि सीधे प्रसार, neurite वृद्धि, और सेल प्रवास की तरह घटनाओं को उत्तेजित कर रहे थे, और पाया है कि वे दोष है कि नियंत्रण की स्थिति में स्पष्ट नहीं है की पहचान करने की क्षमता में वृद्धि19 , 25 , 26 , 27 , 28. इसी तरह, दवाओं का आकलन करने की आसानी के लिए एक शक्तिशाली अवसर प्रदान करता है परिशुद्धता दवा तकनीक को अपनाने के लिए विभिंन चिकित्सीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता का परीक्षण । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल एक उच्च प्रवाह की सुविधा, reproducible, और सीधी पद्धति का अध्ययन करने के लिए जल्दी मस्तिष्क विकास, रोग रोगजनन, और neurodevelopmental phenotypes पर विकास कारकों और दवाओं के संभावित लाभकारी प्रभाव ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत त्वरित और सरल तरीकों को मौलिक neurodevelopmental प्रक्रियाओं और परीक्षण विकास कारकों और hiPSC का उपयोग कर दवाओं-व्युत्पंन तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उदाहरण देकर स्पष्ट…
The authors have nothing to disclose.
यह काम चिकित्सा अनुसंधान और Autism के उपचार के लिए ंयू जर्सी के गवर्नर परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), नैंसी Lurie मार्क्स परिवार फाउंडेशन, Mindworks धर्मार्थ नेतृत्व ट्रस्ट, और यहूदी समुदाय ग्रेटर MetroWest ंयू जर्सी के फाउंडेशन ।
PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |