Summary
Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.
Abstract
Het transport van ionen via celmembranen zorgt voor het fijne controle van ion inhoud binnen en buiten de cel die onontbeerlijk is voor de overleving van de cel. Deze vervoer mechanismen zijn gemedieerd door de activiteiten van gespecialiseerde vervoerder eiwitten. Specifiek, pH dynamics fijn worden gecontroleerd door plasmamembraan proton (H+) extrusie systemen, zoals de nb+/H+ warmtewisselaar (NHE) eiwit familie. Ondanks uitgebreide inspanningen om te bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verordening NHE, is ons huidige begrip van de biofysische en moleculaire eigenschappen van de familie NHE ontoereikend vanwege de beperkte beschikbaarheid van methoden om te meten effectief NHE activiteit . In dit manuscript, gebruikten we H+-Ionselectieve electroden tijdens geheel-cel patch klemmen opname voor het meten van NHE-geïnduceerde H+ flux. Wij hebben voorgesteld deze aanpak te overwinnen sommige beperkingen van meestal gebruikte methoden voor het meten van NHE activiteit, zoals opname van radioactieve en fluorescerende membraan permeants. Meten van NHE activiteiten met behulp van de beschreven methode maakt hoge gevoeligheid en tijd resolutie en een efficiëntere controle op intracellulaire concentraties van de H+ . H+-Ionselectieve electroden zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een H+-selectieve elektrode tot verplaatsen en weg van het celmembraan in een repetitieve, oscillerende manier registreert een spanningsverschil die is afhankelijk van H+ flux. Terwijl H+-Ionselectieve electroden worden gebruikt voor het detecteren van H+ flux verhuizen van de cel, de patch klem methode in het geheel-cel-configuratie moet worden gebruikt voor de samenstelling van het intracellulair ion. Toepassing van de reus patch-clamp techniek staat bovendien, wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook de lipiden. De activiteit van de vervoerder van NHE isovorm 3 (NHE3) werd gemeten met behulp van deze technische aanpak te bestuderen van de moleculaire basis van de verordening van de NHE3 door phosphoinositides.
Introduction
Transport van ionen en opgeloste stoffen over het plasma-membraan is essentieel voor de overleving van de cellen en dus van organismen1. Selectieve transport van ionen en opgeloste stoffen wordt bereikt door een scala aan gespecialiseerde kanaal en vervoerder eiwitten. Mutaties in deze eiwitten vaak resulteren in een verscheidenheid van klinische omstandigheden, waardoor kanaal en vervoerder eiwitten doelwit voor farmacologische behandeling1. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan kanaal en vervoerder functie en verordening wordt echter vaak beperkt door de benaderingen ter studie van hun activiteit2,3,4.
Specifiek, vervoerders kunnen worden grofweg onderverdeeld in twee grote groepen afhankelijk van of ze de transmembrane potentieel van cel tijdens het transport van opgeloste stoffen wijzigen: de veranderen electrogenic ion vervoerders [bv -natriumfosfaat Co vervoerder 2a (NaPi2a), natrium-calcium exchanger (NCX), enz.] of de transporteurs electroneutral-ion niet-wijzigen [bijvoorbeeld natrium-proton exchanger (NHE), natriumchloride co vervoerder, NaPi2c, enz.]. De activiteiten van beide klassen van transporteurs zijn bestudeerd uitgebreid met opname van radioactieve isotopen en membraan-permeant fluorescerende kleurstoffen2. Beide benaderingen schatten de activiteit van transporteurs door het meten van veranderingen in de concentratie van de bulk van specifieke cytoplasmatische ionen, en beide methoden hebben beperkingen, zoals matige gevoeligheid en de resolutie van de tijd en onvoldoende controle van de intracellulaire milieu. Inderdaad, de activiteit van veel vervoerders is afhankelijk van de cytoplasmatische concentratie van de uitgevoerd ionen (bijvoorbeeld NHE3, NCX), en veranderingen in deze ion concentraties worden verwacht om te spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de vervoerder activiteit2 , 3 , 5. nauwkeurige meting van deze regulerende mechanismen is beperkt met behulp van de klassieke methoden.
Deze beperkingen wilt opheffen, worden patch klem methoden gebruikt voor het bestuderen van de vervoerder activiteit2,6. In het bijzonder hebben de naar zichzelf verwijzen ion-Ionselectieve electroden (ISEs)7,8 in combinatie met de patch klemmen systeem onlangs de meting van electroneutral transporter activiteit3,4 , 5. ISEs zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een ISE omhoog te bewegen en buiten de celmembraan in een repetitieve, registreert oscillerende mode een spanningsverschil (µV). Ion flux waarden met behulp van een kalibratie-methode die van toepassing de eerste wet van Fick van diffusie2,9 iskunnen verschillen van de spanning worden omgezet. Terwijl ISEs worden gebruikt om te ontdekken de flux van ionen verplaatsen van cellen, de patch klem methode in beide geheel-cel of binnenstebuiten configuraties wordt gebruikt voor het bepalen van de samenstelling van de potentiële en intracellulaire ion membraan. Bovendien kan de toepassing van de gigantische patch-clamp techniek wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook lipiden en eiwitten3,5.
Kortom vergeleken de veelzijdigheid van de patch klem methode met dat van andere methoden om te studeren vervoerder activiteit patch klemmen geschikt geboekt voor het overwinnen van de gemeenschappelijke beperkingen van deze andere methoden. De combinatie van zichzelf verwijzende ISEs en patch-clamp technieken biedt de unieke mogelijkheid om het meten van de activiteit van electroneutral vervoerders in een strak gecontroleerde experimentele omgeving en te ontdekken roman biofysische en moleculaire eigenschappen van de celmembraan vervoer3,4,5. Deze aanpak is met succes gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van de NHE. De zoogdieren NHE eiwit familie katalyseert de uitwisseling electroneutral netto van extracellulaire natrium (Na+) voor de intracellulaire proton (H+)10,11 met behulp van een innerlijke nb+ verloop. Bij zoogdieren bevat de NHE eiwit familie 11 verwante proteïnen (NHE1-9 en NHA1-2) en een sperma-specifieke NHE10,12,13.
NHEs (familie SLC9a) zijn overal te vinden in de meeste levende organismen van eenvoudige prokaryoten aan hogere eukaryoten en zijn betrokken bij een scala aan vitale cel functies10,11, met inbegrip van controle op de cel zoutgehalte verdediging in prokaryoten, zuur-base homeostase en cel volume onderhouden en reguleren van de absorptie van zout en water in verschillende gespecialiseerde epithelen10,12,14,15. De belangrijkste biologische rol van NHEs en de betekenis van hun functies zijn vastgesteld door middel van verschillende studies; echter hebben weinig studies onderzocht de biofysische en moleculaire eigenschappen van zoogdieren afkomstig NHEs vanwege de methodologische beperkingen4. Onlangs, de toepassing van zichzelf verwijzende ISEs tijdens het geheel-cel patch klemmen heeft geopenbaard nieuwe moleculaire mechanismen van NHE isoforms geregeld door veranderingen in de intracellulaire concentraties van ionen, eiwitten en fosfolipiden3, 4.
Met name het protocol waarin dit manuscript schetst de methodes en benaderingen voor de studie van de activiteit en regulering van NHE isovorm 3 (NHE3), een belangrijke speler in de absorptie van nb+, Cl-, HCO3- en vloeistof in de borstel grens membraan van nier- en intestinale epithelen14,16. Nieuw inzicht in de verschillen in de gevoeligheid van NHE3 activiteit aan intracellulaire phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-difosfaat [PI (4,5) P2] en phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfaat [PI(3,4,5]P3]) is gemeld. Cel vervoer eiwitten, zoals kanalen en vervoerders, worden geregeld door phosphoinositides17en NHE3 direct bindt zowel PI (4,5) P2 en P3 PI (3,4,5)18. Op basis van de huidige literatuur, ofwel phosphoinositide zou relevant kunnen zijn voor de fysiologische of pathofysiologische regulering van NHE35,18,19. Onze bevindingen ondersteunen aparte rollen voor PI (4,5) P2 en P3 van de PI (3,4,5) in de regulatie van NHE3 activiteit. Dit onderscheid werd mogelijk door de toepassing van ISE technieken in combinatie met geheel-cel patch klem opname. Deze techniek biedt ook controle over de inhoud phosphoinositide cellulaire via de intracellulaire perfusie van verschillende phosphoinositides tijdens de meting van NHE3 activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Twee versterkers zijn verplicht voor het vastleggen van de activiteit van electroneutral vervoerders door een naar zichzelf verwijzen ISE in combinatie met klemmen, een patch klem versterker aan het handhaven van de cel in de configuratie van een geheel-cel en een hoge impendence versterker (patch elektrometer) om vast te leggen van de vervoerder activiteit via de ISE (zie tabel van materialen). De patch klem versterker is rechtstreeks verbonden aan de verwerving van bestuur terminal. De elektrometer is aangesloten op de differentiële versterker gebruikt om te filteren en het signaal versterken. De differentiële versterker is verbonden aan de verwerving van bestuur terminal. Capmeter, klem Patchsoftware die cel capaciteit, controleert in eerdere studies20 is gebruikt (zie tabel van materialen). De opname-kamer en perfusie-oplossingen worden gehandhaafd bij 37 ° C.
