Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)
Summary
Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.
Abstract
Le développement du cerveau humain procède par une série de précisément les processus orchestrés, avec des stades antérieurs se distingués par la prolifération, la migration et la croissance des neurites ; et des étapes ultérieures, caractérisées par la formation de l’excroissance et synapse axon/dendrite. Dans les troubles du développement neurologique, souvent un ou plusieurs de ces processus sont perturbés, conduisant à des anomalies dans la formation du cerveau et de la fonction. Avec l’avènement de la technologie (hiPSC) les cellules souches humaines pluripotentes induites, chercheurs disposent maintenant d’une offre abondante de cellules humaines qui peuvent être différenciés dans pratiquement n’importe quel type de cellule, y compris les neurones. Ces cellules peuvent être utilisés pour étudier le développement normal du cerveau et pathogenèse de la maladie. Un certain nombre de protocoles à l’aide de hiPSCs pour modéliser les maladies neuropsychiatriques utilisation en phase terminale différenciées des neurones ou utilisation systèmes 3D appelé organoïdes. Bien que ces méthodes sont révélés inestimables pour étudier la pathogenèse de la maladie humaine, il y a quelques inconvénients. Différenciation des hiPSCs dans les neurones et la génération d’organoïdes sont des processus longs et coûteux qui peuvent influer sur le nombre d’expériences et de variables qui peuvent être évalués. En outre, alors qu’organoïdes et neurones post-mitotiques permettent l’étude des processus liés à la maladie, y compris la croissance dendritique et synaptogenèse, ils s’opposent à l’étude des processus antérieurs tels que la prolifération et la migration. Dans les troubles du développement neurologique, comme l’autisme, abondantes preuves génétiques et post-mortem indiquent les défauts dans les processus de développement précoces. Les cellules précurseurs neurales (PNJ), une population de cellules hautement proliférante, peuvent être un modèle approprié permettant de poser des questions sur les processus ontogénétiques et initiation de la maladie. Nous étendons maintenant des méthodes tirées de l’étude de développement dans les cultures corticales souris et le rat à des PNJ humains. L’utilisation de PNJ nous permet d’enquêter sur les phénotypes liés à la maladie et de définir comment les différentes variables (p. ex., facteurs de croissance, médicaments) impact du développement processus y compris la prolifération, la migration et la différenciation en seulement quelques jours. En fin de compte, cet ensemble d’outils peut être utilisé de façon reproductible et haut débit afin d’identifier les mécanismes propres à la maladie et des phénotypes dans les troubles du développement neurologique.
Introduction
L’utilisation des organismes plus simples et des modèles de souris a élucidé les mécanismes de développement du cerveau de base ainsi que pathogenèse de la maladie. Malgré ces avancées, l’étiologie de nombreux troubles neuropsychiatriques reste insaisissable, parce que pas tous les résultats dans des organismes plus simples sont directement liées à des aspects complexes de la maladie humaine. En outre, la plus grande complexité du cerveau humain rend difficile le développement humain modèle souvent et troubles chez les animaux. Avec l’évolution et les progrès de la technologie (hiPSCs) des cellules souches humaines pluripotentes induites, les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches et puis se différencient en cellules neuronales pour étudier les maladies humaines. Percées dans les technologies hiPSCs et « omic » (génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique) promettent de révolutionner la compréhension du développement du cerveau humain. Ces technologies désormais rendent possible une approche de « médecine de précision » pour la caractérisation des maladies neuropsychiatriques sur une base de cas-par-cas.
L’aliment de base actuel en matière de modélisation des maladies hiPSC est à différencier des cellules en sous-types neuronales spécifiques dans une monocouche ou utiliser un système de culture 3D appelé un organoïde pour récapituler les aspects du cerveau développement1,2, 3. Ces systèmes ont été extrêmement précieux pour l’étude et de découvrir des aspects uniques du développement humain et maladie4,5,6,7. Toutefois, les cultures de neurones et organoïdes exigent souvent n’importe où de semaines à mois de culture avant qu’ils soient prêts à étudier. Le caractère chronophage de ces protocoles et le montant des ressources nécessaires pour maintenir que ces systèmes de culture limitent souvent le nombre d’expériences qui peuvent être effectuées et le nombre de variables (comme facteurs de croissance ou médicaments) qui peuvent être testés. En outre, de nombreuses études utilisant des organoïdes et des neurones post-mitotiques ont mis l’accent sur les processus tels que la formation de l’excroissance ou synapse dendrite, apparaissant plus tard dans le développement. Tandis que ces processus ont été impliqués dans la pathologie des troubles du développement comme l’autisme et la schizophrénie, plus tôt les événements développementaux qui surviennent avant la différenciation neuronale définitive sont également importants pour la pathogenèse de la maladie8 ,9,10,11,12,13. En effet, des études de génomiques récentes montrent que la période de mi-foetale, qui est composée de prolifération, l’excroissance des processus et la migration, est particulièrement importante dans l’autisme pathogenèse11,14. Ainsi, il est important d’étudier les souches neurales et populations de cellules progénitrices de mieux comprendre ces processus antérieurs. Organoïde systèmes, qui sont le développement du cerveau humain rappel réfléchie pour mieux en raison de leur nature 3D et la structure organisée, contiennent une piscine progénitrices qui a été utilisée pour étudier certains de ces événements antérieurs. Cependant, la population progénitrices dans organoïdes est souvent éparse et plus comme des cellules gliales radiales que neural souches ou progénitrices cellules5,15. Ainsi, il serait utile de prévoir une méthode de haut débit pour l’étude des premiers stades de développement neurologique dans une population de cellules prolifératives activement.
En laboratoire, nous avons créé un protocole qui utilise des cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC (PNJ), une population mixte de tige de neurones et des cellules progénitrices qui est hautement proliférante, d’étudier les processus neurologiques telles que la prolifération, la migration cellulaire, et extension du processus initial (neurites). Ces essais ont été mis au point des techniques utilisées dans notre laboratoire depuis des décennies à étudier avec succès développement neurologique en rat et souris cultures corticale16,17,18,19,20, 21,22,23. Ce qui est important, on a aussi montré que les phénotypes et les signaux réglementaires définies dans les systèmes de culture de rat et la souris sont très révélatrices des mécanismes qui sont actifs en vivo, indiquant la valeur de ces techniques16, 17,18,19,24. Après différenciation initiale de hiPSCs aux PNJs, ces méthodes nous permettent d’étudier les processus de développement vitales en quelques jours. Ces méthodes présentent de nombreux avantages : (1) qu’ils exigent un équipement peu sophistiqué et sont faciles à mettre en œuvre, (2) nombreuses répliques expérimentales peuvent être effectuées dans un court laps de temps, ce qui permet une confirmation rapide de la reproductibilité des résultats et (3) variables de culture telles que les matrices de revêtement, les effets des facteurs de croissance et l’activité des médicaments peuvent être testées rapidement et à moindre coût. Par ailleurs, nous profitons du rôle bien établi des facteurs de croissance extracellulaires comme régulateurs critiques des divers processus de développement. PNJ ont été exposés pour sélectionner les signaux du développement directement stimulent des événements tels que la prolifération, la croissance des neurites et la migration cellulaire et ont trouvé qu’ils améliorent la capacité à repérer les défauts qui ne sont pas évidents dans des conditions de contrôle19 , 25 , 26 , 27 , 28. de même, la facilité d’évaluation des médicaments fournit un moyen puissant pour adopter des techniques de médecine de précision pour tester l’efficacité de diverses interventions thérapeutiques. Ainsi, le présent protocole facilite un haut débit, reproductible et une méthodologie simple pour étudier le développement précoce du cerveau, pathogenèse de la maladie et les effets bénéfiques potentiels de facteurs de croissance et de drogues sur le développement neurologique des phénotypes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles présentés ici illustrent des méthodes rapides et simples pour étudier les processus fondamentaux de développement neurologique et de tester les facteurs de croissance et de médicaments à l’aide de cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC. hiPSC technologie a révolutionné l’étude de la pathogenèse des maladies neurologiques en nous fournissant un accès sans précédent à vivre les cellules neuronales humaines de personnes touchées. En effet, il y a eu de nombreuses études hiPSC de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le gouverneur du New Jersey Conseil pour la recherche médicale et le traitement de l’autisme (CAUT13APS010 ; CAUT14APL031 ; CAUT15APL041), Nancy Lurie marque la Fondation de la famille et la Fondation de la communauté juive de Greater MetroWest New Jersey Mindworks Charitable Trust de plomb.
Materials
| PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
| 6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
| 24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
| 35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
| 2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
| tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
| Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
| LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
| Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
| Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
| Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
| Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |
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