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Biology

इलेक्ट्रो-न्यूट्रल ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के आवेदन

doi: 10.3791/56630 Published: February 3, 2018

Summary

इस पांडुलिपि के अनुप्रयोगों का वर्णन प्रोटॉन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड और पैच clamping तरीकों प्रोटॉन परिवहन प्रणालियों की गतिविधि को मापने के लिए । इन तरीकों सामांयतः प्रोटॉन परिवहन गतिविधि, जैसे उदारवादी संवेदनशीलता, समय संकल्प और अपर्याप्त intracellular वातावरण नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक की कुछ सीमाओं को दूर ।

Abstract

कोशिका झिल्ली के माध्यम से आयनों के परिवहन सेल अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है कि कोशिका के भीतर और बाहर आयन सामग्री के ठीक नियंत्रण सुनिश्चित करता है । ये परिवहन तंत्र विशेष ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की गतिविधियों से मध्यस्थता कर रहे हैं. विशेष रूप से, पीएच गतिशीलता पतले प्लाज्मा झिल्ली प्रोटॉन द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (एच+) बाहर निकालना सिस्टम, जैसे ना+/H+ एक्सचेंजर (NHE) प्रोटीन परिवार । NHE विनियमन अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए व्यापक प्रयासों के बावजूद, NHE परिवार की जैव शारीरिक और आणविक संपत्तियों की हमारी वर्तमान समझ को प्रभावी ढंग से NHE गतिविधि को मापने के लिए तरीकों की सीमित उपलब्धता की वजह से अपर्याप्त है . इस पांडुलिपि में, हम NHE-प्रेरित एच+ प्रवाह को मापने के लिए रिकॉर्डिंग clamping पूरे सेल पैच के दौरान एच+चुनिंदा इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया. हम इस दृष्टिकोण का प्रस्ताव आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के कुछ सीमाओं पर काबू पाने के लिए NHE गतिविधि को मापने, ऐसे रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट झिल्ली permeants के रूप में । वर्णित विधि का उपयोग कर NHE गतिविधि के माप उच्च संवेदनशीलता और समय संकल्प और intracellular H+ सांद्रता के अधिक कुशल नियंत्रण सक्षम बनाता है । H+-चुनिंदा इलेक्ट्रोड तथ्य यह है कि ट्रांसपोर्टर गतिविधि कोशिका झिल्ली के करीब निकटता में एक आयन ढाल बनाता है पर आधारित हैं । एक h+-चयनित इलेक्ट्रोड एक दोहराव, थरथरानवाला फैशन रिकॉर्ड में सेल झिल्ली से ऊपर और दूर चलती है कि एच+ फ्लक्स पर निर्भर है एक वोल्टेज अंतर । h+-चयनित इलेक्ट्रोड कक्ष से बाहर ले जाने के लिए h+ प्रवाह का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि पूरे-कक्ष कॉन्फ़िगरेशन में पैच दबाना विधि intracellular आयन संरचना को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, विशाल पैच दबाना तकनीक के आवेदन न केवल आयनों की intracellular संरचना के संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी लिपिड. NHE isoform 3 (NHE3) के ट्रांसपोर्टर गतिविधि phosphoinositides द्वारा NHE3 विनियमन के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए इस तकनीकी दृष्टिकोण का उपयोग कर मापा गया था.

Introduction

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प्लाज्मा झिल्ली के पार आयनों और solutes के परिवहन कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक है और, इसलिए, जीवों की1. आयनों और solutes के चयनात्मक परिवहन विशेष चैनल और ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की एक सरणी द्वारा हासिल की है । इन प्रोटीन में उत्परिवर्तनों अक्सर नैदानिक स्थितियों की एक किस्म में परिणाम, चैनल और ट्रांसपोर्टर प्रोटीन औषधीय उपचार के लिए संभावित लक्ष्य1। दुर्भाग्य से, चैनल और ट्रांसपोर्टर समारोह और विनियमन अंतर्निहित तंत्र को समझने अक्सर उनके गतिविधि2,3,4अध्ययन करने के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण द्वारा सीमित है ।

विशेष रूप से, ट्रांसपोर्टरों मोटे तौर पर उप हो सकता है कि वे solutes के परिवहन के दौरान सेल transmembrane क्षमता में परिवर्तन के आधार पर दो बड़े समूहों में विभाजित: फेरबदल electrogenic आयन ट्रांसपोर्टरों [जैसे, सोडियम-फॉस्फेट सह-ट्रांसपोर्टर 2a (NaPi2a), सोडियम-कैल्शियम एक्सचेंजर (NCX), आदि.] या गैर फेरबदल electroneutral आयन ट्रांसपोर्टरों [जैसे, सोडियम-प्रोटॉन एक्सचेंजर (NHE), सोडियम-क्लोराइड सह ट्रांसपोर्टर, NaPi2c, आदि.] । ट्रांसपोर्टर्स के दोनों वर्गों की गतिविधियों को बड़े पैमाने पर रेडियोधर्मी आइसोटोप और फ्लोरोसेंट झिल्ली-permeant रंजक2का उपयोग कर का अध्ययन किया गया है । दोनों दृष्टिकोण विशिष्ट cytoplasmic आयनों के थोक एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि का अनुमान है, और दोनों तरीकों की सीमाओं, जैसे उदारवादी संवेदनशीलता और समय संकल्प और intracellular के अपर्याप्त नियंत्रण के रूप में है वातावरण. दरअसल, कई ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि किया आयनों के cytoplasmic एकाग्रता पर निर्भर है (जैसे, NHE3, NCX), और इन आयन सांद्रता में परिवर्तन ट्रांसपोर्टर गतिविधि को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए उम्मीद कर रहे हैं2 , 3 , 5. इन विनियमित तंत्र के सटीक माप शास्त्रीय तरीकों का उपयोग कर सीमित है ।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, ट्रांसपोर्टर गतिविधि2,6का अध्ययन करने के लिए पैच क्लैंप तरीकों का उपयोग किया जाता है । विशेष रूप से, स्व-संदर्भित आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड (ISEs)7,पैच clamping प्रणाली के साथ संयुक्त8 हाल ही में electroneutral ट्रांसपोर्टर गतिविधि3,4 के माप की अनुमति दी है , 5. ISEs तथ्य यह है कि ट्रांसपोर्टर गतिविधि कोशिका झिल्ली के करीब निकटता में एक आयन ढाल बनाता है पर आधारित हैं । एक दोहराव, थरथरानवाला फैशन रिकॉर्ड एक वोल्टेज अंतर (µV) में सेल झिल्ली से और दूर करने के लिए एक िसे चलती है । वोल्टेज मतभेद आयन फ्लक्स में परिवर्तित किया जा सकता है एक अंशांकन विधि है कि प्रसार2,9के पहले कानून फिक लागू होता है का उपयोग कर । जबकि ISEs आयनों कोशिकाओं से बाहर ले जाने के प्रवाह का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, दोनों पूरे सेल या अंदर-बाहर विन्यास में पैच दबाना विधि झिल्ली क्षमता और intracellular आयन संरचना को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, विशाल पैच दबाना तकनीक के आवेदन न केवल आयनों की intracellular संरचना के संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी लिपिड और प्रोटीन3,5.

संक्षेप में, के साथ की तुलना में पैच दबाना विधि की बहुमुखी प्रतिभा के अन्य तरीकों का अध्ययन करने के लिए ट्रांसपोर्टर गतिविधि पैच इन अन्य तरीकों की आम सीमाओं को दूर करने के लिए उपयुक्त clamping बनाया है. आत्म संदर्भित ISEs और पैच दबाना तकनीक का संयोजन एक कसकर नियंत्रित प्रयोगात्मक वातावरण में electroneutral ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को मापने के लिए अद्वितीय संभावना प्रदान करता है और उपंयास भौतिक और आणविक खोज सेल झिल्ली परिवहन के गुण3,4,5। इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक NHE की गतिविधि का अध्ययन किया गया है । स्तनधारी NHE प्रोटीन परिवार extracellular प्रोटॉन (ज+)10,11 का उपयोग एक आवक ना+ ढाल के लिए catalyzes सोडियम (na+) के electroneutral नेट एक्सचेंज । स्तनधारी, NHE प्रोटीन परिवार में 11 संबंधित प्रोटीन (NHE1-9 और NHA1-2) और एक शुक्राणु विशिष्ट NHE10,12,13शामिल हैं ।

NHEs (SLC9a परिवार) सरल prokaryotes से उच्च eukaryotes में सबसे अधिक जीवित जीवों में बैरे पाया जाता है और में सेल लवणता रक्षा को नियंत्रित करने सहित महत्वपूर्ण सेल कार्यों की एक किस्म में शामिल हैं10,11, prokaryotes, अम्ल-आधार homeostasis और कोशिका की मात्रा को बनाए रखने, और विभिन्न विशिष्ट epithelia में नमक और पानी के अवशोषण को विनियमित करने के लिए10,12,14,15. NHEs की प्रमुख जैविक भूमिकाओं और उनके कार्यों के महत्व को कई अध्ययनों के माध्यम से निर्धारित किया गया है; हालांकि, कुछ अध्ययनों methodological सीमाओं के कारण स्तनधारी NHEs के भौतिक और आणविक गुणों की जांच की है4। हाल ही में, स्वयं के आवेदन-संदर्भित ISEs पूरे सेल पैच clamping के दौरान NHE आयनों, प्रोटीन और फॉस्फोलिपिड के intracellular सांद्रता में परिवर्तन द्वारा विनियमित isoforms के उपंयास आणविक तंत्र से पता चला है, 4.