1. bereiding van pipetten ISEs
- Trek de pipetten van borosilicaatglas haarvaten naar een buitendiameter van 1.2 mm (Zie Tabel van materialen) met behulp van het pipet trekker2 .
- Pools de Pipetteer met behulp van de microforge. De diameter van het uiteinde van de pipet moet 2-3 µm.
- Plaats de pipetten in een pot holder voor pipetten met het uiteinde van de pipet naar boven (Zie Tabel van materialen).
Let op: Voer stappen 1.4-1.6 in een goed geventileerde chemische zuurkast. - Meng het mengsel van de siliconization die uit 1 druppel (~ 150 µL bestaat) van de BIB (dimethylamino) dimethyl silane en 10 druppels van tetrachloorkoolstof (Zie Tabel van materialen).
- Giet het siliconization mengsel in de pot en sluit het deksel strak.
- Incubeer de pot met het mengsel van de siliconization voor 24-48 h in een chemische zuurkast bij kamertemperatuur totdat het mengsel is volledig verdampt.
- Aanvulling funderingsput de pipet met de juiste ion-selectieve hars maken een kolom met ongeveer 2-4 mm.
Opmerking: Waterstof ionophore ik cocktail B waarvan opname NHE activiteit kan worden (Zie Tabel van materialen). - Tik op het uiteinde van de pipet voor het distribueren van de ion-selectieve hars tot aan de vingertop en leg de pipet verticaal in de houder van de pot met het pipet topje naar beneden.
- Checkunder de ontleden Microscoop dat de hars cocktail heeft bereikt het einde van de tip. Indien nodig, toepassing positieve druk om te duwen de hars tot het einde.
- Aanvulling funderingsput de helft-pipet met de passende oplossing (~ 100 μl). Hier, gebruik 100 mM KCl en 10 mM HEPES bij pH 7.0 als ionophore ik cocktail B.
- De ISE verbinden met de elektrometer en plaats het uiteinde van de ISE in de bad-oplossing gebruikt voor opnemen. Nul de elektrometer.
- Test de H+-selectieve ISE reactie door het veranderen van de pH van de oplossing van het bad. De gemiddelde H+-selectieve ISE reactie is ~ 58 mV per pH-eenheid.
- Periodiek evalueren de ISE reactie op kalibratie.
2. voorbereiding van de Patch-Clamp Pipettes voor opname
Opmerking: De methode beschreven door Donald Hilgemann in zijn artikel op één-kanaals opname21 wordt aanbevolen.
- Trek de pipetten voor gigantische patch van borosilicaatglas haarvaten (2.0 mmOD / 1.5 mm ID) op de pipet trekker2,22,23.
- Gebruik een microforge gemonteerd op het podium van een omgekeerde Microscoop te maken een breed pipette uiteinde (10-22 μm)23. Smelt een kraal (~ 0,5 mL) van zachte glas op de dikke platina-draad van de microforge.
Opmerking: Een relatief dikke platina-draad is vereist (~0.5 mm) tot het fabriceren van gigantische patch pipetten. - Plaats de pipet patch dicht bij de zachte glazen kraal en volledige warmte worden toegepast totdat de tip begint te wijken. De platina-draad zal iets bewegen in de richting de centerduring Verwarming.
- Uitschakelen van de warmte, in en druk het uiteinde van de pipet het onthard glazen kraal. De koeling draad zal intrekken en breken van het uiteinde van de pipet.
- Opnieuw de hitte het pipet puntje glad te maken een pipet-tip van de gewenste diameter. De diameter van het uiteinde is afhankelijk van de grootte van de cel die moet worden versteld (8-10 μm in deze studie).
