Summary
이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.
Abstract
세포 세포 막을 통해 이온의 수송 이온 콘텐츠 내부 및 외부 셀을 셀 생존을 위한 필수 불가결의 정밀한 제어를 보장 합니다. 이러한 전송 메커니즘 전문된 운송업 자 단백질의 활동에 의해 중재 됩니다. 특히, pH 역학 가늘게 나+같은 플라즈마 멤브레인 양성자 (H+) 압출 시스템에 의해 제어 됩니다 /H+ 교환기 (NHE) 단백질 가족. NHE 레 귤 레이 션을 기본 메커니즘을 연구를 광범위 한 노력에도 불구 하 고 NHE 가족의 속성과 분자 생물의 우리의 현재 이해 부족 하다 NHE 활동을 효과적으로 측정 하는 방법의 한정 된 가용성 때문에 . 이 원고에서는 사용 하는 H+-전체 셀 중 선택적 전극 패치 NHE 유도 H+ 플럭스 측정을 클램핑 기록. 우리는 일반적으로의 약간의 한계를 극복 하기 위해이 방법은 방사성 글귀 등 형광 막 permeants NHE 활동을 측정 하 방법을 사용을 제안 했다. 설명한 메서드를 사용 하 여 NHE 활동의 측정에는 높은 감도 및 시간 분해능 및 세포내 H+ 농도의 효율적 제어 수 있습니다. H+-선택적 전극은 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. H+-선택적 전극까지 이동 및 반복, 진동 방식에서 세포 막에서 멀리 기록 전압 차이 H+ 유량에 따라 달라 집니다. 동안 H+-선택적 전극 전체 셀 구성에서 패치 클램프 방법 세포내 이온 구성을 제어 하는 셀을 이동 하는 H+ 플럭스 감지 하는 데 사용 됩니다. 또한, 거 대 한 패치 클램프 기술 적용의 이온 뿐만 아니라 지 질의 세포내 구성의 수정 수 있습니다. NHE isoform (NHE3) 3의 운송업 자 활동 phosphoinositides에 의해 NHE3 규정의 분자 기초 연구이 기술 접근을 사용 하 여을 측정 했다.
Introduction
이온과 플라즈마 막에 걸쳐 용액의 세포의 그리고, 따라서, 생물1의 생존을 위해 필수적 이다. 이온과 용액의 선택적 전송 전문된 채널 및 운송업 자 단백질의 배열에 의해 이루어집니다. 이 단백질에 돌연변이 다양 한 렌더링 약리 치료1채널 및 운송업 자 단백질 잠재적인 목표 임상 조건에에서 수시로 유래한 다. 불행히도, 기본 채널 및 전송 기능 및 규정 하는 메커니즘을 이해 종종 그들의 활동2,,34공부에 사용할 수 있는 방법에 의해 제한 됩니다.
특히, 전송기 분할 될 수 있다 약 하 그들은 용액의 전송 동안 세포 막 횡단 잠재력을 변경 여부에 따라 두 개의 큰 그룹으로: 변경 electrogenic 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨 인산 염 공동 수송 2a (NaPi2a), 나트륨 칼슘 교환기 (NCX), 등.] 또는 비 변경 electroneutral 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨-양성자 교환기 (NHE), 염화 나트륨 공동 전송, NaPi2c, 등.]. 전송기의 두 클래스의 활동의 방사성 동위 원소를 사용 하 여 광범위 하 게 연구 하 고 막 permeant 형광 염료2. 두 가지 방법을 특정 세포질 이온의 대량 농도 변화를 측정 하 여 전송기의 활동을 예측 하 고 두 메서드 모두 제한이, 온건한 감도 및 시간 해상도 세포내의 부적절 한 제어 등 환경입니다. 실제로, 많은 전송기의 활동 (예를 들어, NHE3, NCX), 월된 이온의 세포질 농도에 따라 달라 집니다 및 이러한 이온 농도에 변화 전송 활동2 를 조절에 중요 한 역할을 할 것으로 예상 된다 , 3 , 5. 이러한 규정적 메커니즘의 정확한 측정은 고전적인 방법을 사용 하 여 제한.
이러한 한계를 극복 하기 위해 패치 클램프 방법 전송 활동2,6를 공부 하는 데 사용 됩니다. 특히, 클램핑 시스템 패치를 함께 자체 참조 이온 선택적인 전극 (ISEs)7,8 최근 있었습니다 electroneutral 운송업 자 활동3,4 의 측정을 , 5. ISEs는 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. 이 세 하 고는 반복에 세포 막에서까지 이동, 진동 패션 (µ V)의 전압 차이 기록 합니다. 전압 차이 보급2,9Fick의 첫번째 법률을 적용 하는 교정 메서드를 사용 하 여 이온 플럭스 값으로 변환할 수 있습니다. ISEs는 사용의 밖으로 이동 하는 이온의 유출을 감지 하 세포, 두 전체 셀에 패치 클램프 방법 또는 내부 구성 막 잠재력과 세포내 이온 구성을 제어 하는 데 사용 됩니다. 또한, 응용 프로그램의 거 대 한 패치 클램프 기술 이온 뿐만 아니라 지질과 단백질3,5의 세포내 구성의 수정 수 있습니다.
요약, 패치 클램프 방법의 다양성에 비해 그 공부는 다른 방법의 운송업 자 활동 했다 패치 클램핑 다른 이러한 방법의 일반적인 한계를 극복 하기 위해 적당 한. 자체 ISEs 및 패치 클램프 기술 참조의 조합 electroneutral 전송기 긴밀 하 게 통제 된 실험 환경에서의 활동을 측정 하 고 소설 생물 분자를 독특한 가능성을 제공 합니다. 세포 막의 수송3,,45. 이 접근은 NHE의 활동 공부를 성공적으로 사용 되었습니다. 포유류 NHE 단백질 가족 세포내 양성자 (H+)10,11 안으로 나+ 그라데이션 활용에 대 한 세포 외의 나트륨 (Na+)의 electroneutral net 교환 catalyzes. 포유류, NHE 단백질 가족 11 관련된 단백질 (NHE1-9 및 NHA1-2)와 정자 특정 NHE10,,1213포함 됩니다.
NHEs (SLC9a 가족) 편 높은 진핵생물에 간단한 원핵생물에서 대부분 살아있는 유기 체에서 발견 되 고 중요 한 셀 함수10,11에 셀 염 방어 제어 등의 다양 한 참여 원핵생물, 산 기초 항상성 및 셀 볼륨을 유지 하 고 다양 한 전문된 epithelia10,12,,1415에 소금과 물을 흡수 조절 NHEs의 주요 생물학 역할 및 그들의 기능의 중요성; 여러 연구를 통해 결정 그러나, 몇 가지 연구 방법론 한계4때문에 포유류 NHEs의 속성과 분자 생물 조사 했습니다. 최근, 자체 ISEs 전체 셀 패치 클램핑 하는 동안 참조의 응용 NHE isoforms 이온, 단백질, 인지질3의 세포내 농도 있는 변화에 의해 규제의 새로운 분자 메커니즘을 밝혔다합니다 4.
특히,이 원고에 제공 된 프로토콜 설명 방법 및 활동을 연구 하 고 규제 NHE isoform 3의 (NHE3) 나+, Cl-, HCO3- 및 액체의 흡수에 중요 한 선수에 대 한 접근은 솔 국경 막 신장 및 장 epithelia14,16. 세포내 phosphoinositides에 NHE3 활동의 감도에 차이에 대 한 새로운 통찰력 (phosphatidylinositide 4, 5 bisphosphate [PI (4, 5) P2] 및 phosphatidylinositide 3,4,5 3 인산 염 [PI(3,4,5]P3]) 보고. 채널 및 전송기, 같은 세포 수송 단백질 phosphoinositides17에 의해 통제 되 고 NHE3는 직접 PI (4, 5) P2 및 P3 파이 (3,4,5)18를 바인딩합니다. 현재 문학을 바탕으로, 어느 phosphoinositide NHE35,,1819의 생리 적 또는 병 태 생리 규제에 대 한 관련 수 있습니다. 우리의 연구 결과 PI (4, 5) P2와 파이 (3,4,5) P3 NHE3 활동의 규칙에 대 한 별도 역할을 지원합니다. 이 구별이 세 기술 함께 전체 셀 패치 클램프 기록의 응용 프로그램 때문에 가능 했다. 이 기술에는 또한 NHE3 활동의 측정 하는 동안 다른 phosphoinositides의 세포내 관류를 통해 phosphoinositide 세포 내용 제어할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 두 개의 앰프는 패치 클램핑, 전체 셀 구성 및 높은 들이 닥 침 증폭기 (에 셀을 유지 하기 위해 패치 클램프 앰프와 함께에서 자체 참조이 세 여 electroneutral 전송기의 활동을 기록 하는 데 필요한 전위 계)는이 세 통해 전송 활동을 기록 하 (재료의 표 참조). 패치 클램프 앰프 터미널 수집 보드에 직접 연결 됩니다. 전위 계는 신호를 증폭 및 필터링을 활용 하는 차동 증폭기에 연결 된다. 차동 증폭기는 터미널 수집 보드에 연결 됩니다. Capmeter, 셀 용량을 모니터링 하는 패치 클램프 소프트웨어 이전 연구20 에 사용 되었습니다 (재료의 표 참조). 녹음 실 및 관류 솔루션 37 ° c.에 유지 된다
1입니다. 펫 ISEs에 대 한 준비
- 1.2 m m의 외부 직경을 붕 규 산 유리 모 세관에서 펫을 당겨 ( 재료의 표참조) 피 펫 끌어당기는2 를 사용 하 여.