विशेष रूप से, इस पांडुलिपि में प्रदान की प्रोटोकॉल और गतिविधि और NHE isoform 3 (NHE3), एनए के अवशोषण में एक प्रमुख खिलाड़ी के विनियमन के अध्ययन के लिए तरीकों और दृष्टिकोण की रूपरेखा, सीएल-, HCO3- और में तरल पदार्थ गुर्दे और आंत्र epithelia के ब्रश सीमा झिल्ली14,16। intracellular phosphoinositides को NHE3 गतिविधि की संवेदनशीलता में मतभेदों में नई अंतर्दृष्टि (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [pi (4, 5) P2] और phosphatidylinositide 3, 4, 5-ट्राइफॉस्फेट [pi (3, 4, 5] p]) की सूचना दी है । चैनल और ट्रांसपोर्टरों के रूप में सेल परिवहन प्रोटीन, phosphoinositides द्वारा विनियमित रहे हैं17, और NHE3 सीधे दोनों pi (4, 5) P2 और pi (3, 4, 5) p18से बाइंड कर देता है । वर्तमान साहित्य के आधार पर, या तो phosphoinositide के शारीरिक या pathophysiological विनियमन के लिए प्रासंगिक हो सकता है NHE35,18,19। हमारे निष्कर्षों NHE3 गतिविधि के विनियमन में pi (4, 5) P2 और pi (3, 4, 5) p के लिए अलग भूमिकाओं का समर्थन. यह अंतर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में िसे तकनीक के आवेदन के कारण संभव हो गया था । यह तकनीक भी NHE3 गतिविधि की माप के दौरान अलग phosphoinositides के intracellular छिड़काव के माध्यम से phosphoinositide सेलुलर सामग्री के नियंत्रण की अनुमति देता है ।

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Protocol

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नोट: दो एम्पलीफायरों पैच clamping के साथ संयोजन के रूप में एक आत्म संदर्भित िसे द्वारा electroneutral ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक हैं, एक पूरे सेल विन्यास में सेल को बनाए रखने के लिए एक पैच क्लैंप एम्पलीफायर और एक उच्च उपस्थिति एम्पलीफायर ( electrometer) िसे के माध्यम से ट्रांसपोर्टर गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए (सामग्री की तालिका देखें). पैच दबाना एम्पलीफायर सीधे अधिग्रहण बोर्ड टर्मिनल से जुड़ा है । electrometer के लिए फिल्टर और संकेत बढ़ाना उपयोग अंतर एम्पलीफायर से जुड़ा है. अंतर प्रवर्धक अधिग्रहण बोर्ड टर्मिनल से जुड़ा हुआ है । Capmeter, पैच दबाना सॉफ्टवेयर है कि सेल क्षमता पर नज़र रखता है, पिछले अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है20 (सामग्री की तालिका देखें) । रिकॉर्डिंग चैंबर और छिड़काव समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है ।

1. ISEs के लिए पिपेट की तैयारी

  1. borosilicate ग्लास केशिकाओं से पिपेट १.२ mm के एक बाहरी व्यास के लिए खींचो ( सामग्री की तालिकादेखें) पिपेट खींचने का उपयोग2
  2. पोलिश microforge का उपयोग कर पिपेट । पिपेट टिप का व्यास 2-3 µm होना चाहिए ।
  3. पिपेट टिप के साथ पिपेट के लिए एक जार धारक में पिपेट प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    चेतावनी: एक अच्छी तरह हवादार रासायनिक धुएं हुड में 1.4-1.6 कदम प्रदर्शन ।
  4. siliconization मिश्रण है कि बीआईएस के 1 ड्रॉप (~ १५० µ l) से बना है मिश्रण (dimethylamino) dimethyl silane और कार्बन टेट्राक्लोराइड की 10 बूंदें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. जार में siliconization मिश्रण डालो और ढक्कन कसकर बंद ।
  6. मिश्रण पूरी तरह से काफूर हो जाता है जब तक कमरे के तापमान पर एक रासायनिक धुएं हुड में 24-48 ज के लिए siliconization मिश्रण के साथ जार मशीन ।
  7. Backfill उपयुक्त आयन-चयनात्मक राल के साथ पिपेट लगभग 2-4 mm का एक कॉलम बनाने के लिए ।
    नोट: हाइड्रोजन ionophore I कॉकटेल बी usedfor रिकॉर्डिंग NHE गतिविधि हो सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  8. टिप करने के लिए आयन चयनात्मक राल वितरित करने के लिए पिपेट की नोक ठोकर, और पिपेट टिप नीचे के साथ जार धारक में खड़ी पिपेट जगह है ।
  9. Checkunder विदारक माइक्रोस्कोप कि राल कॉकटेल टिप के अंत तक पहुँच गया है । यदि आवश्यक हो, लागू सकारात्मक दबाव अंत करने के लिए राल पुश करने के लिए ।
  10. Backfill उचित समाधान (~ १०० μL) के साथ आधा पिपेट । यहां, १०० mm KCl का उपयोग करें और 10 मिमी HEPES पीएच ७.० में अगर ionophore मैं कॉकटेल का उपयोग कर बी ।
  11. electrometer करने के लिए िसे कनेक्ट और स्नान रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया समाधान में िसे की नोक जगह है । शूंय electrometer ।
  12. परीक्षण H+-नहाने के समाधान का पीएच बदलकर चयनात्मक िसे प्रतिक्रिया । औसत H+-चयनात्मक िसे प्रतिक्रिया पीएच के प्रति यूनिट ~ ५८ एमवी है ।
  13. अंशांकन करने के लिए िसे प्रतिसाद का आवधिक रूप से मूल्यांकन करें ।

