Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

मानव गर्भाशय चिकनी मांसपेशी के सिकुड़ना माप दवा विकास सहायता के लिए

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56639
Automatic Translation
*1, 2, 3,4, *2,5
1Harris-Wellbeing Preterm Birth Research Centre, Department of Cellular and Molecular Physiology, Institute of Translational Medicine, University of Liverpool, 2School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Chemistry, Institute of Biological Chemistry, University of Vienna, 4Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, 5Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए मानव myometrium के पूर्व vivo संकुचन और दवा खोज में उनके आवेदन का अध्ययन. इस तकनीक के लिए myometrial फिजियोलॉजी और pathophysiology की समझ में सुधार के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपंयास अनुसंधान जांच या दवा सुराग से औषधीय डेटा को मांय किया जाता है ।

Abstract

डिस्कवरी और उपंयास दवा यौगिकों या जैव रासायनिक जांच के लक्षण वर्णन मजबूत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक परख प्रणालियों पर भरोसा करते हैं । हम तरीकों का वर्णन करने के लिए उपाय पूर्व vivo myometrium सिकुड़ना. इस परख कारकों और myometrial संकुचन के मॉडुलन में शामिल अणुओं की जांच करने के लिए और उनके उत्तेजक या निरोधात्मक कार्रवाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इसलिए vivo मेंउनकी चिकित्सीय क्षमता । बायोप्सी सूचित सहमति के साथ सीजेरियन सेक्शन डिलिवरी के दौर से गुजर महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं । myometrium के ठीक स्ट्रिप्स, विच्छेदित काटा और 1 मिलीलीटर अंग स्नान ३७ डिग्री सेल्सियस पर शारीरिक खारा समाधान के साथ superfused के भीतर एक बल transducer से जुड़ी हैं । स्ट्रिप्स के भीतर सहज संकुचन विकसित 2 – 3 ज तनाव सेट के तहत और कई घंटे के लिए स्थिर रहते हैं (> 6 एच). स्ट्रिप्स भी ऐसे अंतर्जात हार्मोन, ऑक्सीटोसिन और vasopressin, जो संकुचन आवृत्ति, बल और अवधि के एकाग्रता पर निर्भर मॉडुलन के कारण के रूप में अनुबंध करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और अधिक निकटता परिश्रम में संकुचन समान है । इसलिए, ज्ञात और उपंयास दवा सुराग के प्रभाव सहज और एगोनिस्ट प्रेरित संकुचन पर परीक्षण किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से विवरण कैसे इस परख मानव myometrial संकुचन के विभिंन मापदंडों पर उनके प्रभाव को मापने के द्वारा ज्ञात और उपंयास एजेंटों की शक्ति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम ऑक्सीटोसिन-और V1a रिसेप्टर विरोधी, atosiban और SR49059 ज्ञात यौगिकों जो ऑक्सीटोसिन और vasopressin प्रेरित संकुचन को बाधित के उदाहरण के रूप में उपयोग करते हैं, और प्रदर्शन कैसे इस विधि के पूरक और सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है औषधीय डेटा सेल आधारित परख से प्राप्त करने के लिए दवा विकास सहायता । ऑक्सीटोसिन और vasopressin की तुलना में उपन्यास एगोनिस्ट के प्रभाव की विशेषता भी हो सकती है. Whilst हम ऑक्सीटोसिन/vasopressin प्रणाली के उदाहरण का उपयोग करें, इस विधि भी अंय रिसेप्टर्स और आयन चैनल है कि गर्भाशय के संकुचन और विश्राम में एक भूमिका निभाने के लिए मानव गर्भाशय फिजियोलॉजी और pathophysiology की समझ अग्रिम अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

दवा की खोज के लक्ष्य को सक्रिय या बाधा सेलुलर संकेत रास्ते से एक चिकित्सीय प्रतिक्रिया उत्पन्न जो उपंयास, शक्तिशाली, और उच्च चयनात्मक लाइगैंडों का उत्पादन करने के लिए है । यह एक उपयुक्त परख प्रणाली में जो विश्वसनीय, मजबूत, और प्रासंगिक परिणामों के साथ नेतृत्व यौगिकों का परीक्षण करने के लिए1की आवश्यकता है । औषधीय तकनीक जैसे ligand-रिसेप्टर बाइंडिंग और कार्यात्मक परख अक्सर heterologous सेल-आधारित सिस्टम को रोजगार, एक्सप्रेस रिसेप्टर्स जो अंयथा2मौजूद नहीं होगा इंजीनियर. Whilst इन तकनीकों रिसेप्टर औषध और प्रारंभिक दवा के विकास के लिए बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, डेटा प्राप्त vivo परिदृश्य में एक सच को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि कोशिका आधारित परख से औषधीय डेटा भी शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडलों में मांय हैं ।

गर्भाशय चिकनी मांसपेशी (myometrium) गर्भाशय जो परिश्रम के दौरान संकुचन के लिए जिंमेदार है कि efface और गर्भाशय ग्रीवा को चौड़ा और भ्रूण3उद्धार के पेशी परत का गठन किया । myometrium का संकुचन सहज है; यह हार्मोन या तंत्रिका इनपुट4अनुबंध करने की आवश्यकता नहीं है । संकुचन myometrial कोशिका झिल्ली जो वोल्टेज के उद्घाटन की ओर जाता है के सहज ध्रुवीकरण के बारे में लाया जाता है सीए2 +-चैनल (एल प्रकार चैनल) और सीए की आमद2 + सेल5में । कैल्शियम calmodulin के साथ परिसरों और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला कळेनासे सक्रिय करता है जो बारी phosphorylates मायोसिन और संकुचन के साथ पार पुल चक्र गठन को सक्षम करने के लिए. छूट आमतौर पर de-फास्फारिलीकरण द्वारा मायोसिन के मायोसिन फॉस्फेट और Ca की एकाग्रता में कमी के द्वारा मध्यस्थता है2 + सेल से बाहर निकालना और/या sequestering sarcoplasmic (SR)5,6 ,7.

कई तरीकों myometrial समारोह और रोग का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, से vivo में आंतरिक और बाहरी tocography और अंतर्गर्भाशयी दबाव कैथेटर, बदल या myometrial मूल की कोशिकाओं को अमर की पीढ़ी के लिए8 ,9,10,11,12. Whilst सेल संस्कृति प्रणालियों का पता लगा सकते है कि एक पदार्थ सेलुलर स्तर पर कार्य कर सकते हैं, अंग स्नान के भीतर ऊतकों के स्ट्रिप्स उपकरणों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है औषधीय रिएजेंट के लिए पूरे ऊतकों के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को मापने । पारंपरिक अंग स्नान आम तौर पर एक बड़ा गर्म गिलास चैंबर जो 5 और ५० के बीच शारीरिक खारा (PSS) की मिलीलीटर धारण करने में सक्षम है है । इन बड़े कक्षों के भीतर स्ट्रिप्स आम तौर पर ऑक्सीजन और PSS की बड़ी मात्रा के साथ वातन की आवश्यकता होती है । ऊतक के स्ट्रिप्स और विच्छेदित स्नान कक्ष के भीतर निलंबित कर रहे है और एक बल transducer जो तनाव में बदलाव के उपाय, जैसे एक संकुचन के दौरान के रूप में संलग्न । दोनों मनुष्यों और जानवरों सहित, गिनी पिग13, माउस14, चूहा15, खरगोश16, और दूसरों17,18से myometrium के स्ट्रिप्स, अनुसंधान समूहों के एक नंबर के द्वारा इस्तेमाल किया गया है की जांच myometrial शरीर विज्ञान और विकृति से संबंधित कई सवाल, अपरिपक्व और बेकार मजदूरों सहित. उदाहरण के लिए, myometrial स्ट्रिप्स कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो विनियमित और myogenic गतिविधि को संशोधित19,20,21, ऐसे SR22के रूप में organelle समारोह का निर्धारण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में आयन चैनल23,24,25,26, पंप और एक्सचेंजर्स27 myometrial फिजियोलॉजी में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए की जांच मॉडुलन ।

इस पूर्व vivo तकनीक ऊतक संकुचन प्रदर्शन के आकलन के लिए अनुमति देता है और संकुचन के मापदंडों पर विभिन्न एजेंटों के प्रत्यक्ष प्रभाव सहित मापा जा करने के लिए, संकुचन बल (शक्ति), आवृत्ति, और अवधि, के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन मूल्यों के एकीकरण, कुल काम का एक सूचकांक उत्पंन करने के लिए (मतलब अभिंन बल या वक्र के तहत क्षेत्र, ईमेज) । के रूप में पृथक ऊतक पट्टी की तैयारी एक से अधिक कोशिका प्रकार के एक मॉडल का गठन, पूरे ऊतक के शारीरिक प्रतिक्रिया मापा जा सकता है । अंग स्नान और पृथक ऊतक पट्टी इसलिए सेल संस्कृति के काम और पूरे पशु के बीच पुल प्रदान करने में एक उपयोगी उपकरण है/vivo काम में / इसलिए, ड्रग डिस्कवरी के क्षेत्र में, उनके उत्तेजक के संदर्भ में उपन्यास एजेंटों के प्रभाव (यानी, उत्तेजक) या निरोधात्मक (यानी, छूट) vivo में संभावित अधिक बारीकी से मूल्यांकन किया जा सकता है. इस तकनीक का सफलतापूर्वक ऑक्सीटोसिन के विकास में इस्तेमाल किया गया था और वी1aरिसेप्टर (OTR और वी1aआर) एक tocolytic एजेंट के रूप में विरोधी atosiban के लिए अपरिपक्व श्रम संकुचन और देरी अपरिपक्व जन्म को बाधित । इन विट्रो में atosiban के myometrial स्ट्रिप्स पर परीक्षण के लिए काफी ऑक्सीटोसिन (OT)-प्रेरित संकुचन28,29,30को कम करने में सक्षम विरोधी पाया । महत्वपूर्ण रूप से इन अध्ययनों से atosiban के शोधों के मूल्य को मान्य करने में मदद मिली और यह नैदानिक परीक्षणों के लिए आगे ले जाने के लिए आवश्यक सबूत की अवधारणा डेटा उत्पन्न31,३२,३३,३४ . Atosiban अब व्यापक रूप से पसंद की दवा यूरोप में श्रम में देरी के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसी तरह के सबूत-अवधारणा अध्ययन ऑक्सीटोसिन एनालॉग carbetocin के लिए किया गया था के बाद को रोकने में अपनी चिकित्सीय क्षमता दिखाने के प्रसवोत्तर रक्तस्त्राव३५,३६,३७। अंय प्रमुख इस परख के साथ विकास के तहत वर्तमान यौगिकों retosiban (GSK221149A)३८ और nolasiban (डेटा अप्रकाशित) शामिल हैं । ये विधियां भी रोगी समूहों के बीच की तुलना करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है३९,४०,४१,४२,४३,४४, ४५,४६,४७ और अंतर प्रजातियों के मतभेदों के लिए जांच ।

यहां हम छोटे के भीतर गर्भवती मानव myometrium से अलग पूर्व vivo ऊतक स्ट्रिप्स के उपयोग का वर्णन (1 मिलीलीटर) कस्टम-अंग स्नान उदाहरण देकर स्पष्ट करना कैसे इस विधि के पूरक और औषधीय डेटा सेल से प्राप्त की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित परख . बायोप्सी बड़े पैमाने पर पूर्व के दौर से गुजर महिलाओं से प्राप्त किया गया श्रम ऐच्छिक सीजेरियन सेक्शन (सीएस) प्रसव के रूप में वे शल्य चिकित्सा की योजना बनाई है और इसलिए बायोप्सी संग्रह अनुसूची करने के लिए आसान कर रहे हैं, myometrium करने के लिए आसान पहुँच है, और ऊतकों किसी को उजागर नहीं किया गया होगा uterotonic उत्तेजक या ढीला सर्जरी से पहले । हालांकि, बायोप्सी भी अनियोजित (आपातकालीन) श्रम में सीएस प्रसव के दौर से गुजर महिलाओं से प्राप्त किया जा सकता है उपलब्ध कराने के पर्याप्त समय के लिए पूरी तरह से रोगी की सहमति है । अधिकांश बायोप्सी शल्य चीरा की साइट पर कम गर्भाशय खंड से सर्जरी के दौरान प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन यह भी ऊपरी खंड से नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है४८,४९. योनि प्रसव के बाद कुछ मामलों में, अपरा बिस्तर से पंच बायोप्सी भी५०प्राप्त किया गया है । हालांकि, यह सबसे पारंपरिक मार्ग नहीं है और प्राप्त myometrial ऊतक की मात्रा छोटी है । गैर गर्भवती myometrium पहले से प्राप्त किया जा सकता है या रजोनिवृत्ति के बाद महिलाओं सौम्य स्त्री की स्थिति के लिए गर्भाशय के दौर से गुजर । एक पूर्ण मोटाई बायोप्सी गर्भाशय ग्रीवा से दूर कम कोष से, पोस्ट-पैथोलॉजी परीक्षा का नमूना है, और myometrium serosal और एंडोमेट्रियल सतहों से परहेज गर्भाशय की दीवार के बीच से लिया जाता है ।

Protocol

उचित संस्थागत, नैतिक समीक्षा बोर्ड और मानव ऊतकों के साथ प्रयोग के लिए सुरक्षा की मंजूरी किसी भी मानव ऊतकों के साथ काम करने से पहले जगह में होना चाहिए । सभी काम यहां वर्णित स्थानीय अनुसंधान नैतिकता समिति (लिवरपूल ईस्ट, आरईसी रेफरी 10/H1002/49) और अनुसंधान और विकास विभाग, लिवरपूल महिला अस्पताल और लिवरपूल विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्डों से अनुमोदन प्राप्त किया ।

नोट: सभी बायोप्सी इस प्रोटोकॉल में वर्णित लिवरपूल महिला अस्पताल में पूर्व श्रम ऐच्छिक सीएस प्रसव के दौर से गुजर महिलाओं से प्राप्त किया गया था और प्रत्येक महिला को लिखित जानकारी के भाग लेने के लिए सहमति दे दी है ।

1. समाधान

  1. संशोधित Krebs शारीरिक खारा समाधान (PSS) निम्न संरचना के साथ तैयार करें: १५४ मिमी NaCl, ५.६ मिमी KCl, १.२ मिमी MgSO4, ७.८ मिमी ग्लूकोज, १०.९ मिमी HEPES, और २.० मिमी CaCl2.
    नोट: खंड बनाया जा करने के लिए आपरेशन में ऊतक स्नान की संख्या के अनुसार निर्धारित किया जाता है, प्रणाली की प्रवाह दर (1 मिलीलीटर/equilibration और वॉशआउट समय सहित प्रयोग की अनुमानित लंबाई/
  2. 4 मीटर NaOH का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें ।

2. ऊतक स्नान सेट अप

  1. ४५ ° c पर एक पुनर्संचारित पानी स्नान सेट का उपयोग कर ऊतक स्नान प्रणाली जलाशय के लिए
    नोट: तंत्र के आधार में जल जलाशय ~ ४५ ° c है, जो सिकुड़नेवाला टयूबिंग के माध्यम से चल रहे में pss के साथ गर्मी विनिमय के लिए अनुमति देने के बाद गर्म है, ऊतक स्नान में pss सुनिश्चित करता है ३७ डिग्री सेल्सियस पर है । तापमान सेट करने के लिए कुछ समायोजन ऊतक स्नान में PSS के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है । इस उपकरण का इस्तेमाल किया और प्रवाह दर सेट के आधार पर भिंन होगा ।
  2. मैन्युअल एम्पलीफायर, डेटा अधिग्रहण और रिकॉर्डिंग प्रणाली, और सक्शन पंप सहित किसी भी अन्य आवश्यक उपकरणों पर स्विच.
  3. सिकुड़नेवाला पंप सिर के रोलर्स के आसपास प्रत्येक सिकुड़नेवाला फीडर ट्यूब (स्नान प्रति एक ट्यूब) की स्थिति । बनाए रखने के बंद हो जाता है के साथ सुरक्षित और संपीड़न cams कस और ट्यूबों के आसपास चाबियां ताला । pss के एक 1 एल कंटेनर में सिकुड़नेवाला फीडर ट्यूबों के मुक्त सिरों प्लेस और pss ऊतक स्नान में लगातार perfuse करने के लिए अनुमति देने के लिए पंप शुरू करते हैं ।
  4. सुनिश्चित करें कि सक्शन पंप सही ढंग से काम कर रहे हैं और यह है कि स्नान में समाधान का स्तर लगातार ऐसा है कि स्नान में प्रवाह की दर को हटाने की दर के बराबर है । ऊतक स्नान में PSS का स्तर मॉडलर मिट्टी का उपयोग कर स्नान में सक्शन ट्यूब की गहराई से जोड़ तोड़ से समायोजित किया जा सकता है ।
  5. transducer हुक पर एक ज्ञात वजन (1 millinewton (mN, बल की इकाई) के बराबर) रखकर बल ट्रांसड्यूसर जांचना और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा पता लगाया विक्षेप रिकॉर्डिंग ।
    नोट: मान सॉफ़्टवेयर में समायोजित किया जा सकता है जैसे कि रिकॉर्ड किए गए मान स्वचालित रूप से विश्लेषण के दौरान कोई और रूपांतरण करने की आवश्यकता को नकारने वाले mN में कनवर्ट हो जाते हैं । ऊतक बढ़ते से पहले बल ट्रांसड्यूसर का अंशांकन किया जाना चाहिए ।

3. ऊतक तैयार करने और स्ट्रिप्स के विच्छेदन

  1. बच्चे और अपरा के प्रसव के बाद सीएस में गर्भवती मानव myometrium (1 – 2 cm3) की बायोप्सी लीजिए. प्राप्त (ठेठ) पूर्ण मोटाई बायोप्सी जिसमें दोनों perimetrium (गर्भाशय के बाहरी serosa परत) और decidua (गर्भाशय के अंतरतम परत) मौजूद हैं । केवल myometrial ऊतक (केंद्रीय मांसपेशी परत) का उपयोग करें । चित्र 1a-Bदेखें ।
    1. निकालें (आवश्यक) decidua और किसी भी अनुयाई भ्रूण झिल्ली (यदि वर्तमान) के रूप में इन ऊतकों जो myometrial सिकुड़ना बदल सकते हैं पदार्थों का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है ।
      नोट: सर्जरी में, नमूनों हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) या ताजा PSS में रखा जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है । आदर्श ऊतकों शल्य चिकित्सा के 12-16 एच के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन अध्ययन सिकुड़ना के लिए कोई हानि नहीं दिखाई है 18 के बाद संग्रह के साथ एच 4 डिग्री सेल्सियस५१पर । उपयुक्त नियंत्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक भंडारण के बाद ऊतक व्यवहार्यता और समारोह की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए । यहां नमूने निचले गर्भाशय खंड चीरा साइट के ऊपरी किनारे से और ऊपरी खंड से नहीं लिया जाता है । गर्भाशय के निचले और ऊपरी खंडों को इसी तरह के अनुबंध के लिए दिखाया गया है४८, इसलिए लोअर सेगमेंट बायोप्सी को ऊपरी खंड myometrial गतिविधि का एक अच्छा प्रतिबिंब माना जाता है ।
  2. विच्छेदन क्षेत्र और आवश्यक उपकरणों की तैयारी सहित: बड़े विच्छेदन कैंची, छोटे Vannas विदारक कैंची, दो विदारक संदंश, विच्छेदन पिन, और एल्यूमीनियम ऊतक क्लिप, दोनों निश्चित और ज़ूम के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के आसपास आवर्धन.
  3. एक स्पष्ट silastic-आधारित विच्छेदन डिश पर बायोप्सी नमूना प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) PSS से भरा है और ध्यान से बायोप्सी मालूम ताकि serosa और decidua किनारों की पहचान कर रहे हैं आंकड़ा 1b.
  4. पकवान के आधार पर बायोप्सी सुरक्षित करने के लिए पिन का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि ऊतक विच्छेदन प्रक्रिया में PSS के साथ हाइड्रेटेड रहता है ।
  5. मैंयुअल रूप से माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत पर स्विच और 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक का निरीक्षण करने के लिए निशान ऊतक, serosa, decidua, और किसी भी अनुयाई भ्रूण झिल्ली से मुक्त myometrium के क्षेत्रों की पहचान अगर वर्तमान ।
  6. दो आसंन ऊतक परतों को अलग करने के लिए बड़े विच्छेदन कैंची का उपयोग कर कुंद विच्छेदन प्रदर्शन, दो विमानों या मांसपेशियों की चादरें खुलासा.
    नोट: यह अक्सर आसान है ऊतक परतों के बीच एक छोटी जेब को खोजने के लिए जुदाई शुरू लेकिन देखभाल के लिए बायोप्सी एज में छोटे जहाजों से बचने के रूप में वे ' के लिए गलत हो सकता है लिया जाना चाहिए ' जेब ।
  7. ऊतक के प्रत्येक कोने पर जगह विदारक पिन इसे सुरक्षित करने के लिए । मांसपेशी के समानांतर में चल रहे तंतुओं के साथ मांसपेशियों के क्षेत्रों की तलाश में चादरें का निरीक्षण ।
    नोट: क्षेत्र पहचान ऊतक के माध्यम से perfusing छोटी केशिकाओं की दिशा का पालन करके सहायता प्राप्त किया जा सकता है । ऊतक एज में कोमल पुलिंग भी दिशा में जो फाइबर यात्रा कर रहे है की पहचान में मदद कर सकते हैं ।
  8. कट दूर ऊतक के स्ट्रिप्स ~ 2 मिमी चौड़ा x 8 मिमी लंबे समय से अनुदैर्ध्य अक्ष छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग कर फाइबर की दिशा के साथ गठबंधन धुरी के साथ मोटी x 1 मिमी.
    ध्यान दें: देखभाल करने के लिए केवल प्रारंभिक कटौती से ऊतक को पकड़ने के लिए नुकसान से बचने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  9. प्रयोग के लिए आवश्यक स्ट्रिप्स की संख्या बाहर टुकड़े करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
  10. पिन पर प्रत्येक पट्टी को सीधा करने के लिए और डिश के लिए सुरक्षित, देखभाल करने के लिए ऊतक खिंचाव पर नहीं ले दोनों सिरों पर ।
  11. प्रत्येक के अंत में एल्यूमीनियम ऊतक क्लिप अनुलग्न करें ताकि उन दोनों के बीच ऊतक ~ 5 मिमी लंबी है और ध्यान से दूर किसी भी अतिरिक्त ऊतक काट (चित्रा 1C).
  12. बढ़ते के लिए तैयार PSS से भरा एक साफ डिश के लिए स्थानांतरण ।

4. नहाने के ऊतकों में बढ़ते

  1. स्ट्रिप्स प्रयोगात्मक ऊतक स्नान करने के लिए स्थानांतरण । स्ट्रिप्स क्षैतिज के बजाय खड़ी (पारंपरिक अंग स्नान के रूप में) (चित्रा बीसी) के रूप में माउंट ।
  2. बल transducer, जो ऊतक संकुचन उपाय करने के लिए क्लिप द्वारा प्रत्येक पट्टी के एक छोर देते हैं, और दोनों ऊतक चैंबर के भीतर एक निश्चित हुक करने के लिए दूसरे ।
    नोट: ऊतक स्नान की क्षमता है ~ 1 मिलीलीटर जो पर्याप्त स्ट्रिप्स सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से नहाने में डूबे हुए हैं ।
  3. सुनिश्चित करें कि स्ट्रिप्स स्नान में प्रत्येक हुक के आधार पर कर रहे हैं ।
  4. सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करके रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें ।
  5. यह चैनल विंडो में दृश्य में है ताकि प्रत्येक चैनल के लिए रिकॉर्डिंग समायोजित करें ।
  6. 0-10 वी के बीच पढ़ने के लिए y अक्ष स्केल समायोजित करें (0-10 mN पोस्ट अंशांकन के समकक्ष) दाएँ से y अक्ष पर क्लिक करके, ' स्केल ' का चयन करना, और न्यूनतम और अधिकतम मान 0 और 10, क्रमशः लाना. ' ठीक ' का चयन करें । प्रत्येक चैनल रिकॉर्डिंग के लिए दोहराएँ.
  7. प्रेस ' रिकॉर्ड ' सॉफ्टवेयर पर लाइव रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए ।
    नोट: यदि स्ट्रिप्स प्रत्येक हुक के आधार करने के लिए सुरक्षित नहीं हैं, वे संकुचन जो रिकॉर्डिंग पर ' एक पायदान ' के रूप में दिखाई देगा के दौरान फिसल सकता है । सेट तनाव बदल जाएगा और इसलिए संकुचन पद-फिसलन अलग हो सकता है ।
  8. प्रत्येक स्नान में ऊतक खिंचाव मैंयुअल रूप से प्रत्येक transducer से जुड़ी micromanipulators मोड़ द्वारा । स्क्रीन पर आधारभूत से ऊपर की ओर ऊतक आंदोलन का पालन करें और आधारभूत तनाव तक पहुंच micromanipulators बारी करने के लिए जारी ०.२ g (~ 2 mN) ।
    नोट: ऊतक तुरंत आराम करने के लिए शुरू हो जाएगा (आधारभूत तनाव में एक बूंद द्वारा नोट), आम तौर पर 0.5-1 mN के बीच की एक स्थिर तनाव तक पहुंचने । यह परिभाषित तनाव हमारे प्रायोगिक परिस्थितियों में इस आकार के ऊतक स्ट्रिप्स के लिए अनुकूलित किया गया है । यदि अंय आकार के ऊतकों को इस्तेमाल किया जा रहे हैं, यह आवश्यक है कि उचित लंबाई तनाव संबंध जांच के लिए आराम करने के लिए लागू किया जा बल अनुकूलन प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  9. जब तक सहज संकुचन उत्पंन ऊतकों ~ 2 एच के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
    नोट: आधारभूत तनाव में एक छोटे से उंनयन आमतौर पर मनाया जाता है और ऊतक व्यवहार्यता का एक अच्छा संकेत है और यह कि यह सिकुड़ा हो जाएगा ।

5. ४० mM पोटेशियम के साथ ऊतक को चुनौती (उच्च K+)

