JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Snabb upptäckt av neurologiska fenotyper i mänskliga neurala prekursorceller (NPC)

Published: March 02, 2018
doi:
10.3791/56628
, , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics,Rutgers University

Summary

Neurologiska processer som spridning, migration och neurite utväxt är ofta oroade i neuropsykiatriska sjukdomar. Således presenterar vi protokoll för att snabbt och reproducibly bedöma dessa neurologiska processer i mänskliga iPSC-derived NPCs. Dessa protokoll också att bedömningen av effekterna av relevanta tillväxtfaktorer och therapeutics på NPC utveckling.

Abstract

Mänskliga hjärnans utveckling fortskrider genom en serie av just iscensatt processer, med tidigare stadier kännetecknas av spridning, migration och neurite utväxt; och senare stadierna kännetecknas av axon/dendrite utväxt och synaps bildas. I nervsystemets utveckling störs ofta en eller flera av dessa processer, leder till avvikelser i hjärnans bildning och funktion. Med tillkomsten av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) teknik har forskare nu ett rikligt utbud av mänskliga celler som kan differentieras till praktiskt taget vilken celltyp, inklusive nervceller. Dessa celler kan användas för att studera både hjärnans normala utveckling och sjukdomspatogenes. Ett antal protokoll som använder hiPSCs att modellera neuropsykiatrisk sjukdom användning terminalt differentierade nervceller eller använda 3D kultur system kallas organoids. Medan dessa metoder har visat sig ovärderlig i studerar mänskliga sjukdomspatogenes, finns det vissa nackdelar. Differentiering av hiPSCs in i nervceller och generering av organoids är långdragna och kostsamma processer som kan påverka antalet experiment och variabler som kan bedömas. Dessutom, medan efter mitotiska nervceller och organoids gör studien av sjukdomsrelaterade processer, inklusive dendrite utväxt och synaptogenes, utesluter de att studera tidigare processer som spridning och migration. I nervsystemets utveckling, såsom autism, belägg riklig genetiska och post mortem defekter i tidiga utvecklingsprocesser. Neurala prekursorceller (NPC), en mycket proliferativa cell befolkning, kan vara en lämplig modell att ställa frågor om ontogenetiska processer och sjukdom initiering. Vi utökar nu metoder lärde sig från att studera utvecklingen i mus och råtta kortikala kulturer till mänskliga NPCs. Användning av NPC tillåter oss att undersöka sjukdomsrelaterade fenotyper och definiera hur olika variabler (t.ex., tillväxtfaktorer, droger) inverkan utvecklingsprocesser inklusive spridning, migration och differentiering i bara några dagar. Slutligen, denna verktygsuppsättning kan användas på ett reproducerbart och hög genomströmning sätt för att identifiera sjukdomsspecifika mekanismer och fenotyper i kind.

Introduction

Användning av enklare organismer och musmodeller har klarlagts mekanismer för grundläggande hjärnans utveckling samt sjukdomspatogenes. Trots dessa framsteg fortfarande etiologi av många neuropsykiatriska störningar gäckande eftersom inte alla fynd i enklare organismer är direkt relevanta för komplexa aspekter av mänskliga sjukdomar. Dessutom större komplexiteten i den mänskliga hjärnan ofta gör det svårt att modell mänsklig utveckling och sjukdomar hos djur. Med evolution och framsteg av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) teknik, kan somatiska celler omprogrammeras på stamceller och sedan differentieras efter neuronala celler att studera mänskliga sjukdomar. Framsteg inom hiPSCs och ”miska” teknik (genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik) lovar att revolutionera förståelsen av hjärnans utveckling. Dessa tekniker gör nu möjligt ett ”precision medicine” förhållningssätt till karakterisering av neuropsykiatrisk sjukdom på fall-till-fall basis.

Den nuvarande stapelvara i fältet hiPSC sjukdom-modellering är differentieras celler till specifika neuronala undertyper i en enskiktslager eller att använda ett 3D kultur-system som kallas en organoid för att recapitulate aspekter av hjärnans utveckling1,2, 3. Dessa system har varit otroligt värdefullt i att studera och avslöja unika aspekter av mänsklig utveckling och sjukdom4,5,6,7. Dock kräver både neuronala kulturer och organoids ofta någonstans från veckor till månader i kultur innan de är redo att studera. Tidskrävande naturen av dessa protokoll och mängden resurser som krävs för att upprätthålla dessa kultur-system ofta begränsa antalet experiment som kan utföras och antalet variabler (som tillväxtfaktorer eller droger) som kan provas. Dessutom har många studier använder efter mitotiska nervceller och organoids fokuserat på processer såsom dendrite utväxt eller synapsen bildning, som inträffar senare i utvecklingen. Medan dessa processer har varit inblandade i patologi utvecklingsstörningar såsom autism och schizofreni, är tidigare utvecklande händelser som inträffar innan slutgiltig neuronal differentiering också viktiga för sjukdomspatogenes8 ,9,10,11,12,13. Senaste genomisk studier visar faktiskt att perioden mitten-fetal, som består av spridning, processen utväxt och migration, är särskilt viktigt i autism patogenes11,14. Därför är det viktigt att studera neurala stamceller och stamceller cellpopulationer att bättre förstå dessa tidigare processer. Organoid system, som anses bättre recapitulate mänskliga hjärnans utveckling för sin 3D natur och en organiserad struktur, innehåller en stamcellspoolen som har använts för att studera några av dessa tidigare händelser. Dock stamceller befolkningen i organoids är ofta glesa och mer som radiella gliaceller än neurala stamceller eller stamceller celler5,15. Alltså, det skulle vara fördelaktigt att ha en hög genomströmning metod att studera tidiga stadierna av neuroutvecklingssjukdomar i ett aktivt proliferativa cell befolkningen.

I labbet, har vi skapat ett protokoll som använder hiPSC-derived neurala prekursorceller (NPC), en blandad befolkning av neurala stamceller och stamceller som är mycket proliferativ, att studera nervsystemets processer såsom spridning, cellmigration, och inledande processen (neurite) förlängning. Dessa testmetoder har utvecklats från tekniker som används i vårt labb under årtionden framgångsrikt studera neuroutvecklingssjukdomar i råtta och mus kortikala kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Ännu viktigare, det visades också att fenotyper och regulatoriska signaler definieras i råtta och mus kultur är starkt prediktivt för mekanismer som är verksamma i vivo, som visar värdet av dessa tekniker16, 17,18,19,24. Efter inledande differentiering av hiPSCs till NPC tillåter dessa metoder oss att studera avgörande utvecklingsprocesser i några dagar. Dessa metoder har många fördelar: (1) de kräver lite sofistikerad utrustning och är lätt att genomföra, (2) talrika experimentella replikat kan genomföras i en kort period av tid, vilket möjliggör snabb bekräftelse av reproducerbarheten för resultaten och (3) kultur variabler såsom beläggning matriser, effekter av tillväxtfaktorer och aktiviteten av läkemedel kan testas snabbt och kostnadseffektivt. Vi utnyttjar dessutom extracellulära tillväxtfaktorer väletablerad roll som kritisk regulatorer av olika utvecklingsprocesser. NPC utsattes Markera utvecklingsmässiga signaler som direkt stimulerar händelser som spridning, neurite utväxt och cellmigration, och har hittat de förbättra förmåga att identifiera brister som inte är uppenbara i kontroll villkor19 , 25 , 26 , 27 , 28. jämväl, lättheten att bedöma droger ger en kraftfull avenue för att anta precision medicin tekniker för att testa effekten av olika terapeutiska interventioner. Detta protokoll underlättar således en hög genomströmning, reproducerbara, och okomplicerad metod för att studera tidiga hjärnans utveckling, sjukdomspatogenes och de potentiella positiva effekterna av tillväxtfaktorer och droger på neurologiska fenotyper.

Protocol

1. säkerhetsrutiner och biosäkerhet skåp underhåll Säkerhetsrutiner för biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) Följ institutionens riktlinjer på arbeta med BSL-2 material. Kassera BSL-2 material enligt institutets praxis. Visa lokaler och utrustning som används för BSL-2 material. Alla personliga skyddsutrustning (PPE), inklusive labbrock och handskar. Biosäkerhet skåp underhåll Använd en biosäkerhet skåp certifierade för anv?…

Representative Results

Ett mål av dessa studier är att definiera NPC, det vill säga en ökning i cell nummer proliferativ verksamhet. Detta uppnås genom att bedöma DNA syntesen av befolkningens totala cell, en hög genomströmning metod som mäter införlivandet av radioaktivt spårämne tritiummärkt tymidin i cell extrakt, och återspeglar alla celler i S-fas, oavsett om de är syntetisera i 5 minuter eller hela två timmar. Dessutom tillåter dessa analyser bestämning av andelen celler som anger S-fas …

Discussion

De protokoll som presenteras här visar snabba och enkla metoder för att studera grundläggande neurologiska processer och testa tillväxtfaktorer och droger med hjälp av hiPSC-derived neurala prekursorceller. hiPSC tekniken har revolutionerat studiet av patogenesen av nervsystemets sjukdomar genom att förse oss med oöverträffad tillgång till levande mänskliga neuronala celler från drabbade individer. Faktiskt, det har varit många hiPSC studier av nervsystemets inklusive Rett syndrom, Timothy syndrom, Fragile-X …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av New Jersey guvernörens rådet för medicinsk forskning och behandling av Autism (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerar Family Foundation, Mindworks bly stiftelse och stiftelsen judiska gemenskapen av större MetroWest NJ.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Tags

Neural Precursor CellsNeurodevelopmental PhenotypesNeural DevelopmentCell CharacterizationCell CultureCell DetachmentCell HarvestingTritiated ThymidineCell ProliferationNeurodevelopmental DisordersNeuropsychiatric DisordersRapid And Reproducible Method

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image