2. रिकॉर्डिंग के लिए पैच क्लैंप पिपेट की तैयारी

नोट: विधि एकल चैनल रिकॉर्डिंग पर अपने लेख में डोनाल्ड Hilgemann द्वारा वर्णित21 अनुशंसित है ।

  1. पिपेट खींचने पर borosilicate ग्लास केशिकाओं (२.० mmOD/१.५ mm ID) से विशाल पैच के लिए पिपेट खींचो2,22,23
  2. एक microforge एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर एक विस्तृत पिपेट टिप (10-22 माइक्रोन)23 बनाने के लिए घुड़सवार का उपयोग करें । microforge की मोटी प्लैटिनम तार पर नरम कांच के एक मनका (~ ०.५ एमएल) पिघला ।
    नोट: एक अपेक्षाकृत मोटी प्लैटिनम तार की आवश्यकता है (~ ०.५ mm) के लिए विशाल पैच पिपेट बनाना ।
  3. स्थिति पैच नरम गिलास मनका करने के लिए करीब पिपेट, और पूरी गर्मी लागू जब तक टिप के लिए घटता शुरू होता है । प्लैटिनम तार थोड़ा centerduring हीटिंग की ओर कदम होगा ।
  4. बंद गर्मी बारी है, और नरम गिलास मनका में पिपेट टिप धक्का । ठंडा तार वापस लेने और पिपेट टिप को तोड़ने जाएगा ।
  5. पिपेट टिप चिकनी और वांछित व्यास के एक पिपेट टिप बनाने के लिए गर्मी को फिर से लागू करें । टिप का व्यास इस अध्ययन में (8-10 माइक्रोन) समझौता किया जा करने के लिए सेल के आकार पर निर्भर है ।

3. कोशिकाओं की तैयारी

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर करने के लिए सीए2 + और मिलीग्राम2 +, trypsin-EDTA समाधान और विकास माध्यम के बिना फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) गर्म ।
  2. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । ३५ mm व्यास सेल कल्चर प्लेट के लिए बफर की 1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
  3. ३५ mm व्यास सेल कल्चर प्लेट के लिए कक्षों में ०.५ मिलीलीटर trypsin जोड़ें ।
    नोट: जब कक्ष राउंड-अप करना प्रारंभ करते हैं, तो कक्षों को de-अनुलग्न करने के लिए प्लेट हिलाएं ।
  4. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक पूरा विकास मध्यम के 5 मिलीलीटर (३५ मिमी व्यास सेल संस्कृति प्लेट के लिए राशि) जोड़कर trypsin कार्रवाई बंद करो ।
    नोट: trypsin में प्रतिक्रिया समय निर्भर कक्ष-प्रकार है ।
  5. झुरमुट के गठन को रोकने के लिए कमाल के साथ एक शेखर पर कोशिकाओं प्लेस ।
  6. trypsinization के बाद 2 h तक के लिए कक्षों का उपयोग करें ।
    नोट: समय कक्ष रेखा के आधार पर भिंन हो सकता है ।

4. एक इंट्रा पिपेट छिड़काव प्रणाली की तैयारी

  1. इंट्रा पिपेट छिड़काव लाइन तैयार करने के लिए क्वार्ट्ज टयूबिंग (१५० µm आयुध डिपो/७५ µm आईडी) का एक उचित आकार में कटौती ।
  2. एक २०० µ एल पिपेट टिप में क्वार्ट्ज टयूबिंग के एक तरफ डालें । गोंद टिप पर क्वार्ट्ज टयूबिंग, और एक तेज उस्तरा ब्लेड के साथ टिप के अंत में कटौती ।
  3. छिड़काव लाइन कनेक्ट (क्वार्ट्ज टयूबिंग टिप से चिपके) सिलिकॉन टयूबिंग का एक छोटा सा टुकड़ा है कि इंट्रा पिपेट छिड़काव समाधान के लिए एक जलाशय के रूप में काम करेगा करने के लिए ।
  4. एक सिरिंज के लिए सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट सकारात्मक दबाव बनाने के लिए ।
  5. छिड़काव बंदरगाह के पिपेट धारक की पॉलीथीन ट्यूब के माध्यम से क्वार्ट्ज टयूबिंग के मुक्त अंत डालें ( सामग्री की तालिकादेखें).
  6. पिपेट समाधान के साथ छिड़काव लाइन का मूल्यांकन करें ।