3. voorbereiding van de cellen
- Opwarmen van fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, trypsine-EDTA-oplossing en groeimedium aan bij 37 ° C.
- Wassen cellen tweemaal met PBS. 1 mL van de buffer voor 35 mm diameter cel cultuur plaat gebruiken.
- Voeg 0,5 mL trypsine naar de cellen voor 35 mm diameter cel cultuur plaat.
Opmerking: Wanneer cellen beginnen aan ronde-up, schud de plaat als u wilt de cellen los te koppelen. - Stop de trypsine actie door toevoeging van 5 mL (bedrag voor 35 mm diameter cel cultuur plaat) volledige groeimedium aangevuld met 10% foetale runderserum.
Opmerking: De reactietijd in trypsine is celtype afhankelijk. - Plaats de cellen op een shaker met rockende om te voorkomen dat de vorming van klonten.
- Cellen gebruiken voor maximaal 2 uur na trypsinebehandeling.
Opmerking: De tijd kan variëren afhankelijk van de cellijn.
4. voorbereiding van een Intra-pipet perfusie systeem
- Knippen van een passende omvang van kwarts buis (150 µm OD / 75 µm ID) ter voorbereiding van de intra-pipet perfusie-lijn.
- Één kant van de buis kwarts invoegen in een 200 µL pipette uiteinde. Lijm de quartz-buis op de tip, en snijd het einde van het uiteinde met een scherp scheermesje.
- De lijn van de perfusie (kwarts buis gelijmd tot aan de vingertop) verbinden met een klein stukje silicium buis die als een reservoir voor de intra-pipet perfusie oplossing dienen zou.
- De Siliconen slang verbinden met een injectiespuit positieve druk maken.
- Invoegen het vrije uiteinde van de buis van de quartz via de polyethyleen buis van de houder van de Pipet van de perfusie port (Zie Tabel van materialen).
- De regel van de perfusie met de pipet-oplossing te evalueren.
5. bereiding van de oplossingen
- Bereid een zwaar gebufferde pipet-oplossing voor het opnemen van NHE (115 mM kalium aspartaat (Kawasaki Advanced Safety), 1 mM EGTA, 0.5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 mM buizen, 12.5 mM MOPS en 12,5 mM MES, pH 6.0 aangepast met asparaginezuur).
Opmerking: De voorraad Pipetteer oplossing en filter voorbereiden. Mg-ATP toevoegen voordat u gaat opnemen. - Bereid de oplossing van een vers Bad telkens (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2en 0.1 mM Tris-HCl pH 8.2).
6. opnemen van Transporter activiteit
- Handhaven de kamer opnemen en alle oplossingen bij 37 ° C, omdat de vervoerder activiteit is afhankelijk van de temperatuur.
- Plaats de cellen in de zaal van de opname. Wacht totdat zij naar de bodem van de kamer dalen maar ze niet laat hechten aan de kamer.
- Kies een gewenste cel. Meet de diameter van de cel met de oogbeschadigingen en/of micrometer. Kies cellen met dezelfde diameter.
Opmerking: In het algemeen een grote cel zal hebben meer cellulaire oppervlakte en eventueel meer vervoerders uitgedrukt op het plasmamembraan, dus ook met meer activiteit van de vervoerder. Dit is echter niet per se correct, zoals vervoerder activiteit is afhankelijk van de specifieke vervoerder en het celtype bestudeerde. - De ion-selectieve micro-elektrode pipet om de micromanipulator te monteren, aanvulling funderingsput de pipet patch-klemmen met de intracellulaire oplossing, zorg ervoor dat de oplossing bereikt de punt van de pipet2.
Opmerking: Het zou kunnen vereisen verschillende zachte kranen te elimineren van de bubbels in het uiteinde van de pipet. - Monteer de patch-klemmen pipet naar de hoofd fase van de elektrofysiologie2,22,23instellen.
Opmerking: Het is belangrijk om te houden van het hoofd stadium over een hoek van 45 graden aan de horizontale as, aangezien hierdoor een ingang hoek voor de pipet die geschikt is voor de vorming van een zeer bestendig zegel. - Een kleine positieve druk uitoefenen (~ 5 cm H2O) om de patch pipet te verminderen de kans op het blokkeren van de tip en plaats deze in de oplossing van het bad.