- 폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫. 피 펫 팁의 직경은 2-3 µ m 이어야 한다.
- 펫에 대 한 병 보유자에는 펫 피 펫 팁 ( 테이블의 자료참조)을 향하도록 넣습니다.
주의: 환기가 화학 증기 두건에서 1.4-1.6 단계를 수행 합니다. - Bis (dimethylamino) 디 메 틸 실 란 및 사염화 탄소 10 방울 1 방울 (~ 150 µ L)의 구성 된 siliconization 혼합물을 혼합 ( 재료의 표참조).
- 항아리에 siliconization 혼합물을 부 어 하 고 단단히 뚜껑을 닫습니다.
- 혼합물은 완전히 증발 때까지 실내 온도에 화학 증기 두건에서 24-48 h에 대 한 siliconization 혼합 항아리를 품 어.
- 약 2-4 mm의 열을 만드는 백필 적절 한 이온 선택적 수 지와 피 펫.
참고: 수소 ionophore 나 칵테일 B usedfor 녹음 NHE 활동 일 수 있다 ( 재료의 표참조). - 팁에 이온 선택적 수 지를 배포 하는 피 펫의 끝을 누르고 아래로 피 펫 피 펫 팁 용기 거치대에 세로로 배치.
- Checkunder 해 현미경 수 지 칵테일 팁의 끝에 도달 했습니다. 필요한 경우, 긍정적인 압력 끝에 수 지를 적용.
- 적절 한 솔루션으로 백필 반 피 펫 (~ 100 μ). 여기,를 사용 하 여 100 mM KCl와 10 mM HEPES pH 7.0에서 ionophore 사용 하는 경우 나 칵테일 b.
- ISE는 전위 계에 연결 고 ISE의 팁 목욕 솔루션 기록을 위해 사용 합니다. 제로 전위 계.
- H+테스트-목욕 해결책의 pH를 변경 하 여 선택이 세 응답. 평균 H+-선택적 세 응답은 ~ 58 단위 pH 당 mV.
- 주기적으로 교정에이 세 응답을 평가 합니다.
2. 기록에 대 한 패치 클램프의 준비 펫
참고: 단일 채널 녹화21 에 그의 기사에서 도널드 Hilgemann에 의해 설명 하는 방법은 것이 좋습니다.
- 붕 규 산 유리 모 세관에서 거 대 한 패치에 대 한 펫을 당겨 (2.0 mmOD / 1.5 m m ID) 피 펫 끌어당기는2,,2223에.
- microforge를 사용 하 여 다양 한 피 펫 팁 (10-22 μ m)23을 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 장착. 구슬을 녹여 (~ 0.5 mL)는 microforge의 두꺼운 백 금 철사에 부드러운 유리의.
참고: 상대적으로 두꺼운 백 금 철사는 필요한 거 대 한 패치 펫 조작 하 (~0.5 m m). - 부드러운 유리 구슬 가까운 패치 피펫으로 놓고 팁 손을 떼 다 때까지 전체 열을 적용. 백 금 철사 난방 centerduring 쪽으로 약간 이동 합니다.
- 열을 끄고 부드럽게 유리 구슬에 피 펫 팁을 밀어. 냉각 와이어 철회 하 고 피 펫 팁을 깰 것 이다.
