Neurodevelopmental prosesser som spredning, migrering og neurite resultatet er ofte opprørt i nevropsykiatriske sykdommer. Derfor presenterer vi for å raskt og reproduserbar vurdere prosessene neurodevelopmental i menneskelig iPSC-avledet NPCer. Disse protokollene kan også vurdering av virkningene av relevante vekstfaktorer og therapeutics på NPC-utvikling.
Menneskelige hjerne utviklingen fortsetter gjennom en rekke nettopp orkestrert prosesser, med tidligere stadier atskilt av spredning, migrering og neurite utvekst; og senere stadier preget av axon/dendrite utvekst og synapse formasjon. I neurodevelopmental lidelser, er ofte én eller flere av disse prosessene forstyrret, fører til unormalt i hjernen dannes og funksjon. Med bruk av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nå rikelig av menneskelige celler som kan differensieres til nesten en celle type, inkludert nerveceller. Disse cellene kan brukes både normale hjernens utvikling og sykdom patogenesen. Flere protokoller bruker hiPSCs modell nevropsykiatriske sykdom bruk terminalt differensiert nerveceller eller bruk 3D kultur systemer kalt organoids. Disse metodene har vist seg uvurderlig i å studere menneskelig sykdom patogenesen, finnes det noen ulemper. Differensiering av hiPSCs i nerveceller og generasjon av organoids er lange og kostbare prosesser som kan påvirke antallet eksperimenter og variabler som kan vurderes. Dessuten, mens etter mitotisk neurons og organoids tillater studiet av sykdom-relaterte prosesser, inkludert dendrite utvekst og synaptogenesis, utelukke de studiet av tidligere prosesser som spredning og overføring. I neurodevelopmental lidelser, som autisme, indikerer rikelig genetiske og evaluering bevis feil i tidlig utviklingsprosesser. Neural precursor celler (NPC), en svært proliferativ celle befolkningen, kan være en passende modell å stille spørsmål om ontogenetiske prosesser og sykdom innvielse. Vi nå utvide metoder lært å studere utviklingen i musen og rotten kortikale kulturene menneskelige NPCer. Bruk av NPCer tillater oss å undersøke sykdom-relaterte fenotyper og definere hvordan ulike variabler (f.eks, vekstfaktorer, narkotika) innvirkning utviklingsprosesser inkludert spredning, migrasjon og differensiering i bare noen få dager. Til slutt kan denne verktøysett brukes i en reproduserbar og høy gjennomstrømming måte for å identifisere sykdom-spesifikke mekanismer og fenotyper i neurodevelopmental lidelser.
Bruk av enklere organismer og musen modeller har belyst mekanismer for grunnleggende hjernens utvikling samt sykdom patogenesen. Til tross for disse fremskrittene forblir etiologien mange nevropsykiatriske lidelser unnvikende fordi ikke alle funn i enklere organismer er direkte relevante for kompliserte aspektet av menneskelig sykdom. Videre større kompleksiteten i den menneskelige hjernen ofte gjør det vanskelig å modell menneskelig utvikling og lidelser i dyr. Med evolusjon og utvikling av menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og deretter differensiert i neuronal celler å studere menneskelig sykdom. Fremskritt innen hiPSCs og «omic» teknologier (genomics, transcriptomics, Proteomikk, metabolomics) lover å revolusjonere forståelsen av menneskelige hjernens utvikling. Disse teknologiene nå gjøre mulig en “presisjon medisin”-tilnærming til karakterisering av nevropsykiatriske sykdom på et sak-til-sak grunnlag.
