JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Быстрое обнаружение фенотипов исходам в клетках человека нейронных прекурсоров (НПС)

Published: March 02, 2018
doi:
10.3791/56628
, , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics,Rutgers University

Summary

Психомоторного развития процессы, такие, как распространение, миграции и neurite нарост часто возмущенных в психоневрологических заболеваний. Таким образом мы представляем протоколы можно воспроизвести и быстро оценить эти процессы нервной в человека iPSC производные РНУ. Эти протоколы позволяют также оценки воздействия соответствующих факторов роста и терапии по развитию NPC.

Abstract

Развитие человеческого мозга проходит через ряд четко спланированных процессов, с ранних этапов распространения, миграции и neurite нарост; и более поздних стадиях характеризуются аксона/дендритов нарост и синапса формирования. В нервной расстройств часто один или несколько из этих процессов разрушаются, ведущих к аномалии в мозге формирования и функции. С появлением человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) технологии исследователи теперь имеют в избытке человеческих клеток, которые могут быть дифференцированы в практически любой тип клеток, включая нейронов. Эти клетки могут использоваться для изучения развития нормального мозга и патогенез болезни. Ряд протоколов, с помощью hiPSCs для моделирования использования психоневрологические заболевания неизлечимо продифференцировано нейронов или использование 3D культуры систем называется organoids. Хотя эти методы доказали неоценимое значение в изучении патогенеза заболеваний человека, есть некоторые недостатки. Дифференциация hiPSCs в нейроны и поколения organoids, длительных и дорогостоящих процессов, которые могут повлиять на количество экспериментов и переменных, которые могут быть оценены. Кроме того в то время как после митотическая нейронов и organoids позволяют исследования процессов, связанных с болезнями, включая дендритов нарост и synaptogenesis, они исключают изучения предыдущих процессов как миграции и распространения. В нервной расстройств, таких как аутизм обильные доказательства генетических и посмертные указывает дефекты в начале процессов развития. Клетки-предшественники нейронных (НПС), высокой пролиферативной клеток населения, может быть подходящую модель, в которой задавать вопросы о онтогенетические процессы и начало болезни. Теперь мы расширяем методологий, извлеченные из изучения развития в мышь и крыса корковых культур для человека РНУ. Использование НИПы позволяет нам исследовать связанные с болезнью фенотипы и определить как различные переменные (например, факторы роста, наркотики) воздействия процессов развития включая распространения, миграции и дифференциация лишь через несколько дней. В конечном итоге этот набор может использоваться в духе воспроизводимость и высок объём для выявления механизмов конкретных заболеваний и фенотипы в нервной расстройств.

Introduction

Использование мыши модели и проще организмов выяснены механизмы развития основных мозга, а также патогенеза болезни. Несмотря на эти достижения этиологию многих психоневрологических расстройств ускользает, потому что не все результаты в более простые организмы имеют непосредственное отношение к сложные аспекты заболеваний человека. Кроме того большую сложность человеческого мозга часто делает его трудным для модели человеческого развития и расстройства в животных. С Эволюция и прогресс человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) технологии соматические клетки можно перепрограммировать в стволовые клетки и затем дифференцированной в нейрональные клетки для изучения болезней человека. Достижения в технологии hiPSCs и «omic» (геномика, transcriptomics, протеомики и метаболомики) обещает революционизировать понимание развития человеческого мозга. Эти технологии теперь сделать возможным «точность медицина» подход к характеристике психоневрологических заболеваний на основе case-by-case.