- 부드럽게 피 펫 팁을 원하는 직경의 피 펫 팁을 만들 열을 다시 적용 합니다. 팁의 직경에 따라 달라 집니다 수를 셀의 크기 패치 (이 연구에서 8-10 μ m).
3입니다. 셀의 준비
- 워밍업 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 트립 신-EDTA 솔루션 성장 매체를 37 ° c.에 인산 염 버퍼 염 분 (PBS)
- PBS로 두번 세척 세포입니다. 버퍼의 1 mL를 사용 하 여 35mm 직경 셀 문화 접시.
- 35 m m 직경 셀 문화 접시에 있는 셀에 트립 신 0.5 mL를 추가 합니다.
참고: 셀 시작 라운드-최대, 드 셀 연결 플레이트를 흔들. - 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 하는 완전 한 성장 매체의 5 mL (35 m m 직경 셀 문화 접시에 대 한 금액)를 추가 하 여 트립 신 작업을 중지 합니다.
참고: 트립 신에 반응 시간은 셀 종속. - 덩어리의 형성을 방지 하기 위해 락을 통에 세포를 놓습니다.
- Trypsinization 후 최대 2 시간에 대 한 셀을 사용 합니다.
참고: 시간 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 내 피 펫 관류 시스템의 준비
- 석 영 튜브의 적절 한 크기로 잘라 (150 µ m OD / 75 µ m ID) 내 피 펫 관류 라인을 준비 하.
- 200 µ L 피 펫 팁에 석 영 튜브의 한쪽을 삽입 합니다. 팁에 석 영 튜브를 접착제와 날카로운 면도날으로 팁의 끝을 잘라.
- 실리콘 튜브 내 피 펫 관류 솔루션에 대 한 저수지 역할을의 작은 조각에 관류 선 (석 영 튜브 끝에 붙어)를 연결 합니다.
- 긍정적인 압력을 만들려고 주사기에 실리콘 튜브를 연결 합니다.
- 삽입은 관류의 피 펫 소유자의 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 석 영 튜브의 무료 끝 포트 ( 재료의 표참조).
- 피 펫 솔루션 관류 라인을 평가 합니다.
5입니다. 솔루션의 준비
- NHE (115 mM 칼륨 aspartate (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 m m MgCl2, 10 m m Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 m m, 12.5 m m MOPS, 관과 12.5 m m MES, pH 6.0 aspartic 산 조정)를 기록 하기 위한 무 겁 게 버퍼링된 피펫은 솔루션을 준비 합니다.
참고: 주식 피 펫 솔루션 및 필터를 준비 합니다. 녹음 전에 Mg-ATP를 추가 합니다. - (140 mM NaCl, 2mm CaCl2, 2 mM MgCl2, 그리고 0.1 m m Tris HCl pH 8.2) 때마다 신선한 목욕 솔루션을 준비 합니다.
6. 전송 활동의 기록
- 운송업 자 활동은 온도 의존 하기 때문에 녹음 실과 37 ° C에서 모든 솔루션을 유지 합니다.
- 녹음 실로 셀을 놓습니다. 그들은 챔버의 바닥에 드롭 하지만 그들 챔버에 연결 하지 마십시오 때까지 기다립니다.
- 적절 한 셀을 선택 합니다. 눈 마이크로미터와 셀의 직경을 측정 합니다. 유사한 직경을 가진 셀을 선택 합니다.
참고: 일반적으로, 큰 셀이 해야한다 더 세포 표면 및 따라서 또한 데 더 운송업 자 활동의 원형질 막에 표현 가능 하 게 더 많은 전송기. 그러나, 이건 반드시 올바른 전송 활동 특정 운송업 자 및 연구에서 셀 형식에 따라 달라 집니다. - 탑재는 micromanipulator 하 이온 선택적 microelectrode 피 펫, 백필 세포내 솔루션 패치 클램핑 피펫으로 확인 솔루션2피 펫 끝에 도달 하면.
참고: 그것은 여러 부드러운 탭은 피 펫의 끝에 거품을 제거 하기 위해 필요할 수 있습니다. - 2,,2223설정 전기 생리학의 머리 단계로 패치 클램핑 피펫으로 탑재 합니다.
참고: 그것은 중요 하다 수평 축에 45도 각도로 대 한 머리 무대에서 계속 그러면 저항력 인감의 형성에 대 한 적합 한 피 펫에 대 한 항목 각도. - 작은 긍정적인 압력 (~ 5 cm H2O) 패치 피 펫 팁, 차단의 기회를 줄이기 위해 목욕 솔루션으로 그것을 배치 하 게.