Gjeldende stiften i feltet hiPSC sykdom-modellering er å skille celler i bestemte neuronal subtyper i en monolayer eller bruke et 3D kultur system kalt en organoid til recapitulate aspekter av hjerne utviklingen1,2, 3. Disse systemene har vært utrolig verdifull i å studere og avdekke unike aspekter av menneskelig utvikling og sykdom4,5,6,7. Men krever både neuronal kulturer og organoids ofte hvor som helst fra uker til måneder i kultur før de er klare til å studere. Tidkrevende natur disse protokollene og mengden ressurser som er nødvendig for å opprettholde disse kultur systemene ofte begrense antall eksperimenter som kan utføres og antall variabler (som vekstfaktorer eller narkotika) som kan testes. Videre har mange studier utnytte etter mitotisk neurons og organoids fokusert på prosesser som dendrite utvekst eller synapse formasjon, som oppstår senere i utviklingen. Mens disse prosessene har vært innblandet i patologi utviklingsforstyrrelser lidelser som autisme og schizofreni, er tidligere utviklingsmessige hendelser som skjer før definitive neuronal differensiering også viktig for sykdom patogenesen8 ,,9,,10,,11,,12,,13. Faktisk viser genomisk studier at midt-fosterets perioden, som består av spredning, prosessen utvekst og migrasjon, er spesielt viktig i autisme patogenesen11,14. Dermed er det viktig å studere nevrale stammen og stamfar celle populasjoner å forstå disse tidligere prosesser. Organoid systems, som er vurdert å bedre recapitulate menneskelige hjerne utviklingen på grunn av sin 3D-natur og organisert struktur, inneholder en stamfar basseng som har blitt benyttet for å studere noen av disse tidligere hendelser. Men stamfar befolkningen i organoids er ofte sparsom og mer som radial gliacellene enn neural celler5,15-med stammen eller stamfar. Dermed vil det være gunstig å ha en høy gjennomstrømning metode å studere tidlige stadier av neurodevelopment i et aktivt proliferativ celle befolkningen.
I laboratoriet, har vi laget en protokoll som bruker hiPSC-avledet neural precursor celler (NPC), en blandet befolkning av nevrale stammen og progenitor celler som er svært proliferativ, å studere neurodevelopmental prosesser som spredning, celle migrasjon, og innledende prosess (neurite) forlengelsen. Disse analyser ble utviklet fra teknikker som brukes i vår lab for flere tiår å kunne studere neurodevelopment i rotte og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Viktigst, det ble også vist at fenotyper og regulatoriske signaler definert i kultur rotte og musen er svært forutsigende av mekanismer som er aktive i vivo, som angir verdien av disse teknikkene16, 17,18,19,24. Etter innledende differensiering av hiPSCs med NPC tillater disse metodene oss å studere viktige utviklingsprosesser i løpet av dager. Disse metodene har mange fordeler: (1) de krever litt avansert utstyr og er lett å implementere, (2) rekke eksperimentelle gjentak kan gjennomføres i en kort periode, slik at for rask bekreftelse av reproduserbarhet resultater, og (3) kultur variabler som belegg matriser, effekter av vekstfaktorer og aktivitet av narkotika kan testes raskt og kostnadseffektivt. Videre, tar vi nytte av veletablerte rolle ekstracellulære vekstfaktorer som kritisk regulatorer av ulike utviklingsprosesser. NPCer ble utsatt for å velge utviklingsmessige signaler som direkte stimulerer hendelser som spredning, neurite utvekst og celle migrasjon, og har funnet de forbedrer muligheten til å finne feil som ikke er i kontroll forhold19 , 25 , 26 , 27 , 28. likeledes brukervennlighet vurdere narkotika gir en kraftig avenue å vedta presisjon medisin teknikker for å teste effekten av ulike terapeutiske tiltak. Denne protokollen forenkler dermed en høy gjennomstrømning, reproduserbare, og enkel metode for å studere tidlig hjernens utvikling og sykdom patogenesen de mulige gunstige effektene av vekstfaktorer og narkotika på neurodevelopmental fenotyper.
Protokollene presenteres her illustrerer raske og enkle metoder for å studere grunnleggende neurodevelopmental prosesser og teste vekstfaktorer og narkotika bruker hiPSC-avledet neural precursor celler. hiPSC teknologi har revolusjonert studiet av patogenesen av neurodevelopmental sykdommer ved å gi oss tilgang til live neuronal menneskeceller fra berørte personer. Faktisk har det vært mange hiPSC studier av neurodevelopmental lidelser inkludert Retts syndrom, Timothy syndrom, Fragile-X syndrom, og schizofreni, som h…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av New Jersey guvernørens Council for medisinsk forskning og behandling av autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer familie Foundation, Mindworks føre stiftelse og jødiske samfunnet grunnlaget for større MetroWest NJ.
PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |