JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

Hurtig påvisning af udviklingsforstyrrelser fænotyper i menneskelige neurale forløber celler (NPC)

Published: March 02, 2018
doi:
10.3791/56628
, , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics,Rutgers University

Summary

Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, migration og neurite udvækst er ofte desorienterede i neuropsykiatriske sygdomme. Dermed, vi præsenterer protokoller for at hurtigt og reproducerbar vurdere disse Neuro-udviklingsmæssige processer i menneskelig iPSC-afledte NPCs. Disse protokoller tillader også vurdering af virkningerne af relevante vækstfaktorer og therapeutics på NPC udvikling.

Abstract

Menneskelige hjerne udvikling skrider frem gennem en serie af netop orkestreret processer, med tidligere stadier fornem spredning, migration og neurite udvækst; og senere stadier karakteriseret ved axon/dendrit udvækst og synapse dannelse. I nervesystemets udvikling, er ofte en eller flere af disse processer forstyrret, fører til abnormiteter i hjernen dannelsen og funktionen. Med fremkomsten af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nu en rigelig forsyning af humane celler, der kan opdeles i stort set enhver celletype, herunder neuroner. Disse celler kan bruges til at studere både normal hjernens udvikling og sygdom patogenese. Et antal protokoller ved hjælp af hiPSCs at modellere neuropsykiatriske sygdomme brug terminalt differentieret neuroner eller brug 3D kultur systemer betegnes organoids. Mens disse metoder har vist sig uvurderlige i at studere menneskelig sygdom patogenese, er der nogle ulemper. Differentiering af hiPSCs i neuroner og generation af organoids er lange og dyre processer, der kan påvirke antallet af eksperimenter og variabler, der kan vurderes. Hertil kommer, mens post mitotiske neuroner og organoids giver mulighed for undersøgelse af sygdom-relaterede processer, herunder dendrit udvækst og synaptogenesis, udelukker de undersøgelse af tidligere processer som spredning og migration. I nervesystemets såsom autisme, rigelige genetiske og post mortem tyder på, mangler i tidlige udviklingsprocesser. Neurale forløber celler (NPC), en meget proliferativ celle population, kan være en velegnet model til at stille spørgsmål om ontogenetiske processer og sygdom indledning. Vi udvider nu metoder lært af at studere udvikling i mus og rotter kortikale kulturer til menneskelige NPCs. Brug af NPCs tillader os at undersøge sygdomsrelaterede fænotyper og definere hvordan forskellige variabler (fx, vækstfaktorer, narkotika) indvirkning udviklingsmæssige processer herunder spredning, migrering og differentiering i kun et par dage. I sidste ende, dette værktøjssæt kan bruges i en reproducerbar og høj overførselshastighed måde for at identificere sygdoms-specifikke mekanismer og fænotyper i nervesystemets udvikling.

Introduction

Brug af enklere organismer og musemodeller har belyst mekanismerne af grundlæggende hjernens udvikling samt sygdom patogenese. Trods disse fremskridt stadig ætiologien af mange neuropsykiatriske lidelser undvigende fordi ikke alle resultater i enklere organismer er direkte relevante for komplekse aspekter af sygdomme hos mennesker. Yderligere, den større kompleksitet af den menneskelige hjerne ofte gør det vanskeligt at model menneskelig udvikling og lidelser i dyr. Med evolution og udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og derefter opdeles i neuronale celler til at studere sygdomme hos mennesker. Fremskridt i hiPSCs og “omic” teknologier (genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics) lover at revolutionere forståelse af menneskelige hjerne udvikling. Disse teknologier nu gøre muligt et “præcision medicin” tilgang til karakterisering af neuropsykiatriske sygdomme på et sag til sag grundlag.

Den nuværende hæfteklamme i feltet hiPSC sygdom-modellering er at differentiere celler i specifikke neuronal undertyper i en éncellelag eller bruge et 3D kultur system kaldet en organoid til at sammenfatte aspekter af hjernens udvikling1,2, 3. Disse systemer har været utrolig værdifuld i at undersøge og afdække unikke aspekter af menneskelig udvikling og sygdom4,5,6,7. Men både neuronal kulturer og organoids kræver ofte overalt fra uger til måneder i kultur før de er klar til at studere. Tidskrævende arten af disse protokoller og de nødvendige midler til at opretholde disse kultur systemer ofte begrænse antallet af eksperimenter, der kan udføres, og antallet af variabler (som vækstfaktorer eller narkotika), der kan testes. Desuden, mange undersøgelser bruger post mitotiske neuroner og organoids har fokuseret på processer såsom dendrit udvækst eller synapse dannelse, som opstår senere i udvikling. Mens disse processer har været impliceret i patologi af udviklingsforstyrrelser som autisme og skizofreni, er tidligere udviklingsmæssige hændelser, der indtræffer før endelige neuronal differentiering også vigtige for sygdom patogenese8 ,9,10,11,12,13. Ja, de seneste genomisk undersøgelser viser, at de midten af fostrets periode, som består af spredning, proces udvækst og migration, er særlig vigtigt i autisme patogenese11,14. Derfor er det vigtigt at studere neurale stamceller og stamfader cellepopulationer til bedre at forstå disse tidligere processer. Organoid systemer, der er anset for bedre at kunne sammenfatte menneskelige hjerne udvikling på grund af deres 3D karakter og organiseret struktur, indeholder en stamfader pool, der har været udnyttet til at studere nogle af disse tidligere hændelser. Men stamfader befolkningen i organoids er ofte sparsom og mere som radial gliaceller end neurale stamceller eller stamfader celler5,15. Det ville således være gavnligt at have en høj overførselshastighed metode til at studere tidlige stadier af nervesystemets udvikling i befolkningens aktivt proliferativ celle.

I laboratoriet, har vi lavet en protokol, der bruger hiPSC-afledte neurale forløber celler (NPC), en blandet befolkning af neurale stamceller og stamceller, der er meget proliferativ, at studere Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, celle migration, og indledende proces (neurite) forlængelse. Disse undersøgelser blev udviklet fra teknikker, der anvendes i vores lab i årtier at kunne studere nervesystemets udvikling i rotter og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Vigtigere, blev det også vist sig at fænotyper og regulerende signaler defineret i rotter og mus kultur systemer er meget intelligent af mekanismer, der er aktive i vivo, der angiver værdien af disse teknikker16, 17,18,19,24. Efter indledende differentiering af hiPSCs til NPCs, disse metoder giver os mulighed at studere vitale udviklingsmæssige processer i løbet af få dage. Disse metoder har mange fordele: (1) de kræver lidt avanceret udstyr og er nem at implementere, (2) talrige eksperimentelle replikater kan gennemføres i en kort periode, giver mulighed for hurtig bekræftelse af reproducerbarhed af resultaterne, og (3) kultur variabler som belægning matricer, virkningerne af vækstfaktorer og aktivitet af narkotika kan testes, hurtigt og omkostningseffektivt. Desuden, vi drage fordel af ekstracellulære vækstfaktorer veletableret rolle som kritiske regulatorer af forskellige udviklingsprocesser. NPCs var udsat for at vælge udviklingsmæssige signaler, der direkte stimulerer begivenheder som spredning, neurite udvækst og celle migration, og har fundet de forbedre evnen til at identificere mangler, der ikke er synlige i kontrol betingelser19 , 25 , 26 , 27 , 28. på samme måde at lette vurderingen af lægemidler giver en kraftfuld avenue for at vedtage præcision medicin teknikker for at teste effektiviteten af forskellige terapeutiske indgreb. Således, denne protokol giver en høj overførselshastighed, reproducerbar, og enkel metode til at studere tidlige hjernens udvikling, sygdom patogenese og de potentielle gavnlige effekter af vækstfaktorer og narkotika på udviklingsforstyrrelser fænotyper.

Protocol

1. sikkerhedsprocedurer og biosikkerhed kabinet vedligeholdelse Biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) sikkerhedsprocedurer Følg retningslinjerne for institutionens arbejde med BSL-2 materialer. Bortskaffe BSL-2 materialer ifølge institutionens praksis. Angive lokaler og udstyr, der bruges til BSL-2 materialer. Bære alle personlige værnemidler (PPE), herunder laboratoriekittel og handsker. Biosikkerhed kabinet vedligeholdelse Bruge en bio…

Representative Results

Ét mål af disse undersøgelser er at definere den proliferativ aktivitet af NPC’ere, dvs en stigning i celle antal. Dette opnås ved at vurdere DNA syntese af cellen total befolkning, en høj overførselshastighed tilgang, der måler iblanding af radioaktive sporstof tritiumholdigt thymidine i celle ekstrakter, og afspejler alle celler involveret i S-fase, uanset om de er syntese i 5 minutter eller hele to timer. Derudover tillade disse assays bestemmelse af andelen af celler, som angiv…

Discussion

Protokollerne præsenteres her illustrere hurtige og enkle metoder til at studere grundlæggende udviklingsforstyrrelser processer og teste vækstfaktorer og narkotika ved hjælp af hiPSC-afledte neurale forløber celler. hiPSC teknologi har revolutioneret studiet af patogenesen af udviklingsforstyrrelser sygdomme ved at forsyne os med hidtil uset adgang til levende menneskelige neuronale celler fra berørte personer. Faktisk har der været talrige hiPSC undersøgelser af nervesystemets udvikling herunder Rett syndrom, T…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af New Jersey guvernør Rådet for medicinalforskning og behandling af autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer Family Foundation, Mindworks velgørende bly tillid og jødiske samfund grundlaget for større MetroWest NJ.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Tags

Neural Precursor CellsNeurodevelopmental PhenotypesNeural DevelopmentCell CharacterizationCell CultureCell DetachmentCell HarvestingTritiated ThymidineCell ProliferationNeurodevelopmental DisordersNeuropsychiatric DisordersRapid And Reproducible Method

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image