- 팁 셀에 가깝다 면 패치 클램프 피 펫 이동 중지 합니다.
- 피 펫 셀 접촉 하는 동안 긍정적인 압력을 완화 하 고 약간의 부정적인 압력 (~ 5 cm H2O)를 한 > 1000 m ω (기가 옴) 인감 패치와 세포 막에 플라스틱23.
- 셀과 패치 피 펫이 세와 같은 초점 평면에 놓고 패치 피펫으로 ISE에 근접에 있는 셀으로 이동 (~ 5-10 µ m)2,5 는 하지만 (그림 1A)이 세를 연결할 셀 수 있도록 하지 마십시오.
- 잠재적인 지주 0 보장 mV.
- 전체 셀 구성을 짧은 suctions의 시리즈와 함께 인감 파열.
- 이 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 이동 천천히 왼쪽에서 오른쪽 또는 아래로 전송 (그림 1B)의 활동을 기록 하.
- 적어도 5-8 봉우리를 기록 (그림 1C, B A에서).
- 구형 파 섭 물개 및 세포 막 커패시턴스 (그림 1)의 품질을 모니터링 하는 녹음 하는 동안 적용 됩니다.
- H+ 플럭스 예측 (
) 세포 표면 및 대량 솔루션 (ΔH+) 무료 H+ 농도 차이에서
참고:
및 
H+ 고 확산 계수를 각각, 버퍼 BT 는 총 버퍼 농도, KD 는 버퍼의 분리 상수, r 은 셀 반경, 그리고 
무료 H+에 작은 변화에 대 한 바운드 H+ 의 농도에 정상 상태 변화를 결정 합니다. H+ 솔루션 무료 양성자를 나타냅니다. 이전 연구 결과와 일치 하도록 H+ 용 변환 됩니다 electrophysiological 유량 단위는 용의 현재 항목을 계산 하 여 (/faraday) pA3,5]. - 셀 크기에서 산출 될 수 있다 세포 표면 또는 막 커패시턴스 양성자 플럭스를 정상화.
) 세포 표면 및 대량 솔루션 (ΔH+) 무료 H+ 농도 차이에서
및 
H+ 고 확산 계수를 각각, 버퍼 BT 는 총 버퍼 농도, KD 는 버퍼의 분리 상수, r 은 셀 반경, 그리고 
무료 H+에 작은 변화에 대 한 바운드 H+ 의 농도에 정상 상태 변화를 결정 합니다. H+ 솔루션 무료 양성자를 나타냅니다. 이전 연구 결과와 일치 하도록 H+ 용 변환 됩니다 electrophysiological 유량 단위는 용의 현재 항목을 계산 하 여 (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
전체 셀 패치 클램프 기록 중 자체 참조이 세는 phosphoinositides에 의해 NHE3 활동의 규칙을 공부에 적용 되었습니다. PS120 구와 같은 셀24, 생 플라즈마 멤브레인 NHEs의 표현 부족, 사용 되었다. NHE3 야생-타입 (NHE3 wt) 또는 NHE3 돌연변이 하지 않는 바인딩 phosphoinositides [티로신 501, 503 아르기닌과 리 505 알라닌, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)로 대체 했다] PS120 구와 같은 셀18에 안정적으로 표현 했다.