  1. यदि कोई सहज संकुचन बढ़ते के 2 ज के बाद होते हैं, एक उच्च पोटेशियम नमक समाधान जिसमें पोटेशियम KCl के लिए NaCl के isosmotic प्रतिस्थापन द्वारा ४० mM करने के लिए ऊंचा है के साथ स्ट्रिप्स चुनौती । उच्च K+के लिए, निंन जोड़ें (मिमी में): ११९.६ NaCl, ४० KCl, 1.2 MgSO4, ७.८ ग्लूकोज, १०.९ HEPES, और २.० CaCl2।
    नोट: myometrium के रूप में चिकनी मांसपेशी में, उच्च K + के आवेदन) अप्रत्यक्ष रूप से खोलने वोल्टेज संचालित कैल्शियम चैनलों के ऊतक कोशिकाओं में सीए2 + के अधिक से अधिक आमद के लिए अग्रणी+ कारण संकुचन. उच्च K+ इसलिए ऊतक अखंडता के सामांय सूचकांक परीक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक से अधिक ऊतक प्रतिक्रिया का एक उपाय प्राप्त करने के उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. पट्टी युक्त स्नान के लिए फीडर ट्यूब प्लेस एक ग्लास प्रयोगशाला की बोतल में चुनौती दी हो उच्च K+ 1-2 मिनट के लिए ।
    2. PSS के कंटेनर के लिए फ़ीडर ट्यूब लौटें ।
    3. जहां उच्च K+ के लिए एक प्रतिक्रिया हासिल की है, एक और 1 एच के लिए पट्टी निगरानी जारी है । अगर वहां उच्च कश्मीर+ या कोई सहज गतिविधि पद उच्च k+ प्रतिक्रिया, पट्टी त्यागने के लिए कोई सिकुड़ा प्रतिक्रिया है ।
      नोट: प्रयोगकर्ता को भी उच्च K+की प्रतिक्रिया का आकलन करने से पहले फीडर टयूबिंग में मृत अंतरिक्ष (ऊतक स्नान तक पहुंचने के समाधान के लिए लिया गया समय) के बारे में पता होना चाहिए । यह 2-3 मिनट लग सकता है और प्रवाह दर पर निर्भर करेगा ।
    4. स्नान और फीडर ट्यूबों, जो बाद में युद्धाभ्यास को प्रभावित कर सकता से उच्च कश्मीर+ के पूरा वॉशआउट सुनिश्चित करने के लिए, प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले सहज संकुचन पूर्व उच्च कश्मीर+ आयाम के लिए वापसी तक इंतजार ।

6. Myometrial संकुचन पर ज्ञात और उपंयास यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण

नोट: myometrial समारोह पर उपंयास दवाओं और रिएजेंट के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रयोग सहज (आंकड़ा 3) या एगोनिस्ट-उत्तेजित संकुचन (चित्र बी-सी) पर प्रदर्शन किया जा सकता है । एगोनिस्ट उत्तेजित संकुचन के लिए, OT या arginine vasopressin (वीपी) ०.५ एनएम की एकाग्रता देने के लिए PSS करने के लिए जोड़ा जाता है और प्रयोग (चित्र बी-सी) भर में प्रयोग किया जाता है । OT की एकाग्रता इस परख के लिए अनुकूलित किया गया है के रूप में यह संकुचन जो प्रकृति में४०,५२phased प्रदान करता है । इस से अधिक एगोनिस्ट की सांद्रता लंबे समय तक चलने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, निरंतर (टॉनिक) संकुचन (रेफरी४१,४४ उदाहरण के लिए देखें) जिसके तहत विभिन्न एजेंटों के प्रभाव का आकलन करने के लिए मुश्किल है और प्रयोगात्मक समय सीमा के लिए बहुत व्यक्तिगत संकुचन और आवृत्ति में कमी की वृद्धि की अवधि को समायोजित बढ़ाया जाना चाहिए । इस उदाहरण प्रयोग में, ओटी या वीपी को संकुचन को उत्तेजित करने के लिए जोड़ा जाता है ताकि ज्ञात OTR और V1aR विरोधी, atosiban और SR49059 द्वारा या हमारे उपंयास यौगिक [d-Arg8]-inotocin ([d-Arg8] INT) द्वारा विरोध का मूल्यांकन किया जा सके ।

  1. (के साथ या बिना ०.५ एनएम OT.) PSS में परीक्षण यौगिक (s) की सांद्रता तैयार 1/1000 कमजोर पड़ने की एक ंयूनतम पर पतला, सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला सुनिश्चित करने के उन है कि एकाग्रता है कि अधिक से अधिक की प्रतिक्रिया नहीं बटोरना के रूप में शामिल कर रहे है अधिक जवाब.
  2. वाहन के बराबर मात्रा (जैसे, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, या आसुत जल) को शामिल करने वाले कमजोर पड़ने के समतुल्य सेट तैयार करें ।
    नोट: यह अक्सर सबसे आसान है उच्चतम एकाग्रता तैयार करने के लिए, यानी, 10-6 मीटर (10-3 मीटर के स्टॉक से) और फिर लघुगणकीय स्केल (उदा., 10-6-10-10 मीटर) के साथ धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करते हैं । तैयार की जाने वाली मात्रा आवेदन के समय पर निर्भर करती है, तंत्र की दर प्रवाह, और स्ट्रिप्स की संख्या की जांच की जा करने के लिए, उदा, एक 25 मिनट के आवेदन के लिए, एजेंट और 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर, ऊतक स्नान प्रति प्रत्येक एकाग्रता की एक ंयूनतम 25 मिलीलीटर की आवश्यकता है एड.
  3. एक ग्लास प्रयोगशाला वांछित एकाग्रता में एजेंट युक्त बोतल में ऊतक स्नान के लिए फीडर टयूबिंग रखकर ऊतक के लिए यौगिक की पहली एकाग्रता लागू करें ।
    नोट: यह एक बार सहज या OT के एक स्थिर आधार रेखा से किया जाना चाहिए/उपाध्यक्ष उत्तेजित संकुचन हासिल की है ।
  4. एक दूसरे स्नान के लिए इसी तरह से इसी वाहन नियंत्रण समाधान लागू होते हैं ।
  5. आवेदन के समय रिकॉर्ड (यानी, जब फीडर टयूबिंग बदल गया था) ।
  6. क्रमिक रूप से कांच प्रयोगशाला श्रृंखला में अगले एकाग्रता युक्त बोतल में फीडर टयूबिंग रखकर प्रत्येक एकाग्रता के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ और दोहराने जब तक सभी सांद्रता लागू किया गया है.
    प्रत्येक एकाग्रता के आवेदन के बीच हो सकता है 15 और 30 मिनट लेकिन प्रत्येक लागू एकाग्रता के लिए संगत होना चाहिए और प्रयोगों के बीच. उन शामिल ओटी या उपाध्यक्ष-उत्तेजित संकुचन के लिए लंबे समय तक आवेदन समय की आवश्यकता है (उदा, 25 मिनट) उत्तेजना के तहत मनाया संकुचन आवृत्ति में कमी के लिए खाते के लिए करते हैं । प्रारंभिक प्रयोगों इष्टतम आवेदन समय निर्धारित करने के लिए पहले से किसी भी नए एजेंट परीक्षण किया जा रहा के साथ किया जाना चाहिए ।
  7. वॉशआउट करने के लिए PSS (के साथ या बिना OT/वीपी) के लिए फीडर ट्यूब लौटें ।
  8. लाइव रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए ' स्टॉप ' पर क्लिक करें । तुरंत एक उपयुक्त फ़ोल्डर में डेटा सहेजें और एक '. mat ' फ़ाइल के रूप में एक संस्करण निर्यात ।

7. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा कैप्चर और विश्लेषण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर पैकेज के किसी भी संख्या द्वारा किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सॉफ़्टवेयर के विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें । सिकुड़ा गतिविधि का एक सटीक आकलन के लिए, संकुचन के मापदंडों को मापा जाना शामिल हैं: i) संकुचन के आयाम, द्वितीय) संकुचन की आवृत्ति, iii) संकुचन की अवधि, और iv) मतलब बल अभिंन (चित्रा 4) । मतलब बल अभिंन संकुचन वक्र के तहत क्षेत्र के बराबर है और इसलिए कुल एक निश्चित समय में ऊतक पट्टी द्वारा किया काम का सूचकांक है । कुछ या सभी मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है । एक न्यूनतम के रूप में, यह अनुशंसा की जाती है कि मतलब अभिंन बल और संकुचन के आयाम५३का विश्लेषण कर रहे हैं । यहां वर्णित प्रयोगों में हम संकुचन और वक्र के तहत क्षेत्र के आयाम में परिवर्तन मापा ।

  1. . mat फ़ाइल को विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात करें ।
  2. इस स्तंभ को समायोजित करने के लिए X अक्ष करने के लिए प्रयोगात्मक समय को प्रतिबिंबित करने के लिए, खाते में ले नमूना अंतराल आवृत्ति. प्रयोग आमतौर पर 10 नमूनों/s या ६०० नमूनों/मिनट करने के लिए इसी १० हर्ट्ज पर दर्ज कर रहे हैं ।
  3. प्लॉट एक एक्स-वाई सह तालमेल ग्राफ के रूप में डेटा का उपयोग "साजिश । लाइन "समारोह ।
  4. शूंय अनुबंध के आधार पर सॉफ्टवेयर पर ' अनुवाद ऊर्ध्वाधर ' समारोह का उपयोग कर ।
  5. किसी उपयुक्त नियंत्रण अवधि का चयन करें ।
    नोट: यह समय की अवधि तुरंत regent के पहले एकाग्रता के आवेदन पर पूर्ववर्ती है, लेकिन (चित्रा 4a) के आवेदन की अवधि के बराबर है । उदाहरण के लिए, दवा एक्स के आवेदन 25 मिनट के लिए है, तो नियंत्रण के रूप में दवा एक्स के पहले आवेदन पूर्ववर्ती 25 मिनट का उपयोग करें ।
  6. Y अक्ष को पढ़ें, प्रत्येक संकुचन की समय सीमा में होने वाली अधिकतम पीक पर संकुचन के आयाम (बल) रिकॉर्ड, और एक मतलब मूल्य की गणना ।
  7. शुरू और प्रत्येक संकुचन के अंत में बंद X अक्ष पढ़ने और एक मतलब मूल्य रिकॉर्ड द्वारा इस अधिकतम चोटी के ५०% पर संकुचन की अवधि को मापने ।
  8. आवृत्ति के लिए कोई मान जनरेट करने के लिए समय सीमा में होने वाले अनुबंधों की संख्या की गणना करें ।
  9. चयनित समय की अवधि के लिए ईमेज (मनमाना इकाइयों, a.u. में) की गणना करने के लिए ' एकीकरण ' समारोह का प्रयोग करें ।
    नोट: ईमेज सही रिकॉर्ड करने के लिए, यह आवश्यक है कि संकुचन का आधार रेखा Y अक्ष पर शूंय पर सेट है ।
  10. क्रमिक रूप से सांद्रता के प्रत्येक के माध्यम से कदम और संकुचन के विभिन्न मापदंडों रिकॉर्ड.
  11. १००% के रूप में नियंत्रण डेटा सेट और इस नियंत्रण अर्थातके एक प्रतिशत के रूप में एजेंट के प्रत्येक एकाग्रता के तहत प्राप्त मूल्यों एक्सप्रेस, उत्तेजना के लिए मान > 100% whilst छूट होना चाहिए < 100% ।
    नोट: इस तरह से डेटा सामांय स्ट्रिप्स और औषधीय उपचार के पार परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति चाहिए ।
  12. प्रत्येक प्रयोग के लिए दोहराएँ और एक ग्राफिकल पैकेज करने के लिए डेटा स्थानांतरित.

Representative Results

इस मॉडल का उपयोग करना, विभिंन एगोनिस्ट और संकुचन के विरोधी के साथ ही ज्ञात या अज्ञात समारोह के उपंयास एजेंटों की प्रतिक्रिया और मात्रा जांच की जा सकती है । इस तरह के चुनाव आयोग५० और आईसी५० मूल्यों के रूप में मानक औषधीय मापदंडों की गणना की जा सकती है जब reagents सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग किया जाता है, जैसे, 10-5-10-9 एम और एक साथ सांद्रता बढ़ाने में जोड़ा लघुगणक स्केल ।

ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर विरोधी एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रयोगों
इस प्रयोग में, मानव myometrium के युग्मित स्ट्रिप्स के रूप में ऊपर वर्णित काट रहे थे और चित्रा 1में दिखाया गया है, के रूप में चित्रा 2में चित्रित ऊतक स्नान में घुड़सवार, और equilibrate की अनुमति के लिए समान आयाम के स्थिर संकुचन का उत्पादन और आवृत्ति. स्ट्रिप्स तो अंतर्जात OTR एगोनिस्ट, OT (०.५ एनएम) के लिए संकुचन उत्तेजित करने के लिए उजागर किया गया । OT (आमतौर पर ४५ मिनट) के तहत स्थिर गतिविधि की अवधि के बाद, atosiban एक लघुगणक स्केल (10-9-10-6 एम) के साथ सांद्रता बढ़ाने में एक पट्टी करने के लिए लागू किया गया था । दूसरी पट्टी को समय-नियंत्रण के रूप में अकेले ओटी में छोड़ दिया गया । atosiban की प्रतिक्रिया का एक उदाहरण चित्रा 5में देखा जा सकता है । संकुचन तुरंत नियंत्रण के रूप में atosiban की पहली एकाग्रता पूर्ववर्ती लेने (१००%), आयाम और लागू प्रत्येक एकाग्रता के लिए ईमेज के रूप में गणना की गई थी चित्रा 4में दिखाया गया है । समय-नियंत्रण प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक युद्धाभ्यास के समय-समकक्ष मापी की गई । डेटा तो प्लॉट किए गए थे और एक ग्राफिकल सॉफ्टवेयर पैकेज (चित्रा 5B-सी) में गैर रेखीय प्रतिगमन समारोह का उपयोग कर फिट घटता. निरोधात्मक प्रभाव की गणना के संदर्भ में, atosiban के सापेक्ष शक्ति आईसी५० को मापने के द्वारा गणना की गई थी जो एकाग्रता के कारण आधा अधिक से अधिक (५०%) निरोधात्मक प्रतिक्रिया है । एक ही एगोनिस्ट या संकुचन के उत्तेजितताओं के लिए किया जा सकता है । इस मामले में यौगिक की शक्ति चुनाव आयोग से गणना की है५० (एकाग्रता के कारण आधा अधिक से अधिक stimulatory प्रतिक्रिया) ।

उपंयास यौगिकों की प्रतिक्रिया की जांच और उनके रिसेप्टर Selectivity परीक्षण
हम एक नए संश्लेषित यौगिक के प्रतिकूल प्रभाव की जांच करने के लिए पूर्व vivo मानव myometrial संकुचन के इस शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का इस्तेमाल किया, [d-Arg8]-या तो देशी वी 1a के साथ उत्तेजित संकुचन पर inotocin ([डी-Arg8] INT) आर एगोनिस्ट, वीपी, या देशी OTR एगोनिस्ट, ओटी. हम इस परख का इस्तेमाल किया [डी-Arg8] INT, जो पहले औषधीय कोशिका आधारित तरीकों द्वारा निर्धारित किया गया था के रिसेप्टर selectivity मांय करने के लिए V1aR पर नहीं OTR५४पर एक विरोधी हो ।

इस प्रयोग में, मानव myometrial स्ट्रिप्स 1 के आसपास के लिए ०.५ एनएम उपाध्यक्ष या ०.५ एनएम ओटी के लिए उजागर किया गया के रूप में संकुचन उत्तेजित करने के लिए चित्रा 3में दिखाया गया है, हमारे उपंयास यौगिक जोड़ने से पहले [डी-Arg8] सांद्रता बढ़ाने में INT (चित्रा 6A और चित्रा 6C). यह तब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, ज्ञात V1aआर प्रतिपक्षी, SR49059 (फिगर घमण्ड) की तुलना में किया गया । चित्रा 6A एकाग्रता पर निर्भर कम करता है दिखाता है वीपी-उत्तेजित मानव myometrial संकुचन की बढ़ती सांद्रता के साथ [D-Arg8] INT । प्रत्येक एकाग्रता के लिए संकुचन और ईमेज के आयाम के लिए डेटा चित्रा 6Aii-iiiमें संक्षेप हैं । प्रभाव है कि ज्ञात V1aआर अवरोधक, SR49059, चित्रा 6Bi-iiiमें दिखाया गया की सांद्रता बढ़ाने के लिए दिखाया के समान है । selectivity [d-Arg8] V1aR की ओर int लेकिन OTR के प्रति नहीं तथ्य यह है कि [d-Arg8] int मानव myometrial संकुचन जो OT के साथ उत्तेजित हो गया है (चित्रा 6C) आयाम और ईमेज के रूप में कम नहीं है द्वारा प्रदर्शन किया है स्थिर बनी रही (चित्रा 6Cii-iii).

Figure 1
चित्रा 1: मानव myometrial बायोप्सी विच्छेदन. (क) मानव गर्भाशय का एक आरेख तीन ऊतक परतों कि गर्भाशय की दीवार शामिल दिखा । अंतरतम परत अंतर्गर्भाशयकला (गर्भावस्था में decidua, लाल तीर) है, मध्य परत myometrium (मांसल परत, काला तीर) जो संकुचन उत्पंन करता है, और बाहरी परत perimetrium (या serosal झिल्ली, नीला तीर) जो रूपों एक गर्भाशय के आसपास सुरक्षात्मक कोट । बायोप्सी नमूने के लिए ब्याज का क्षेत्र काले आयत द्वारा दर्शाया गया है । एक गर्भवती सीजेरियन अनुभाग के दौरान लिया महिला से एक उदाहरण बायोप्सी में दिखाया गया है (ख) decidua और myometrial परतों पर प्रकाश डाला (serosa दिखाई नहीं) के साथ । यह आवश्यक है कि विभिंन ऊतक परतों की पहचान की है ताकि myometrium के स्ट्रिप्स सही ढंग से प्रयोग के लिए विच्छेदित कर रहे हैं । myometrium का एक उदाहरण पट्टी जो विच्छेदित और काटा गया है (C) में दिखाया गया है । आमतौर पर, 2-6 स्ट्रिप्स काट रहे है और दिखाया के रूप में काटा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बहु अंग स्नान प्रयोगात्मक सेट अप मानव myometrium के संकुचन को मापने के लिए इस्तेमाल किया । (एक) myometrium के स्ट्रिप्स छोटे (1 मिलीलीटर) अंग स्नान एक गर्म जलाशय (i) के शीर्ष पर रखा कक्षों में रखा जाता है और एक सिकुड़नेवाला पंप (द्वितीय) के माध्यम से शारीरिक खारा समाधान (PSS) के साथ superfused हैं । जलाशय एक परिचालित जल स्नान (iii) के माध्यम से एक निर्धारित तापमान पर बनाए रखा है । प्रत्येक पट्टी एक बल transducer (iv) है, जो संकुचन के दौरान तनाव में परिवर्तन रिकॉर्ड से जुड़ा हुआ है । यह एक transbridge एम्पलीफायर द्वारा परिलक्षित (वी) और एक डिजिटल सिग्नल (vi) है, जो एक कंप्यूटर प्रणाली पर दर्ज किया गया है में परिवर्तित (सातवीं) एसोसिएटेड अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चल रहा है. (ख) सीटू में मानव myometrium की एक पट्टी के साथ एक अंग स्नान कक्ष की बढ़ी हुई छवि (लाल तीर), एक बल transducer से जुड़ी एक अंत और एक निश्चित हुक करने के लिए दूसरे के साथ PSS में नहाया । (ग) की स्थापना की योजनाबद्ध सिंहावलोकन । ऊतक चैम्बरों pss से भरा लगातार ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम PSS के साथ perfused है जो स्नान के नीचे एक गर्म पानी जलाशय के साथ गर्मी विनिमय के माध्यम से है (४५ डिग्री सेल्सियस पर रखा) और एक परिचालित पानी पंप ५५ डिग्री सेल्सियस पर सेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सहज और एगोनिस्ट-प्रेरित मानव myometrium के संकुचन इन विट्रो में । एगोनिस्ट-मुक्त स्थितियों में, सहज संकुचन आयाम या क्षेत्र के तहत-the-वक्र (ईमेज) (Aii, Aiii), की जांच के लिए इस मॉडल की मजबूती का प्रदर्शन के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना रिकॉर्डिंग के 3 से अधिक एच के लिए स्थिर रहते हैं सहज संकुचन पर विभिन्न एजेंटों के आवेदन । स्थिर, सहज संकुचन स्थापित करने के बाद, ०.५ एनएम ऑक्सीटोसिन (बी, ओटी) या vasopressin (सी, वीपी) शारीरिक खारा समाधान (PSS) करने के लिए जोड़ा गया था । उत्तेजना के तहत संकुचन भी संकुचन आयाम (बीि, सीआईआई) या ईमेज (Biii, Ciii) की महत्वपूर्ण हानि के बिना कई घंटे के लिए स्थिर रहने के लिए विभिन्न सिकुड़ा एजेंटों के प्रभाव को सक्षम करने के लिए myometrial एगोनिस्ट की मौजूदगी में जांच की । डेटा मतलब (SEM) के अर्थ ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । नोट, एगोनिस्ट-उत्तेजित संकुचन के लिए (B, C), नियंत्रण अवधि (१००%) एगोनिस्ट के आवेदन के पहले ४५ मिनट के बाद लिया जाता है, एक बार संकुचन स्थिर हो गया है । सभी मामलों में, स्ट्रिप्स ३७ डिग्री सेल्सियस पर PSS के साथ superfused थे, पीएच ७.४ (ठुकराया एट अल से reproduced. प्रजनन विज्ञान और डि Giglio एट अल से अनुमति के साथ ४० क्रिएटिव कॉमन ओपन एक्सेस लाइसेंस के तहत वैज्ञानिक रिपोर्टों से अनुमति के साथ ५४ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: डेटा विश्लेषण. (क) लाल रंग में दिखाई गई एक उपयुक्त नियंत्रण अवधि परीक्षण चक्रवृद्धि (ड्रग एक्स) के अनुप्रयोग के तुरंत पूर्ववर्ती अनुबंधों का चयन करके निर्धारित की गई थी । इस नियंत्रण अवधि भी दवा एक्स के आवेदन करने के लिए समय में बराबर है (उदा, इस उदाहरण में ४० मिनट) । एक बार मापा नियंत्रण अवधि के लिए मूल्यों १००% के रूप में सेट कर रहे हैं । सभी अनुवर्ती माप तो नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । (1) संकुचन के 4 विभिन्न मापदंडों कि मापा जा सकता है: (i) संकुचन के आयाम जो संकुचन की शक्ति (बल, mN), (ii) संकुचन की आवृत्ति जो संकुचन की दर के उपाय, (iii) संकुचन की अवधि जो संकुचन के आधे से अधिक चरम चोटी पर मापा जाता है, और (iv) वक्र के तहत क्षेत्र (भी बल अभिंन, मनमाना इकाइयों के रूप में जाना जाता है) जो समग्र काम का एक उपाय देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: मानव myometrium में ऑक्सीटोसिन-प्रेरित संकुचन पर atosiban के विरोधी प्रभाव रिकॉर्डिंग. एक बार सहज संकुचन स्थापित किए गए थे, संकुचन ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर एगोनिस्ट, ऑक्सीटोसिन (OT) के साथ उत्तेजित थे । संकुचन को एक और ४५ मिनट के लिए उत्तेजना के तहत स्थिर करने की अनुमति दी गई थी । (a) V1a और OT रिसेप्टर प्रतिपक्षी, atosiban तो एक लघुगणक स्केल (10-9-10-5एम) के साथ सांद्रता बढ़ाने में लागू किया गया था. atosiban की पहली एकाग्रता पूर्ववर्ती अवधि के दौरान संकुचन मापा और नियंत्रण के रूप में लिया गया (१००%). प्रत्येक बाद की एकाग्रता के तहत गतिविधि मापा और नियंत्रण के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था । एक ही समय का उपयोग कर अकेले ओटी को उजागर स्ट्रिप्स के लिए प्रदर्शन किया गया प्रयोगात्मक युद्धाभ्यास के समकक्ष. डेटा ग्राफ़िकल सॉफ़्टवेयर में प्लॉट किए गए थे: (B, C) दिखाएं एकाग्रता-atosiban (नीला) और वाहन के उपयुक्त कमजोर पड़ने के प्रतिकूल प्रभाव के लिए प्रतिक्रिया curves OT-प्रेरित myometrial संकुचन आयाम पर (ग्रे, समय नियंत्रण) और वक्र के तहत क्षेत्र (ईमेज), क्रमशः । डेटा (atosiban के आवेदन से पहले) आयाम और नियंत्रण गतिविधि के ईमेज का मतलब (SEM) प्रतिशत का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । आईसी५० मूल्यों तो गणना की गई है जो एकाग्रता है जिस पर आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक (५०%) संकुचन और बल अभिंन (ईमेज) के आयाम के लिए प्रतिक्रिया प्राप्त (ठुकराया एट अल से reproduced है । ४० प्रजनन विज्ञानसे अनुमति के साथ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: मानव myometrial संकुचन पर एक उपंयास यौगिक के प्रभाव और रिसेप्टर selectivity परीक्षण. मानव myometrium के सहज संकुचन के बाद स्थापित किए गए थे, संकुचन या तो vasopressin रिसेप्टर एगोनिस्ट, vasopressin (वीपी) (एअर इंडिया, द्वि) या ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर एगोनिस्ट, ऑक्सीटोसिन (ओटी) (Ci) के साथ उत्तेजित थे । [d-Arg8]-inotocin का प्रभाव ([d-Arg8] INT) और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध V1aआर विरोधी, SR49059 द्वारा उत्तेजित अनुबंधों पर यौगिकों की बढ़ती सांद्रता को लागू करके मूल्यांकन किया गया था । विशिष्ट प्रतिसाद (एअर इंडिया, द्वि) में दिखाए जाते हैं । आयाम और वक्र (ईमेज) के तहत क्षेत्र के लिए संबंधित विश्लेषण डेटा (ii) और (iii), क्रमशः जहां प्रभाव नियंत्रण गतिविधि (१००%) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया है में दिखाए जाते हैं । दोनों [d-Arg8] int और ज्ञात V1ar विरोधी, SR49059 कारण एक खुराक निर्भर कमी आयाम और ईमेज में, [D-Arg8] INT की भूमिका का समर्थन के रूप में एक वी1aआर रिसेप्टर प्रतिपक्षी मानव myometrium में. इसके विपरीत, [D-Arg8] INT (Ci-iii) OT द्वारा उत्तेजित संकुचन को प्रभावित नहीं किया है, इसलिए इसी तरह सेल आधारित परख से हमारे निष्कर्षों के लिए, [D-Arg8] INT भी मानव myometrium में V1aआर के प्रति selectivity से पता चलता है (Di से reproduced डेटा Giglio एट अल. क्रिएटिव कॉमन ओपन एक्सेस लाइसेंस के तहत वैज्ञानिक रिपोर्टों से अनुमति के साथ ५४ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

Whilst सबसे दवा विकास मानव विकारों के उपचार के लिए करना है, सबसे बुनियादी अनुसंधान मुख्य रूप से पशु ऊतकों में किया जाता है । यहां, हम सर्जरी से प्राप्त मानव myometrium के पूर्व vivo संकुचन की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं जो गर्भाशय फिजियोलॉजी और विकृति से संबंधित महत्वपूर्ण सवालों के एक नंबर का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को मान्य करने के लिए ज्ञात और उपंयास औषधीय एजेंटों के लिए दवा विकास सहायता । विशेष रूप से, हम इस परख के उपयोग पर प्रकाश डाला एक ज्ञात OTR और V1aके विरोधी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए आर प्रतिस्पर्धी विरोधी, ओटी-प्रेरित गर्भवती myometrial संकुचन पर atosiban, साथ ही साथ प्रतिक्रिया और रिसेप्टर निर्धारित करने के लिए एक नव विकसित चुनिंदा V1aR विरोधी, [D-Arg8] INT के selectivity. हम प्रदर्शित करते है कि महत्वपूर्ण pharmacokinetic मानकों जैसे चुनाव आयोग५० और आईसी५० गणना की जा सकती है, जो कक्ष-आधारित औषध विज्ञान डेटा के साथ अच्छी तरह से संरेखित करें ।

एकाधिक स्ट्रिप्स का उपयोग एक साथ कई एजेंट प्रभाव की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है, विरोधी के साथ प्रतियोगिता प्रयोगों, और उचित समय और वाहन नियंत्रण. के रूप में स्ट्रिप्स अक्सर 2, 4, या 8 के समूहों में तैयार कर रहे हैं, इस तकनीक मध्यम प्रवाह प्रदान करता है, के परीक्षण को सक्षम करने 2 – 4 यौगिकों में 6 – 8 (संचयी) सांद्रता (बायोप्सी प्रति). इस विधि भी वास्तविक समय डेटा प्रदान करता है ताकि प्रभाव जल्दी से मूल्यांकन किया जा सकता है और प्रोटोकॉल समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, इस तकनीक के हित के किसी भी परिसर का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अनुसंधान समूहों के एक नंबर द्वारा सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है myometrial शरीर क्रिया विज्ञान और दवा खोज में पर ध्यान केंद्रित । इस पत्र में वर्णित के रूप में शुद्ध यौगिकों का विश्लेषण करने के अलावा, गर्भाशय सिकुड़ना मॉडल भी किया गया है और सफलतापूर्वक इस तरह के पारंपरिक चिकित्सा से हर्बल की तैयारी के रूप में मिश्रण से उपंयास uterotonic यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है7 , ५५ , ५६.

हालांकि इस मॉडल तकनीकी रूप से मजबूत है और अच्छा reproducibility से पता चलता है, यह कुछ सीमाएं हैं: विच्छेदन ऊतक या विच्छेदन उपकरणों का उपयोग कर के साथ अपरिचित उन लोगों के लिए मुश्किल हो सकता है, इसलिए नए उपयोगकर्ताओं को कुछ समय की आवश्यकता के लिए ऊतक का अनुकूलन होगा तैयारी और प्रोटोकॉल । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि मानव myometrium ऐसे चूहे और माउस के रूप में अंय मॉडलों के रूप में काफी अलग है । सबसे कुतर uteri दो ट्यूब की तरह गर्भाशय के सींग से बना रहे हैं, एक छोर पर एक अंडाशय के साथ पूरा और गर्भाशय ग्रीवा में शामिल हो गए । प्रत्येक सींग स्पष्ट रूप से मानव myometrium में अलग फाइबर प्रकार whilst विच्छेदन पर आसानी से अलग किया जा सकता है, जो अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परतों, निर्धारित है अक्सर एक ' जाल ' बनाने intertwined हैं । इसके अलावा ह्यूमन myometrium की कॉन्ट्रैक्ट प्रोफाइल को कुतर कर काफी अलग किया जाता है । सबसे विशेष रूप से, मानव myometrium में संकुचन कम अवधि में लगातार लेकिन अब कर रहे हैं । मानव myometrium के साथ काम करने के लिए प्रयोगात्मक समय फ्रेम इसलिए अक्सर ज्यादा कुतर मॉडलों की तुलना में लंबे होते हैं । प्रजातियों के बीच रिसेप्टर अभिव्यक्ति में मतभेद भी काफी एगोनिस्ट करने के लिए प्रतिक्रियाओं में मतभेदों को चिह्नित करने के लिए योगदान कर सकते हैं और यह मन में वहन किया जाना चाहिए अगर प्रजातियों के पार extrapolating परिणाम.

इस प्रणाली से आउटपुट को अधिकतम करने के लिए विचार की जरूरत है कि कदम की भी संख्या में हैं । महत्वपूर्ण चरणों में ऊतक व्यवहार्यता का संरक्षण शामिल है जैसे देखभाल जब ऊतकों को संभालने के लिए विच्छेदन के दौरान किसी भी अनावश्यक क्षति से बचने या जब बढ़ते । एक कुशल आंख गर्भाशय मांसपेशियों के ठीक स्ट्रिप्स टुकड़े करने के लिए आवश्यक है, मांसपेशी फाइबर के उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने अनुदैर्ध्य दिशा में है और ऊतक के विमान के बाद, साथ ही निशान ऊतकों, decidua, और छोटे जहाजों से परहेज. अभिविन्यास प्रयोजनों सहायता करने के लिए एक बार नमूना प्रयोगशाला में है, यह एक टैग जोड़ने के लिए संभव है (जैसे छोटे सर्जिकल टांका) की बायोप्सी के एक तरफ करने के लिए संग्रह के समय में decidual किनारे से serosal बढ़त चित्रित.

ऊतकों के रूप में प्रयोग के दौरान एक स्थिर 36-37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए ऊतक समारोह के तापमान में उतार चढ़ाव के अधीन है । इस प्रयोगशाला के भीतर एक मजबूत एयर कंडीशनिंग इकाई के साथ प्राप्त किया जा सकता है । उष्ण PSS के निरंतर छिड़काव तापमान को सुनिश्चित करता है और साथ ही संकुचन से अपशिष्ट उत्पादों के फ्लशिंग को बनाए रखा जाता है । अंग स्नान के भीतर तापमान प्रवाह की दर को बदलने या सीधे पानी स्नान तापमान को एडजस्ट करके बदला जा सकता है । पारंपरिक 5-50 मिलीलीटर स्नान की तुलना में छोटे स्नान के आकार के PSS और रिएजेंट के वॉशआउट के एक अपेक्षाकृत तेजी से कारोबार सुनिश्चित करता है । लघुकृत अंग स्नान के रूप में यहां वर्णित है, यह भी PSS और ब्याज की जरूरत के रिएजेंट की मात्रा कम कर देता है, इस प्रकार लागत को कम करने और कीमती, नव विकसित रसायनों छोड़ । इसके अलावा, छोटे स्नान के आकार के कारण और एक HEPES आधारित बफर का उपयोग कर, इस प्रणाली को ऑक्सीजन की आवश्यकता नहीं है उदा, carbogen के साथ PSS bubbling द्वारा । स्ट्रिप्स के लिए लागू तनाव का मानकीकरण भी महत्वपूर्ण है. इस आकार (5 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी) के स्ट्रिप्स के लिए, यह लगभग 2 mN (बराबर ~ ०.२ g) होना चाहिए । वैकल्पिक तरीकों में एक उच्च पोटेशियम समाधान के आवेदन शामिल करने के लिए अधिक से अधिक संकुचन प्रेरित और इस अधिकतम संकुचन का आधा खींच । यह हालांकि ध्यान दिया जाना चाहिए, कि vivo में लागू तनाव अलग हो सकता है ।