5. समाधान की तैयारी

  1. रिकॉर्डिंग NHE (११५ mM पोटेशियम aspartate (KAsp) के लिए एक भारी buffered पिपेट समाधान तैयार, 1 मिमी EGTA, ०.५ मिमी MgCl2, 10 मिमी मिलीग्राम-एटीपी, १२.५ मिमी HEPES, १२.५ मिमी पाइप, १२.५ मिमी MOPS, और १२.५ मिमी एमईएस, पीएच ६.० एसपारटिक एसिड के साथ समायोजित).
    नोट: स्टॉक पिपेट समाधान और फ़िल्टर तैयार करें । रिकॉर्डिंग से पहले एमजी-एटीपी जोड़ें ।
  2. एक ताजा स्नान समाधान हर बार (१४० mm NaCl, 2 mm CaCl2, 2 mm MgCl2, और ०.१ mm Tris-HCl pH ८.२) तैयार करें ।

6. ट्रांसपोर्टर गतिविधि की रिकॉर्डिंग

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग चैंबर और सभी समाधान बनाए रखें, क्योंकि ट्रांसपोर्टर गतिविधि तापमान पर निर्भर है ।
  2. कक्षों को रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें । रुको जब तक वे चैंबर के नीचे करने के लिए छोड़ देते हैं, लेकिन उन्हें चैंबर के लिए संलग्न नहीं करते.
  3. कोई उपयुक्त कक्ष चुनें । नेत्र माइक्रोमीटर के साथ कोशिका के व्यास को मापने । समान व्यास वाले कक्ष चुनें.
    नोट: आम तौर पर, एक बड़े सेल अधिक सेलुलर सतह और संभवतः अधिक ट्रांसपोर्टरों अपनी प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त किया है, इस प्रकार भी अधिक ट्रांसपोर्टर गतिविधि हो जाएगा । हालांकि, यह जरूरी सही नहीं है, के रूप में ट्रांसपोर्टर गतिविधि विशिष्ट ट्रांसपोर्टर और अध्ययन के तहत सेल प्रकार पर निर्भर करता है ।
  4. माउंट आयन-चयनात्मक microelectrode पिपेट micromanipulator, backfill पिपेट समाधान के साथ पैच-clamping intracellular, सुनिश्चित करें कि समाधान पिपेट2के टिप तक पहुंचता है ।
    नोट: यह पिपेट की नोक में बुलबुले को खत्म करने के लिए कई कोमल नल की आवश्यकता हो सकती है.
  5. माउंट पैच-clamping पिपेट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के सिर मंच करने के लिए सेट करें2,22,23
    नोट: यह एक उच्च प्रतिरोधी मुहर के गठन के लिए उपयुक्त है कि पिपेट के लिए एक प्रवेश कोण सुनिश्चित करता है के रूप में, क्षैतिज अक्ष के लिए एक ४५ डिग्री के कोण के बारे में सिर मंच रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. एक छोटे से सकारात्मक दबाव लागू करें (~ 5 cm H2O) पैच पिपेट करने के लिए टिप को अवरुद्ध करने का मौका कम करने के लिए, और यह स्नान समाधान में जगह है ।
  7. एक बार टिप कक्ष के करीब है पैच क्लैंप पिपेट चलती बंद करो ।
  8. सकारात्मक दबाव से छुटकारा जबकि पिपेट छू सेल और थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू (~ 5 cm H2O) प्राप्त करने के लिए एक > 1000 MΩ (एक गीगा-ओम) पिपेट पैच के साथ सेल झिल्ली पर मुहर23
  9. िसे के रूप में एक ही फोकल विमान में सेल के साथ पैच पिपेट प्लेस, और िसे (~ 5-10 µm) के लिए निकटता में सेल के साथ पैच पिपेटकदम2, 5 लेकिन सेल िसे(आंकड़ा 1a) से संपर्क करने की अनुमति देने से बचें ।
  10. विश्वास दिलाता हूं कि होल्डिंग क्षमता 0 एमवी है ।
  11. पूरे सेल विन्यास प्राप्त करने के लिए लघु चूषण की श्रृंखला के साथ सील टूटना ।
  12. ट्रांसपोर्टर (चित्र 1b) की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए िसे (या पैच क्लैंप पिपेट) को धीमे बाएं-दाएं या ऊपर-नीचे ले जाएं ।
  13. रिकॉर्ड कम से 5-8 चोटियों (चित्रा 1C, से बी) ।
  14. सील और कोशिका झिल्ली समाई की गुणवत्ता की निगरानी करने के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान वर्ग तरंग perturbations लागू करें (चित्रा 1).
  15. h+ फ्लक्स () कक्ष सतह और बल्क समाधानEquation 1(ΔH+) के बीच नि: शुल्क h+ एकाग्रता में अंतर से अनुमान लगाएं
    Equation 2
    Equation 3
    नोट: और H Equation 4 + और बफ़र प्रसार Equation 5 गुणांक क्रमशः, BT कुल बफ़र एकाग्रता है, KD बफ़र की पृथक्करण स्थिरांक है, r कक्ष है त्रिज्या, और मुक्त एच Equation 6 +में एक छोटे से परिवर्तन के लिए बाध्य एच+ की एकाग्रता में स्थिर राज्य परिवर्तन निर्धारित करता है । एच+ समाधान में एक मुक्त प्रोटॉन इंगित करता है । पिछले अध्ययनों के अनुरूप होने के लिए, H+ फ्लक्सEquation 13,5में प्रवाह (/faraday) के वर्तमान समकक्ष की गणना करके electrophysiological फ्लक्स इकाइयों में परिवर्तित कर रहे हैं ।
  16. कोशिका की सतह कि कोशिका आकार या झिल्ली समाई से गणना की जा सकती करने के लिए प्रोटॉन फ्लक्स को सामान्य.

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Representative Results

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पूरी सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान एक स्व-संदर्भित िसे phosphoinositides द्वारा NHE3 गतिविधि के विनियमन का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था । PS120 fibroblast-की तरह कोशिकाओं को24, जो अंतर्जात प्लाज्मा झिल्ली NHEs की अभिव्यक्ति की कमी, इस्तेमाल किया गया । NHE3 जंगली-प्रकार (NHE3-wt) या NHE3 म्यूटेंट है कि नहीं बांध phosphoinositides [tyrosine ५०१, arginine ५०३ और lysine ५०५ alanine के साथ प्रतिस्थापित किया गया, Y501A/R503A (K505A-NHE3)] छुरा YRK PS120 में व्यक्त किए गए थे-जैसे कोशिकाओं18

अंश चित्रा 2में प्रस्तुत किए गए हैं । सेल heldin पैच clamping के लिए एक पिपेट द्वारा एक पूरे सेल विंयास था, और िसे कक्ष के सामने रखा गया था । इस स्थिति में, िसे मुक्त एच की एकाग्रता दर्ज की गई+ सेल झिल्ली (चित्रा 1a) के लिए बंद; फिर, िसे (या पैच दबाना पिपेट) मैंयुअल रूप से बाद में ५० µm चला गया और समाधान (चित्र 1b) में नि: शुल्क एच+ की एकाग्रता दर्ज की गई । दर्ज वोल्टेज मतभेद, िसे से दूर या के सामने सेल के साथ पैच पिपेट के दो पदों के लिए इसी, NHE3 गतिविधि (चित्रा 1C) के प्रतिनिधि हैं. apyrase (एटीपी-diphosphatase) के इंट्रा-पिपेट छिड़काव में एटीपी की intracellular एकाग्रता घट जाती है, बाद में phosphoinositide कंटेंट5कम हो जाता है । के साथ समझौते में पहले की रिपोर्ट अध्ययन5,18,19, घटी हुई phosphoinositide सामग्री apyrase उपचार द्वारा मध्यस्थता कम NHE3 गतिविधि (~ ५०%), जो वोल्टेज में कमी के रूप में दर्ज किया गया था दोलन आयाम (चित्र 2) । NHE3 गतिविधि पर apyrase (5 इकाइयों/एमएल पर दिया) का प्रभाव पूरी तरह से 2 apyrase एम PI के साथ संयोजन में µ के इंट्रा पिपेट छिड़काव द्वारा उलट गया था (3, 4, 5) पी 1 (चित्रा 2 और 3 ए) । इन निष्कर्षों NHE3 PS120 कोशिकाओं में दर्ज की गतिविधि छुरा NHE3 म्यूटेंट (NHE3-YRK) कि phosphatidylinositides18बांध करने में असमर्थ थे व्यक्त द्वारा समर्थित थे । अकेले या PIP3 के साथ संयोजन में apyrase की छिड़काव NHE3 में NHE3 की गतिविधि को प्रभावित नहीं किया-YRK म्यूटेंट (चित्र बी) । अंतर्जात NHE3 की गतिविधि भी ओपस्सम गुर्दे (ठीक) कोशिकाओं में apyrase उपचार द्वारा बाधित किया गया था3. PI के इंट्रा पिपेट छिड़काव (3, 4, 5) पी 2 ठीक कोशिकाओं में apyrase द्वारा प्रेरित NHE3 गतिविधि के निषेध उलट (चित्रा 3सी). इन निष्कर्षों का सुझाव है कि PI का प्रभाव (3, 4, 5) NHE3 गतिविधि पर p सेल प्रकार-विशिष्ट नहीं है ।

इसके बाद, हम NHE3 गतिविधि में apyrase-मध्यस्थता परिवर्तन को विनियमित करने पर PIP3 की विशिष्टता का परीक्षण करने का उद्देश्य । हम इस तरह PI (4, 5) P2 के रूप में अन्य phosphoinositides के छिड़काव के बाद NHE3 गतिविधि पर apyrase-निर्भर कमी पर प्रभाव परख द्वारा किया. PI (4, 5) P2 (पर 10 µ m) apyrase द्वारा मध्यस्थता की घटी हुई NHE3 गतिविधि को प्रभावित नहीं किया (चित्र 4a) । अंत में, AMP-PNP, एक गैर-hydrolysable एटीपी एनालॉग के छिड़काव, NHE3 गतिविधि के theapyrase-निर्भर अवरोध (चित्रा 4B) ब्लॉक नहीं किया । इन निष्कर्षों pi की एक भूमिका (3, 4, 5) पी 2 का सुझाव है, लेकिन नहीं pi (4, 5) P2, NHE3 के विनियमन में एटीपी कमी के बाद । pi के लिए अलग भूमिकाओं की पहचान (4, 5) P2 और pi (3, 4, 5) p NHE3 विनियमन में केवल क्योंकि phosphoinositides के सेलुलर छिड़काव के िसे माप पूरे सेल पैच दबाना के साथ संयुक्त के दौरान संभव था5रिकॉर्डिंग । pi की एक विशिष्ट कार्रवाई (3, 4, 5) पी पी के बजाय NHE3 गतिविधि के विनियमन में pi (4, 5) P2 की तुलना में अलग intracellular phosphoinositides NHE3 के समारोह को विनियमित कि क्या निर्धारित करने के लिए मूल्यवान है ।

Figure 1
चित्र 1 . H+ फ्लक्स माप और NHE गतिविधि और पीएच microelectrode द्वारा दर्ज संभावित मतभेदों के बीच सहसंबंध के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ।
रिकॉर्डिंग की स्थापना के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । प्रारंभिक प्रायोगिक सेटिंग का A. आरेख । सेल पैच क्लैंप पिपेट द्वारा पूरे सेल विन्यास में आयोजित किया जाता है और िसे के सामने रखा गया है । इस स्थिति में, िसे मुक्त एच की एकाग्रता रिकॉर्ड+ कक्ष झिल्ली के करीब । B. the िसे (या पैच दबाना पिपेट) मैन्युअल रूप से बाद में ले जाया गया है ~ ५० µm और इस स्थिति में समाधान में नि: शुल्क एच+ की एकाग्रता रिकॉर्ड. वोल्टेज अंतर का C. ग्राफिक प्रतिनिधित्व िसे का उपयोग कर दर्ज की गई. एक स्थान से दोलन (िसे के सामने कक्ष) बी करने के लिए (िसे से दूर सेल) NHE गतिविधि के प्रतिनिधि हैं. सॉफ्टवेयर वोल्टेज िसे द्वारा दर्ज अंतर दर्ज की गई और वर्ग तरंग perturbations (20 एमवी, ०.२ kHz) कोशिका झिल्ली समाई और पैच दबाना सील की गुणवत्ता पर नजर रखने के लिए पंजीकृत किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . एक एकल PS120 सेल में छुरा NHE3 ट्रांसपोर्टर गतिविधि के लिए सेट के उदाहरण के पहले और बाद छिड़काव और PI (3, 4, 5) पी 1 (apyrase) के साथ PIP3 के बाद NHE3-wt व्यक्त ।
शुरुआती रिकार्डिंग के बाद सेल ने एटीपी के इंट्रा-पिपेट छिड़काव ऑफ apyrase को समाप्त कर दिया था । NHE3 गतिविधि में धीरे कम और PIP3 इंट्रा पिपेट छिड़काव द्वारा बहाल किया गया था । Apyrase इसके अलावा लाल पट्टी द्वारा संकेत दिया है, और PIP3 इसके अलावा हरी पट्टी द्वारा संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . PS120 और ठीक कोशिकाओं में NHE3 ट्रांसपोर्टर गतिविधि पर एटीपी कमी और PIP3 छिड़काव का प्रभाव ।
NHE3 गतिविधि पर apyrase-मध्यस्थता एटीपी कमी का प्रभाव और PIP3 इंट्रा-पिपेट छिड़काव द्वारा प्रेरित NHE3 गतिविधि पर apyrase के प्रभाव को बचाकर: PS120 कोशिकाओं NHE3-wt या बी. PS120 कोशिकाओं को व्यक्त NHE3-YRK, NHE3 म्यूटेंट को बाँधने में असमर्थ phosphoinositides. C. OK cells व्यक्त अंतर्जात NHE3 । ठोस वृत्त व्यक्तिगत प्रयोगों (चार प्रयोग समान स्थितियों में निष्पादित) से औसत डेटा दिखाते हैं । त्रुटि पट्टियों का अर्थ है ± मानक त्रुटियां (SE) । * P < ०.०५ बनाम नियंत्रण, ANOVA । $ p < ०.५, $ $p < ०.०१ apyrase vs apyrase + PIP3, ANOVA. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . PI का प्रभाव (4, 5) P2 (PIP2) और अनप-PNP एटीपी कमी के बाद NHE3 गतिविधि पर छिड़काव.
का प्रभाव PIP2 या बी. अनप-PNP इंट्रा-पिपेट छिड़काव पर apyrase-निर्भर कमी NHE3 कोशिकाओं में PS120 गतिविधि के NHE3-wt व्यक्त । ठोस हलकों व्यक्तिगत प्रयोगों (चार प्रयोगों समान स्थितियों में प्रदर्शन) से औसत डेटा दिखाते हैं । त्रुटि पट्टियों का अर्थ है ± SE. * p < ०.०५, * * p < ०.०१ बनाम नियंत्रण, ANOVA का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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ट्रांसपोर्टरों के महत्वपूर्ण कार्यों के बावजूद, उनकी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों अप्रभावी और अपर्याप्त हैं । एक सीमा है कि उपलब्ध तरीकों को मापने आयन प्रयोग के दौरान intracellular आयन संरचना में उतार चढ़ाव पर विचार के बिना ट्रांसपोर्टर गतिविधि से मध्यस्थता आंदोलन4। प्रस्तुत विधि extracellular और intracellular आयन रचनाओं की सटीक नियंत्रण सुनिश्चित करता है और intracellular आयन, प्रोटीन और लिपिड रचनाएं3,4,5को संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण उपलब्ध कराता है ।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक िसे है कि एक लंबी अवधि के लिए स्थिर है की तैयारी है25। हमारे अनुभव में, एक अस्थिर िसे अच्छी तरह से नहीं है (जैसे, आयन-चयनात्मक राल िसे पिपेट पक्षों पर पुनः वितरित किया जाता है), जो िसे संकेत में एक स्थिर और बेकाबू बहाव के द्वारा पता लगाया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, िसे में राल वितरण बारीकी से प्रयोग के दौरान निगरानी की जानी चाहिए । स्नान समाधान िसे पिपेट अंदर आयन चयनात्मक राल धक्का हो सकता है, राल25से पहले स्नान समाधान का एक कॉलम बनाने । इस मामले में, िसे इस कॉलम से आयन एकाग्रता रिकॉर्ड और प्रयोग के दौरान आयन ढाल में परिवर्तन करने के लिए निष्क्रिय हो जाएगा । िसे की ज्यामिति समायोजन १०० ms9 की श्रेणी में एक िसे प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए कुंजी है और िसे समय में संभव देरी-प्रतिक्रियाओं आयन ढाल में परिवर्तन के साथ की तुलना में दूर ।

प्रस्तुत विधि की प्रमुख सीमा में उपकला कोशिकाओं में ट्रांसपोर्टर गतिविधि के पैच clamping माप से विरासत में मिला है । जब समर्थन से अलग और निलंबन में बनाए रखा, ध्रुवीकरण उपकला कोशिकाओं शिखर या basolateral झिल्ली पर ट्रांसपोर्टरों के ध्रुवीकरण स्थानीयकरण खो सकता है.

एक संशोधित पैच clamping माप उपयोग किया जाना चाहिए जब का अध्ययन चैनल और ट्रांसपोर्टरों में ध्रुवीकरण epithelia । यह देखते हुए कि कोशिकाओं के बजाय एक क्षेत्र में एक सिलेंडर में अनुमानित हो सकता है महत्वपूर्ण है जब प्रवाह में एच+ ढाल के फार्मूले के माध्यम से प्रदान की । इस मामले में, सूत्र के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए जहां λ सिलेंडर की लंबाई है, आर सिलेंडर त्रिज्या है, विज्ञापन एक्स सिलेंडर मध्यबिंदु है जिस पर ढाल Equation 7 5मापा जाता है से रेडियल दूरी है । electroneutral ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए इस शक्तिशाली तकनीक के भविष्य के विकास के लिए एक monolayer में उगाया रिकॉर्डिंग कोशिकाओं को अनुकूलित करने के लिए विधि को संशोधित करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखक एरिक Fishback (des Moines विश्वविद्यालय, डेस Moines, आयोवा, संयुक्त राज्य अमेरिका) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा शूटिंग और वीडियो संपादन के साथ उनकी सहायता के लिए । PS120 fibroblast की तरह NHE3-wt या NHE3-YRK पर छुरा व्यक्त कर रहे थे कृपया डॉ मार्क Donowitz (जॉंस हॉपकिंस मेडिसिन, बाल्टीमोर, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय स्कूल) द्वारा प्रदान की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Patch clamp Amplifier Molecular Devices
Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) Warner Instruments 64-1650
Differential Amplifier (DP-301) Warner Instruments 64-0044
Patch Clamp Software Based on MatLab MatLab with acquisition toolbox The capmeter software is recommended
ThermoClamp-1 Temperature Control System  AutoMate Scientific 03-11-LL In-line heater
Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) Warner Instruments 64-2400
Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing World Precision Instruments 1B120F-3   Used for ion selective electrodes
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E212
Bis(dimethylamino)dimethylsilane Sigma-Aldrich 14755-100ML
Carbon tetrachloride Sigma-Aldrich 319961-500ML
Hydrogen ionophore I - cocktail B Sigma-Aldrich 95293
Thin Wall Borosilicate Tubing  Sutter Instrument B200-156-15 Used for patch clamp pipette 
Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) Warner Instruments 64-0815
Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) Molex (Polymicro Technologies) 106815-0018 Used for intra-pipette perfusion system
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium aspartate  Sigma-Aldrich A6558
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M4880
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187
HEPES Sigma-Aldrich H3375
PIPES Sigma-Aldrich P6757
MOPS Sigma-Aldrich M1254
MES Sigma-Aldrich M3671
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Tris Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Apyrase Sigma-Aldrich A6535
Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-3908

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References

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इलेक्ट्रो-न्यूट्रल ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के आवेदन
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Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).More

Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).

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