자취는 그림 2에 표시 됩니다. 셀 heldin 패치 클램핑, 피 펫에 의해 전체 셀 구성 되었고 ISE 셀 앞에 배치 했다. 이 위치에는 세 세포 막 (그림 1A); 가까이 무료 H+ 의 농도 기록 그런 다음,이 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 수동으로 이동된 옆 50 µ m 이었고 (그림 1B) 솔루션에서 무료 H+ 의 농도 기록. 기록 된 전압 차이, 해당 셀의 앞에 또는 ISE, 멀리 패치 피 펫의 두 위치 하는 NHE3 활동 (그림 1C)의 대표. Apyrase (ATP-diphosphatase)의 내 피 펫 관류 이후 감소 하는 phosphoinositide 콘텐츠5ATP의 세포내 농도 줄인다. 이전에 보고 된 연구5,,1819와 apyrase 처리에 의해 중재 감소 phosphoinositide 콘텐츠 감소는 전압 감소 기록 했다 NHE3 활동 (~ 50%), 진동 진폭 (그림 2) NHE3 활동에 apyrase (주어진 5 단위/ml)의 효과 완전히 반전 2 µ M와 함께에서 apyrase의 내 피 펫 관류에 의해 파이 (3,4,5) P3 (그림 2 , 3A). 이러한 결과 안정적으로 표현 하는 NHE3 돌연변이 (NHE3-YRK) phosphatidylinositides18바인딩할 수 없었던 PS120 셀에 기록 된 NHE3 활동에 의해 지원 되었다. 혼자 또는 함께 PIP3 apyrase의 관류 NHE3 YRK 돌연변이 (그림 3B)에 NHE3의 활동에 영향을 미치지 않았다. 생 NHE3의 활동 또한 주머니 쥐 신장 (확인) 셀3에 apyrase 치료에 의해 저해 되었다. PI (3,4,5) P3의 내 피 펫 관류 반전 확인 셀 (그림 3C)에 apyrase에 의해 유도 된 NHE3 활동의 저해. 이러한 결과 NHE3 활동에 파이 (3,4,5) P3의 효과 세포 유형 특정 하지 좋습니다.
다음, 우리는 apyrase 중재 변경 NHE3 활동에서 규제에 PIP3의 특이성을 테스트 목적. 우리는 다른 phosphoinositides, PI (4, 5) P2 등의 재 관류 후 NHE3 활동에 apyrase 종속 감소에 미치는 영향을 시 금으로 이것을 했다. PI (4, 5) P2 (10 µ M)에서 apyrase (그림 4A)에 의해 중재 감소 NHE3 활동에 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, 앰프-PNP, 비 hydrolysable ATP 아날로그의 관류 theapyrase 종속 억제 NHE3 활동 (그림 4B)의 차단 하지 않았다. 이 발견에는 PI (3,4,5) P3, 하지만 하지 PI (4, 5) P2, ATP 고갈 후 NHE3의 규정에의 한 역할을 건의 한다. PI (4, 5) p 2와 NHE3 레 귤 레이 션이 세 측정 전체 셀 패치 클램프 기록5와 함께 하는 동안 phosphoinositides의 세포 관류 때문 에서만 가능 했다 p 3 파이 (3,4,5)에 대 한 별도 역할의 식별. PI (4, 5) P2 NHE3 활동의 규제에서 보다는 파이 (3,4,5) P3의 특정 행동은 다른 세포내 phosphoinositides NHE3 기능을 다르게 조절 여부를 확인 하려면 중요 합니다.
그림 1 . H+ 의 도식 표현 측정 및 상관관계 NHE 활동 및 잠재적인 차이 pH microelectrode에 의해 기록 된 플럭스.
녹화 설정의 도식 적인 표현입니다. A. 초기 실험 설정의 다이어그램. 셀 전체 셀 구성 패치 클램프 피 펫에 의해 개최 하 고 ISE 앞. 이 위치에는 세 세포 막에 가까운 무료 H+ 의 농도 기록합니다. 나 는 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 수동으로 이동된 옆으로 ~ 50 µ m 이며이 위치에 솔루션에서 무료 H+ 의 농도 기록. C. 그래픽 표현의 전압 차이이 세를 사용 하 여 기록. B (ISE 멀리 셀) 위치는이 세 앞 (셀)에서 진동 NHE 활동의 대표 있습니다. 사용 하는 소프트웨어 등록 전압 차이이 세 여 기록 하 고 세포 막 커패시턴스 및 패치 클램프 씰의 품질을 모니터링 구형 파 섭 (20 mV, 0.2 kHz)를 생성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 녹음의 예 apyrase와 파이 (3,4,5) P3 관류 전후 NHE3 wt를 표현 안정적으로 단일 PS120 셀에 NHE3 운송업 자 활동에 대 한 설정 (PIP3).
초기 녹음 후 셀 apyrase의 내 피 펫 관류에 의해 ATP 고갈 되었다. NHE3 활동은 점차적으로 감소 하 고 PIP3 내 피 펫 관류에 의해 복구 되었다. Apyrase 추가 빨간 막대로 표시 되 고 PIP3 추가 녹색 막대로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . ATP 고갈 및 PS120 및 확인 셀에 NHE3 운송업 자 활동에 PIP3 관류의 효과.