Текущий штапель в поле hiPSC заболевание моделирование является дифференцироваться в определенных нейронов подтипы в монослое клеток или использовать систему 3D культуры под названием органоид резюмировать аспекты мозга развития1,2, 3. Эти системы были невероятно ценным в изучении и расчехлять уникальные аспекты развития человеческого потенциала и болезни4,5,6,7. Однако нейронов культур и organoids часто требуют везде от недель до месяцев в культуре прежде чем они готовы учиться. Трудоемкий характер этих протоколов и количество ресурсов, необходимых для поддержания этих систем культуры часто ограничивают количество экспериментов, которые могут быть выполнены и количество переменных (как факторы роста или наркотиков), которые могут быть проверены. Кроме того многие исследования с использованием пост митотическая нейронов и organoids были сосредоточены на процессы такие как нарост или синапса образования дендритов, которые происходят позже в процессе развития. Хотя эти процессы были причастны к патологии развития расстройств, таких как аутизма и шизофрении, ранее развития события, которые происходят до окончательного нейрональных дифференциация также важны для патогенеза заболеваний8 ,9,10,11,12,13. Действительно недавние геномные исследования показывают, что периода середины плода, который состоит из распространения, процесс нарост и миграции, особенно важное значение в патогенезе аутизм11,14. Таким образом важно изучить нервных стволовых и прародитель клеточных популяций, чтобы лучше понять эти ранее процессов. Органоид систем, которые считаются лучше итог развития человеческого мозга из-за их 3D природа и организованную структуру, содержать прародителя бассейн, который был использован для изучения некоторых из этих более ранних событий. Однако прародитель населения organoids часто является редким и больше как радиальные глиальные клетки чем нервных стволовых и прогениторных клеток5,15. Таким образом было бы полезно иметь высокую пропускную способность метода для изучения ранних стадиях нейроразвития в популяции активно пролиферативной клеток.

В лаборатории, мы создали протокол, использующий hiPSC производные нейронных прекурсоров клетки (НПС), смешанного населения нервных стволовых и прогениторных клеток, что весьма пролиферативная, изучение неврологического процессов, таких как распространение, миграции клеток, и расширение начального процесса (neurite). Эти анализы были разработаны от методов, используемых в нашей лаборатории на протяжении десятилетий успешно учиться нейроразвития крысы и мыши корковых культур16,,1718,19,20, 21,,22–23. Важно отметить, что также было показано, что фенотипы и регулирования сигналов, определенных в системах культуры крысы и мыши очень интеллектуальный механизмов, которые активно в естественных условиях, указывающее значение этих методов16, 17,18,19,24. После первоначального дифференциации hiPSCs с НПС эти методы позволяют нам для изучения жизненно важных процессов развития в считанные дни. Эти методы имеют много преимуществ: (1) они требуют мало сложного оборудования и легко осуществить, (2) многочисленные экспериментальные реплицирует может проводиться в течение короткого времени, позволяя быстрое подтверждение воспроизводимости результатов, и (3) Культура переменных, таких как покрытие матрицы, эффекты факторов роста и активности препаратов могут быть проверены, быстро и экономично. Кроме того мы воспользоваться хорошо созданы роль внеклеточных факторов роста как критические регуляторы различных процессов развития. НПС были подвержены выбрать развития сигналы, которые непосредственно стимулировать такие события, как распространение, neurite нарост и миграции клеток и обнаружили, что они повышают способность выявлять дефекты, которые не проявляются в условиях управления19 , 25 , 26 , 27 , 28. Аналогичным образом, облегчения оценки наркотиков обеспечивает мощный авеню принять точности методов медицины для проверки эффективности различных терапевтических вмешательств. Таким образом этот протокол способствует высокой пропускной способности, воспроизводимость и простой методологии для изучения раннего развития мозга, патогенеза заболевания и потенциальных благотворно факторов роста и наркотиков на фенотипы психомоторного развития.

Protocol

1. безопасность процедуры и обслуживание кабинета по биобезопасности Процедуры безопасности уровня биобезопасности-2 (BSL-2) Следуйте рекомендациям, учреждения по работе с материалами BSL-2. Утилизация материалов BSL-2 по данным Института практики. Укажите номера и обору?…

Representative Results

Одна из целей этих исследований является определение пролиферативной активности НПС, то есть, увеличение числа клеток. Это достигается путем оценки синтеза ДНК клеток всего населения, высок объём подход, который измеряет включение радиоактивных трассирующими третир…

Discussion

Здесь представлены протоколы свидетельствуют быстрые и простые методы для изучения фундаментальных неврологического процессов и тестирования факторы роста и наркотиков с использованием клеток hiPSC производные нейронных прекурсоров. hiPSC технология революционизировал изучение патог?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана губернатор Нью-Джерси Совета медицинских исследований и лечения аутизм (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Нэнси Lurie знаменует Фонд семьи, Mindworks благотворительный фонд свинца и еврейская община фонд более Метроуэст NJ.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Tags

Neural Precursor CellsNeurodevelopmental PhenotypesNeural DevelopmentCell CharacterizationCell CultureCell DetachmentCell HarvestingTritiated ThymidineCell ProliferationNeurodevelopmental DisordersNeuropsychiatric DisordersRapid And Reproducible Method

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image