- Stop de patch klem pipet verplaatsen zodra het puntje ligt van de cel.
- De positieve druk te verlichten, terwijl Pipetteer de cel raakt en toepassen van lichte onderdruk (~ 5 cm H2O) te verkrijgen een > 1000 MΩ (een Giga-ohm) zegel op de celmembraan met de patch Pipetteer23.
- Plaats de pipet patch met de cel in de dezelfde brandvlak als de ISE en verplaatsen van de Pipet van de patch met de cel in de nabijheid van de ISE (~ 5-10 µm)2,5 maar te voorkomen waardoor de cel contact opnemen met de ISE (figuur 1A).
- Verzekeren dat het bedrijf potentiële 0 mV.
- Scheuren van de zegel met reeks korte zuigpijpen de geheel-cel-configuratie te verkrijgen.
- Beweeg de ISE (of patch klem pipet) langzaam van links-rechts of omhoog / omlaag om de activiteiten van de vervoerder (figuur 1B) te leggen.
- Het opnemen van ten minste 5-8 toppen (Figuur 1 c, van A naar B).
- Toepassing blokgolf verstoringen tijdens de opname te waken over de kwaliteit van het zegel en de capaciteit van de celmembraan (Figuur 1).
- Schatten van de flux H+ (
) uit het verschil in concentratie van gratis H+ tussen het celoppervlak en de bulk-oplossing (ΔH+)
Opmerking:
en 
zijn H+ en buffer diffusie coëfficiënten respectievelijk BT is de totale buffer concentratie, KD is de dissociatieconstante van de buffer, r is de cel straal en 
bepaalt de stationaire toestand verandering in de concentratie van afhankelijke H+ voor een kleine verandering in vrije H+. H+ geeft een gratis proton in oplossing. Om ze consistent met eerdere studies, H+ poeders worden geconverteerd naar elektrofysiologische flux eenheden door het berekenen van de huidige equivalenten ten opzichte van de lichtstromen (/faraday) in pA3,,5]. - Normaliseren van de proton-flux aan het celoppervlak die kan worden berekend uit de grootte van de cel of de capaciteit van het membraan.
) uit het verschil in concentratie van gratis H+ tussen het celoppervlak en de bulk-oplossing (ΔH+)
en 
zijn H+ en buffer diffusie coëfficiënten respectievelijk BT is de totale buffer concentratie, KD is de dissociatieconstante van de buffer, r is de cel straal en 
bepaalt de stationaire toestand verandering in de concentratie van afhankelijke H+ voor een kleine verandering in vrije H+. H+ geeft een gratis proton in oplossing. Om ze consistent met eerdere studies, H+ poeders worden geconverteerd naar elektrofysiologische flux eenheden door het berekenen van de huidige equivalenten ten opzichte van de lichtstromen (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een naar zichzelf verwijzen ISE tijdens geheel-cel patch klem opname werd toegepast om te bestuderen van de regulering van de activiteit van de NHE3 door phosphoinositides. PS120 cellen van de fibroblast-achtige24, die de uitdrukking van endogene plasmamembraan NHEs, werden gebruikt. NHE3 wild-type (NHE3-wt) of NHE3 mutanten die geen binding phosphoinositides [tyrosine 501, 503 arginine en lysine 505 werden vervangen door alanine, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] stabiel naar voren zijn gebracht in PS120 cellen van de fibroblast-achtige18.
De sporen worden weergegeven in Figuur 2. De cel was heldin een geheel-cel configuratie door een pipet voor patch klemmen en de ISE werd geplaatst voor de cel. In deze positie, de ISE opgenomen de concentratie van gratis H+ dicht bij de celmembraan (figuur 1A); vervolgens de ISE (of patch klem pipet) werd handmatig verplaatste lateraal 50 µm en de concentratie van gratis H+ opgenomen in de oplossing (figuur 1B). De opgenomen spanning verschillen, overeenkomt met de twee standpunten van de Pipet van de patch met de cel in voor of ver van de ISE, zijn representatief voor NHE3 activiteit (Figuur 1 c). De intra-pipet perfusie van apyrase (ATP-diphosphatase) verlaagt de intracellulaire concentratie van ATP, daarna verminderen de phosphoinositide inhoud5. In overleg met de eerder gemelde studie5,18,19verminderd de inhoud van de verminderde phosphoinositide gemedieerd door apyrase behandeling NHE3 activiteit (~ 50%), die werd opgenomen als een afname van de spanning trilling amplitude (Figuur 2). Het effect van apyrase (gegeven op 5 eenheden/ml) op de activiteit van de NHE3 werd volledig ongedaan gemaakt door de intra-pipet perfusie van apyrase in combinatie met 2 µM PI (3,4,5) P3 (Figuur 2 en 3A). Deze bevindingen werden gesteund door de activiteit van de NHE3 opgenomen in de cellen van de PS120 NHE3 mutanten (NHE3-YRK) die konden worden phosphatidylinositides18binden stabiel te uiten. De perfusie van apyrase alleen of in combinatie met PIP3 had geen invloed op de activiteit van NHE3 in NHE3-YRK mutanten (figuur 3B). De activiteit van endogene NHE3 was ook geremd door apyrase behandeling in opossum nier (OK) cellen3. De intra-pipet perfusie van PI (3,4,5) P3 omgekeerd de remming van NHE3 activiteit geïnduceerd door apyrase in OK cellen (Figuur 3 c). Deze bevindingen stellen voor dat het effect van de PI (3,4,5) P3 op NHE3 activiteit niet cel type-specifieke is.
Vervolgens wilde we testen van de specificiteit van de PIP3 over de normalisering van de apyrase-gemedieerde wijzigingen in NHE3 activiteit. We deden dit door het analyseren van de gevolgen voor de vermindering van de apyrase-afhankelijke op NHE3 activiteit na de perfusie van andere phosphoinositides, zoals PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (op 10 µM) beïnvloedde niet de verminderde NHE3 activiteit gemedieerd door apyrase (figuur 4A). Tot slot deed de perfusie van het AMP-PNP, een niet-hydrolyseerbaar ATP analoog, niet blokkeren theapyrase-afhankelijke remming van NHE3 activiteit (figuur 4B). Deze bevindingen stellen voor een rol van PI (3,4,5) P3, maar niet de PI (4,5) P2, in de regulatie van NHE3 na uitputting van de ATP. De identificatie van afzonderlijke rollen voor PI (4,5) P2 en P3 van de PI (3,4,5) in NHE3 verordening alleen vanwege de intercellulaire perfusie van phosphoinositides tijdens de ISE metingen gecombineerd met geheel-cel patch klem opname5mogelijk was. Een specifieke actie van de PI (3,4,5) P3 in plaats van PI (4,5) P2 in de regulatie van NHE3 activiteit is waardevol om te bepalen of verschillende intracellulaire phosphoinositides de functie van NHE3 anders regelen.
Figuur 1 . Schematische weergave van H+ meting en correlatie tussen NHE activiteit en potentiaalverschillen opgenomen door de micro-pH elektrode flux.
Schematische weergave van de opname-instelling. A. Diagram van de eerste experimentele instelling. De cel is gehouden in het geheel-cel configuratie door de patch klem pipet en geplaatst voor de ISE. In deze positie registreert de ISE de concentratie van gratis H+ dicht bij de celmembraan. B. de ISE (of patch klem pipet) is handmatig verplaatste lateraal ~ 50 µm en slaat de concentratie van gratis H+ in de oplossing in deze positie. C. grafische weergave van spanning verschillen opgenomen met behulp van de ISE. De oscillaties van positie een (cel tegenover de ISE) naar B (cel ver van de ISE) zijn representatief voor NHE activiteit. De gebruikte software geregistreerd de spanning verschillen opgenomen door de ISE en verstoringen van de blokgolf (20 mV, 0,2 kHz) voor het controleren van de celmembraan precisiecapaciteit en de kwaliteit van het zegel van de klem patch gegenereerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Voorbeeld van een opname instellen voor NHE3 transporter activiteit in een enkele cel van PS120 NHE3-wt stabiel uitspreken vóór en na de perfusie met apyrase en PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Na de eerste opname, was de cel van ATP uitgeput door de intra-pipet perfusie van apyrase. NHE3 activiteit daalde geleidelijk aan en werd gerestaureerd door PIP3 intra-pipet perfusie. Apyrase toevoeging wordt aangegeven door de rode balk en PIP3 toevoeging wordt aangegeven door de groene balk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Effect van ATP uitputting en PIP3 perfusie op NHE3 transporter activiteit in PS120 en OK cellen.
Effect van apyrase-gemedieerde ATP uitputting op NHE3 activiteit en reserveren van het effect van apyrase op NHE3 activiteit geïnduceerd door PIP3 intra-pipet perfusie: A. PS120 cellen waarin NHE3-wt of B. PS120 cellen waarin NHE3-YRK, NHE3 mutanten kunnen binden van phosphoinositides. C. OK cellen uiten van endogene NHE3. Gevulde cirkels gemiddelde gegevens weergeven van individuele experimenten (vier experimenten uitgevoerd onder identieke omstandigheden). Foutbalken vertegenwoordigen de middelen ± standaardfouten (SE). * P < 0.05 vs. control, ANOVA. $ P < 0,5, $$P < 0,01 apyrase vs. apyrase + PIP3, ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Effect van PI (4,5) P2 (PIP2) en perfusie ANP-PNP op NHE3 activiteit na uitputting van de ATP.
Effect van A. PIP2 of B. ANP-PNP intra-pipet perfusie op apyrase-afhankelijke inkrimping van de bedrijfsactiviteit van de NHE3 in de PS120 cellen uiten NHE3-pm gevulde cirkels gemiddelde gegevens van individuele experimenten (vier experimenten uitgevoerd onder identieke omstandigheden weergeven). Foutbalken vertegenwoordigen de middelen ± SE. * P < 0,05, ** P < 0.01 vs. control, ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de cruciale functies van vervoerders zijn de methoden beschikbaar voor het bestuderen van hun activiteit inefficiënt en ontoereikend. Een beperking is dat de beschikbare methoden ion verkeer gemedieerd door vervoerder activiteit zonder rekening van schommelingen in de samenstelling van het intracellulair ion tijdens het experiment4te meten. De onderhavige methode zorgt voor nauwkeurige controle van extracellulaire en intracellulaire ion composities en biedt een krachtig hulpmiddel voor het wijzigen van de intracellulaire ion, eiwit en lipide composities3,4,5.
De belangrijkste stap in dit protocol is de voorbereiding van een ISE thats stabiel voor een lange periode25. In onze ervaring, een unstable ISE is niet goed gesiliconiseerd (bijvoorbeeld de ion-selectieve hars wordt herverdeeld op de zijkanten van de pipet ISE) die kunnen worden gedetecteerd door een constante en oncontroleerbare drift in het ISE signaal. Bovendien, moet de verdeling van de hars in de ISE nauwlettend worden gevolgd tijdens het experiment. De bad-oplossing kan duwen de ion-selectieve hars binnen de ISE Pipet, het creëren van een kolom met bad oplossing voordat de hars25. In dit geval zal de ISE de concentratie van de ion uit deze kolom wordt geregistreerd en worden aan veranderingen in het ion verlopen tijdens het experiment. Aanpassing van de geometrie van de ISE is sleutel tot het verkrijgen van een reactie van de ISE in het bereik van 100 ms9 en overwinnen van eventuele vertragingen in ISE tijd-reacties vergeleken met wijzigingen in ion verlopen.
De belangrijkste beperking van de onderhavige methode is overgenomen van de patch klemmen meten van vervoerder activiteiten in epitheliale cellen. Wanneer losgekoppeld van de steun en in suspensie onderhouden, kwijtraken gepolariseerde epitheliale cellen de gepolariseerde lokalisatie van vervoerders op het apicale of basolaterale membraan.
Een gemodificeerde patch klemmen meting moet worden gebruikt bij de studie van kanalen en vervoerders in gepolariseerde epitheel. Gezien het feit dat cellen kunnen benaderen in een cilinder in plaats van een bol is belangrijk bij het transformeren van het verloop van H+ in flux via de formule verstrekt. In dit geval moet u de formule wijzigen in 
waar λ de lengte van de cilinder, r is de straal van de cilinder, ad x is de radiale afstand vanaf het middelpunt van de cilinder waarlangs het verloop gemeten5 wordt. Toekomstige ontwikkeling van deze krachtige techniek voor het bestuderen van electroneutral vervoerders moet richten op het wijzigen van de methode voor het optimaliseren van opname cellen gekweekt in een enkelgelaagde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
De auteurs bedank Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, VSA) voor zijn hulp bij het fotograferen en bewerken van de video. De PS120 fibroblast-achtige cellen stabiel uiting van NHE3-wt of NHE3-YRK werden vriendelijk geleverd door Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