NHE3 활동 및 예약 NHE3 활동에 apyrase의 효과에 ATP 고갈 apyrase 중재의 효과 PIP3 내 피 펫 관류에 의해 유도 된: A. PS120 표현 NHE3 wt 또는 B 세포 PS120 세포 표현 NHE3-YRK, NHE3 돌연변이 phosphoinositides 바인딩할 수 없습니다. C. 확인 셀 생 NHE3을 표현입니다. 단단한 원형 개별 실험 (동일한 조건에서 수행 하는 4 개의 실험)에서 평균 데이터 표시. 오차 막대는 수단 ± 표준 오류 (SE)를 나타냅니다. * P < 0.05 제어, ANOVA에 대. $ P < 0.5, $$P < 0.01 apyrase apyrase + PIP3, ANOVA에 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . PI (4, 5) P2의 효과 (PIP2)과 ATP 고갈 후 NHE3 활동에 ANP PNP 관류.
A 의 효과 PIP2 또는 B ANP PNP 내부-피 펫 관류 PS120 셀 NHE3 wt. 솔리드 동그라미 표시 개별 실험 (동일한 조건에서 수행 하는 4 개의 실험)에서 평균 데이터 표현에 NHE3 활동의 apyrase 종속 감소에. 오차 막대를 나타내는 수단 ± SE. * P < 0.05, * * P < 0.01 제어, ANOVA에 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
전송기의 중요 한 기능에도 불구 하 고 그들의 활동을 공부에 사용할 수 있는 방법 효과 및 불 충 분 한 있습니다. 한 가지 한계는 사용할 수 있는 방법을 측정 이온 운동 변동 세포내 이온 조성 실험4동안에 고려 하지 않고 전송 활동에 의해 중재입니다. 제시 방법 세포 외 및 세포내 이온의 정확한 제어를 보장 하 고 세포내 이온, 단백질 및 지질 구성3,4,5를 수정 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 오랜 기간25안정 하는 ISE의 준비 합니다. 우리의 경험에서는, 불안정 한이 세 아니다 잘 시 (예를 들어, 선택적 이온 수 지가 세 피 펫 양쪽 배분)는이 세 신호에 일정 한 통제 드리프트에 의해 검출 될 수 있다. 또한, ISE에 수 지 분포 실험 기간 동안 밀접 하 게 모니터링 될 해야 합니다. 목욕 솔루션 만드는 수 지25전에 목욕 솔루션의 열이 세 피 펫 안에 이온 선택적 수 지를 밀어 수 있습니다. 이 경우에이 세가이 칼럼에서 이온 농도 기록 되며 될 실험 기간 동안 이온 기온 변화도 있는 변화에 응답 하지 않습니다. ISE의 형상을 조정 100 ms9 의 범위에는 세 응답을 가져오고이 세 시간 응답에서 가능한 지연을 극복 하 키 비교 이온 기온 변화도에 변경 합니다.
제시 방법의 주요 한계는 상피 세포에 수송 활동의 측정을 클램핑 패치에서 상속 됩니다. 지원에서 분리 하 고 서 스 펜 션에 유지, 편광 된 상피 세포 꼭대기 또는 basolateral 막에 전송기의 편광된 지역화를 잃을 수도 있습니다.
수정된 패치 죄는 측정 채널 및 편광된 epithelia에 전송기를 공부를 할 때 사용 되어야 한다. 고려는 셀 실린더에 대략적인 수 보다는 구형은 제공 하는 수식을 통해 유량으로 H+ 그라데이션 변형 때 중요 하다. 이 경우에 수식을 변경 해야 합니다. 
r은 실린더 반지름 λ는 실린더의 길이, 광고 x는 그래디언트는 측정된5실린더 중간점에서 광선 거리는. 공부 electroneutral 전송기를 위한이 강력한 기술의 미래 개발은 단층에 성장 기록 셀을 최적화 하기 위해 메서드 수정에 집중 해야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
저자 에릭 Fishback (데스 모인 스 행, 데스 모인 스 행, 아이오와, 미국)을 촬영 하 고 편집 하는 비디오와 함께 그의 도움에 감사 하 고 싶습니다. PS120 구와 같은 세포 안정적으로 NHE3 wt 또는 NHE3 YRK 표현 했다 친절 하 게 박사 마크 Donowitz (존스 홉킨스 대학의과 대학, 볼티모어, 메릴랜드, 미국)에 의해 제공 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
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