मुख्य चुनौतियों मानव विषयों से ऊतकों को प्राप्त करने में शामिल हैं, लेकिन कर लगाने, मानव ऊतकों स्पष्ट रूप से मानव रोग और दवा खोज में गर्भाशय के संकुचन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक शारीरिक प्रासंगिक (और पुरस्कृत) मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । अलग ऊतक स्ट्रिप्स तथापि, जरूरी नहीं कि vivo में ऊतक के लिए समानता के रूप में वे उदाहरण के लिए छूट रहे हैं, हार्मोनल और तंत्रिका इनपुट के जो, हालांकि संकुचन के लिए आवश्यक नहीं, vivo मेंसंकुचन संग्राहक जाएगा. यह परख हालांकि एक नियंत्रित तरीके से myometrial संकुचन का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है, ऐसे प्रभावों से अलग । यह भी इस तरह के संकुचन के हार्मोनल नियंत्रण के रूप में कारकों के प्रभाव के लिए अनुमति देता है (उदा, OT के माध्यम से, वीपी, prostaglandins, आदि) की जांच करने के लिए, myometrial समारोह के विनियमन के लिए सुराग प्रदान । के रूप में ऊतकों को विभिंन महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं, वहां स्वाभाविक रूप से नमूनों के बीच सहज सिकुड़ा प्रोफाइल में कुछ भिंनता है । इसलिए यह अक्सर कुछ datasets५३में भिंनता को कम करने के लिए नमूनों की एक बड़ी संख्या (~ n = 10) पर प्रयोग करने के लिए आवश्यक है । यह सबसे महत्वपूर्ण है जब विभिंन रोगी समूहों के बीच सिकुड़ा गतिविधि की तुलना । गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एगोनिस्ट और विरोधी की प्रतिक्रिया को सामान्य करना (यानी, नियंत्रण गतिविधि या उच्च K+के प्रतिशत के रूप में व्यक्त) इस भिन्नता के कुछ कम कर देता है. इसके अलावा, अंतर पट्टी भिन्नता को कम करने के लिए, डेटा उनकी लंबाई और वजन पोस्ट प्रयोग४१को मापने के द्वारा पट्टी पार अनुभागीय क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है. यह विशेष रूप से उपयोगी है जब विभिंन रोगी समूहों के बीच संकुचन पैटर्न की तुलना ।

इस तकनीक की सीमाएं भी ताजा ऊतकों जो अस्पताल के कर्मचारियों, विशेष रूप से थिएटर स्टाफ और सहमति प्रक्रिया में शामिल लोगों के साथ अच्छा काम कर रिश्तों की आवश्यकता के लिए उपयोग शामिल हैं । स्थानीय अनुसंधान नैतिकता समिति और संस्थान या अस्पताल की समीक्षा बोर्ड से नैतिक अनुमतियों को भी जगह में होना चाहिए । मानव myometrium का संग्रह सबसे अधिक संभावना सीएस प्रसव के दौरान किया जाता है, जब दाता सर्जरी के दौर से गुजर रहा है । बायोप्सी एक ही गर्भाशय चीरा बच्चे को वितरित करने के लिए बनाई गई साइट से लिया जाता है और इसलिए रोगी किसी भी आगे अतिरिक्त प्रक्रियाओं से गुजरना करने की जरूरत नहीं है । थियेटर स्टाफ और बायोप्सी प्रदर्शन सर्जन के ऊतकों के बाद के उपयोग के बारे में पता किया जा करने की आवश्यकता है और है कि वे ऐसे एक पैथोलॉजी विभाग को भेजने के लिए के रूप में निर्धारण समाधान में रखा जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं. लंबी प्रयोगात्मक समय सीमा एक और विचार है । मानव ऊतकों के साथ प्रयोग कई घंटे ले (आमतौर पर > 6 एच) (के रूप में 2 के खिलाफ-3 ज चूहा या माउस गर्भाशय में एक समान प्रयोग के लिए), संकुचन की धीमी आवृत्ति के कारण और 2-3 एच ऊतक के बीच अंतराल समय बढ़ते और स्थापना के सहज संकुचन. हालांकि, जैसा कि हम ने दिखाया है, मानव ऊतक संकुचन मजबूत कर रहे हैं, और जब स्थापित कई घंटे के लिए महत्वपूर्ण थकान के बिना अनुबंध कर सकते हैं४०

यह प्रणाली भी vivo में काम की अन्य चुनौतियों गर्भवती ऊतक पर दवा एजेंट का परीक्षण करने की क्षमता सहित काबू पाने के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक को आसानी से माउस सहित अंय प्रजातियों के लिए extrapolated किया जा सकता है जिससे प्रारंभिक परिणाम पूरे पशु अध्ययन में आगे बढ़ने से पहले की पुष्टि की जा सकती है । तापमान में नियंत्रित परिवर्तन, superfusate की संरचना (PSS), और पीएच आसानी से vivo में विभिंन परिदृश्यों की नकल और यौगिक व्यवहार पर इन परिवर्तनों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए बनाया जा सकता है । myometrial स्ट्रिप्स में isometric तनाव को मापने के बुनियादी सिद्धांतों को भी फ्लोरोसेंट सीए या पीएच के उपयोग द्वारा intracellular कैल्शियम एकाग्रता या पीएच में एक साथ परिवर्तन को मापने के लिए विस्तारित किया जा सकता है (एच+) संकेतक और उपकरणों का पता लगाने के लिए और रर प्रतिदीप्ति५७,५८,५९,६०.

कुल मिलाकर, मानव myometrium का प्रतिनिधित्व करता है एक मजबूत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल की विशेषता और मांय औषध खोज में उपंयास चिकित्सीय यौगिकों-दोनों शुद्ध यौगिकों और मिश्रण । हम ओटी/वीपी प्रणाली के संबंध में दवा की खोज में इसके उपयोग के उदाहरण प्रदान की है और OTR और V1एकआर विरोधी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कैसे इस मॉडल को परिभाषित लक्ष्य पर यौगिक प्रभावकारिता और शक्ति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ligand selectivity मांय । हालांकि, यह मन में वहन किया जाना चाहिए कि इस तकनीक के हित या myometrial संकुचन (या विश्राम) के लिए अग्रणी मार्ग के किसी भी लक्ष्य का अध्ययन किया जा सकता है, साथ ही साथ नए लक्ष्यों और रास्ते की दवा खोज सहायता के लिए, और myometrial की हमारी समझ अग्रिम फिजियोलॉजी और pathophysiology ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट नं ७१४३६६) के तहत प्रोजेक्ट I3243 और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) के माध्यम से ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF) द्वारा समर्थन दिया गया है । CWG एक चाप डिस्कवरी अर्ली कैरियर शोधकर्ता (DECRA) फैलोशिप (DE150100784) द्वारा एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) भविष्य फैलोशिप (FT140100730) और मिमी द्वारा समर्थित किया गया है । एसए एक हैरिस-भलाई अपरिपक्व जंम अनुसंधान केंद्र महिलाओं, ब्रिटेन की भलाई के द्वारा प्रशासित अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Origin software Origin Lab 2015 version
Labscribe Software WPI Formally Datatrax
GraphPad Prism graphical software GraphPad Prism PRISM 5
LabTrax 4-Channel Data Acquisition WPI LAB-TRAX-4
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M
Force-displacement Transducer WPI FORT10g 10 g
BNC to BNC Cable WPI 500184
Magnetic Clamp stand WPI M10
Micrometer Reconditioned from microscopes
Peristaltic pump Gilson MINIPULS3 R4 Standard pump head
Suction pumps Various AP2 air pump
Circulating Water bath Grant Instruments TC120 5L
Perspex Tissue Bath Custom made
Water reservoir container the reallyusefulbox 7L
Tissue Hooks (fixed) Hand made in house
Peristaltic tubing Gilson F117948 PVC 2.79 mm internal diameter
Tygon Tubing Fisher Scientific various diameters R-3603
Aluminium clips Laser services, USA custom made
Stereo Zoom binocular microscope WPI PZMIV
Microscope Fiber-optic Light Source WPI PHOTONIC PL 2000
Dissecting Dishes Handmade with Sylgard
Sylgard Silicone Elastomer kit Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors WPI 50086 8.5 cm, straight edge
Iris Forceps WPI 15914 10 cm, straight edge (serrated)
Dissecting scissors WPI 14393 10 cm, straight
Dissecting pins SIGMA Z192341 B-D precision guide syringe needle 30G
HBSS SIGMA H9269
Physiological Salt Solution SIGMA various PSS
Oxytocin acetate salt SIGMA O6379
[Arg8]-vasopressin acetate salt SIGMA V9879

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
  3. Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
  4. Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
  5. Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
  6. Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
  7. Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
  8. Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
  9. Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
  10. Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
  11. Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
  12. Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
  13. Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
  14. Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
  15. Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
  16. Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
  17. Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
  18. Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
  19. Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
  20. Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
  21. Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
  22. Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
  23. McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
  24. Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
  25. Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
  26. Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
  27. Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
  28. Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
  29. Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
  30. Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
  31. Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
  32. Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
  33. Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
  34. Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
  35. Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
  36. Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
  37. Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
  38. Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
  39. Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
  40. Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
  41. Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
  42. Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
  43. Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
  44. Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
  45. Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
  46. Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
  47. Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
  48. Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
  49. Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
  50. Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
  51. Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
  52. Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
  53. Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
  54. Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
  55. Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
  56. Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
  57. Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
  58. Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
  59. Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
  60. Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).

Tags

चिकित्सा अंक १३१ फिजियोलॉजी औषध विज्ञान myometrium मानव गर्भाशय संकुचन अंग स्नान पेप्टाइड ऑक्सीटोसिन vasopressin ड्रग डिस्कवरी
मानव गर्भाशय चिकनी मांसपेशी के सिकुड़ना माप दवा विकास सहायता के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arrowsmith, S., Keov, P.,… More

Arrowsmith, S., Keov, P., Muttenthaler, M., Gruber, C. W. Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development. J. Vis. Exp. (131), e56639, doi:10.3791/56639 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter