Summary
这篇手稿描述了一个简单和快速的实验程序, 以确定蛋白质-蛋白质相互作用的基础上荧光活动的测量。
Abstract
蛋白质-蛋白质相互作用是在大多数细胞过程中中继信号传导的基本机制;因此, 鉴定新的蛋白质-蛋白质相互作用对和监测蛋白质相互作用动力学是特别感兴趣的揭示植物如何响应环境因素和/或发展信号。已经开发出过多的方法来检测蛋白质-蛋白质相互作用, 无论是体外还是体内。其中, 最近建立的荧光互补成像技术是最简单和最快的方法来演示体内蛋白-蛋白质相互作用。在这种检测中, 蛋白质 a 或蛋白 B 与氨基末端或羧基末端荧光的一半分别融合。当蛋白质 a 与蛋白质 B 相互作用时, 荧光的两个半部分将被重组, 形成功能性和活性的荧光酶。荧光活动可以用计或 CCD 摄像机记录。与其他方法相比, 基因组检测显示蛋白质-蛋白质相互作用的定性和定量。农杆菌在烟草烟叶片中的浸润是一种广泛应用的瞬态蛋白表达系统。通过 COP1 和瞬态表达式的结合, 表明茉莉处理后, SPA1 的物理相互作用逐渐降低。
Introduction
为了协调生长与环境, 植物已经进化了优雅的信号通路, 感知, 传感器, 并响应信号提示。就像接力赛中的赛跑者一样, 蛋白质是植物信号传导的必要参与者。人们普遍认识到蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 在细胞通讯中起着重要作用。蛋白质的磷酸化、再乙酰化和降解都依赖于靶蛋白与其修饰酶之间的物理相互作用。例如, 茉莉以域蛋白 (JAZ) 家族蛋白与转录因子 MYC2 相互作用并抑制其转录活性1,2。鉴于 PPI 的重要性, 植物中的 large-scale 蛋白 interactomes 最近已被探索3,4,5。这些 interactome 的结果进一步揭示了复杂的调控网络, 协调不同的细胞功能。
有一些既定的方法来监测 PPI。酵母两种杂交 (Y2H) 法是 PPI 检测中应用最广泛的方法。Y2H 很容易执行, 适合快速检测蛋白质相互作用。Y2H 也广泛用于筛选未知的交互合作伙伴的特定 protein-of-interest。然而, 由于 Y2H 完全是在酵母中进行的, 它不能反映植物细胞的真实情况, 并带来高假阳性率。另一个类似的策略是下拉法。一般来说, 两个蛋白质的表达和纯化从大肠杆菌细胞, 然后混合和固定的检测蛋白相互作用。虽然此方法不费时, 但它也无法获取在体内交互结果。对于体内交互目的, co-immunoprecipitation (co) 是最常用的检测方法, 它要求高质量的抗体 immunoprecipitate protein-of-interest, 不能排除间接质子的可能性。此外, 由于联合 IP 中的复杂实验程序, 结果通常与个人专长不同。
基于记者的重组分析大大推进了对体内PPI 的检测。这些方法包括荧光共振能量传递 (烦恼)6, 双荧光互补 (BiFC)7, 和萤火虫荧光互补成像 (的) 试验8。虽然这三种方法比 co 更好地反映直接的在体内PPI, 烦恼, 和 BiFC 需要特定的显微镜来检测荧光信号, 不能轻易量化的互动强度。相比之下, 该公司利用萤火虫荧光, 这将发光后与它的基底素反应。更重要的是, PPI 强度可以从荧光活动的价值来确定。因此, 它不仅表明两种蛋白质是否相互作用, 而且还提供了治疗时相互作用动力学的信息。虽然有一些建立的方法来监测交互动力学 (基于表面等离子体共振或热稳定转移)9,10, 这些方法需要微妙的仪器或特定的标签。相比之下, 它更易于执行和检测。
该方法的原理是将氨基末端和羧基末端的荧光 (分别命名为 n-卢克或 C-卢克) 与蛋白 A 和 B 融合, 并在植物细胞中同时表达这两种融合蛋白。如果蛋白质 a 与蛋白质 B 相互作用, 那么荧光的两个半部分将被重组为活性荧光酶。荧光活动可以通过计或 CCD 摄像头检测到。没有必要获得稳定的转化。瞬态表达式足以获得高质量的交互结果。
环型 E3 泛素连接本构 photomorphogenic 1 (COP1) 与无数转录因子相互作用, 通过26S 蛋白酶体11促进它们的降解。其中一些 COP1-targeted 转录因子是光的阳性调节剂。在黑暗中, COP1 与光敏 A-105 1 (SPA1) 的抑制器交互, 这增强了 COP1 E3 活动8。在对光的知觉之后, 光将废除 COP1-SPA1 相互作用抑制 COP1 活动, 然后稳定 COP1 基板12,13,14。这个例子说明了研究 ppi 和确定 ppi 动力学的生物学意义。
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Protocol
1. 植物的准备 (8 周)
- 将 50烟草烟种子放在一个1.5 毫升的离心管中, 其中含有1毫升5% 次氯酸和0.1% 海卫 X-100 (v/v) 溶液, 并留出5分钟来消毒种子。
- 用无菌水冲洗种子5次, 在200µL 的无菌水中暂停种子。
- 小心地将单个种子放到 MS 琼脂培养基上 (1 L: 1x 村 & Skoog 盐, 10 克蔗糖, pH 5.8 (KOH), 1% 琼脂), 并在4° c 中储存介质板, 3 天以同步发芽。
注意: 为了避免微生物污染, 在干净的长凳上执行这一步。在灭菌过程中不需要摇动管子。 - 将培养基板置于正常生长条件下 (22 ° c, 80-90 µmolm-2s-1白光强度) 为10天, 然后将发芽的幼苗转移到土壤中。
注意: 一定要将幼苗根部插入土壤中, 不要破坏根部。用透明的塑料盖盖在托盘上过夜, 以保持湿度。 - 在一个受控的生长室中生长的植物在一个 16 h/8 的 h 光/暗循环和70% 湿度。7周前的N. 烟植物已准备好进行Agrobacteriumtumefaciens浸润 (图 1A)。
注: 水厂和控制害虫的需要, 保持植物的健康。
2. 在n 烟叶片中的瞬态表达式 (7-10 天)
- 提供 150 ng 质粒 (pEGAD-哈卢-卢克控制粒, 空向量, 和构建质粒的检测, 在这种情况下, 我们使用 pCAMBIA1300-Nluc 和 pCAMBIA1300-Cluc 的质粒建设) 到.标准电穿孔法。
- 在 Luria Bertani (LB) 琼脂培养基 (1 升:10 克氯化钠, 5 克酵母提取物, 10 g 胰, 1.5% 琼脂) 中含有50µg/毫升卡那霉素和50µg/毫升利福平在28° c 4 天的培养.
注: 抗生素的选择取决于所使用的载体和. - 将单个A. 农杆菌菌落从每个板块接种到3毫升的 LB 液体培养基中, 其中含有50µg/毫升的卡那霉素和50µg/毫升的利福平, 在28° c 时摇动 220 rpm, 以传播细胞培养。
- 将75µL 的细菌培养物转化为15毫升的新鲜 LB 液体培养基, 其中含有50µg/毫升的卡那霉素和50µg/毫升的利福平, 其稀释系数为200。培养细菌在220转每分钟在30° c 为大约 8 h, 直到 OD600在0.5 到1.0 之间。
- 将A. 农杆菌液体培养在15毫升离心管和离心机在 4000 x g 和4° c 为 15 min. 丢弃上清, 并在15毫升的转化溶液中悬浮颗粒以洗涤颗粒。
- 旋转管在 4000 x g 和4° c 为15分钟和放弃上清液。再次重复洗涤步骤。
- 在5毫升的转化液中重颗粒, 室温下保持2小时。使用转换解调整A. 农杆菌颗粒细胞的密度, 直到最终浓度的 OD600是 0.5, 或混合两个样本的大小相等, 以测试配对蛋白质的相互作用。
- 将悬浮细胞渗透到 4th至 7th , 带1毫升针注射器 (图 1B-C)。入渗后, 用黑色塑料盖立即盖住植物, 在黑暗中放置托盘12小时。之后, 在发现卢克的活动之前, 像往常一样种植2到4天的植物。
注意: 选择大小相近的健康叶子。在一片叶子中, 四不同区域的渗透是好的。
3. 检测荧光活动 (一天)
注意: 有两种方法可以监视荧光活动。一个是基于成像, 另一个是定量测量荧光活动。
-
成像方法
- 分离渗透的叶子, 把整个传单放在 MS 琼脂培养基上。
- 用50毫升喷雾瓶将素工作缓冲液喷洒到叶片正面表面。保持材料在黑暗中5分钟, 以淬火叶绿素荧光。
- 使用低光冷却的 CCD 成像设备 (冷却到-30 ° c) 捕获图像 (图 2)。light-filed 曝光时间为50毫秒, 发光检测时间为1分钟。
注: 根据机器说明书调整参数。较低的温度会提高信噪比, 提高图像质量。
- 或者, 直接用商业计测量发光。
- 小心地将叶子碎片 (大约0.25 厘米2) 从N. 烟的渗透区中取出, 然后将叶盘浸入100µL 的去离子水中, 在96井白板中 (图 3)。
- 添加10µL 的素工作缓冲器, 离开5分钟。然后进行具体的处理, 研究蛋白质相互作用的动力学。
注意: 在不同的时间点检测发光与计, 以获得荧光活性动力学, 这代表了蛋白质-蛋白质相互作用的动力学在一定的治疗。该方法具有同时检测大量蛋白质对的优点。对于那些没有商业计, 检查荧光蛋白质丰度由西方印迹, 因此引用的卢克活动定量。如果没有必要的光, 只是保持板在计和测量发光在不同的时间点。否则, 在检测间隙中将板材移入生长腔。为了获得统计学意义上的结果, 使用至少三的生物复制。虽然卢克的活动从不同的渗透区将变化, 他们的变化模式是一致的正常化后。
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Representative Results
在这个荧光的互补协议中, 有三主要的步骤可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的体内, 包括植物生长、烟草浸润和荧光测定。该协议中最关键的步骤是将液体A. 农杆菌渗透到N. 烟叶 (图 1)。
下面是这个技术的一个例子, 它证实了茉莉减少 COP1-SPA1 的相互作用。荧光的氨基末端和羧基端部分别与 COP1 (COP1-NLuc) 或 SPA1 (CLuc-SPA1) 融合。COP1-SPA1 的相互作用导致功能荧光的互补。通过 CCD 摄像机 (图 2) 对荧光活动进行了成像, 并且可以用计 (图 3) 检测酶活性。为了排除荧光本身受治疗影响的可能性, 全长荧光 (吕克) 基因也在N. 烟叶中瞬时表达, 作为一种控制。茉莉处理前的荧光活动 (时间 0) 设置为 1, 然后在茉莉处理下获得的每个荧光活动值均归入时间 0, 以获得相对荧光活动 (图 4)。结果表明, COP1-SPA1 的相互作用 (由荧光活动反映) 在黑暗中逐渐下降, JA 治疗进一步减少了它们之间的相互作用。
图 1.N. 烟浸润的过程。
(A)植物在入渗前的背面和正面的视图。(B)代表图像以显示渗透协议。(C)在渗透后的植物背面和正面的看法。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.CCD 摄像机下的成像荧光活动。
(A)在正常光场下的一个N. 烟叶的代表图像。(B)检测 CCD 摄像机下的发光信号, 以显示荧光活动。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3。代表图像, 以显示如何测量从剪切的叶盘的发光.
被渗透的叶子盘被切开了并且投入了96个好白色板材测量发光信号。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.一个瞬态荧光互补法的代表性结果。
(A)列出了处理时间 (时间) 和发光值 (吕克活动) 的原始结果。每个样本有三独立的复制。为准备这张图表, 卢克活动在不同的处理时间点被规范化了以时间0作为相对卢克活动。
(B)相对于卢克活动的量化, 显示 COP1-SPA1 在黑暗中的相互作用逐渐减少, 这可以通过进一步的 JA 处理来减少。错误栏指示标准偏差 (sd)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的协议是简单和可再生的研究在体内蛋白质-蛋白质相互作用, 特别适合检测蛋白质相互作用动力学在外在治疗之下。本试验的关键步骤是烟浸润。为了确保渗透成功, 植物必须非常健康。另一个关键因素是何时检查渗透后的荧光活动。这个问题没有正确的答案。研究人员被鼓励监测荧光活动在不同的日子后, 渗透判断时, 荧光是表达的最高水平, 因为我们观察到的蛋白质表达水平随时间波动8。
在一些实验中, 可能没有发现任何发光。没有适当的控制, 就不能排除假底片。需要一个全长荧光控制, 以证明渗透和荧光检测工作。如果在假定的蛋白质相互作用对中仍然没有发光, 则需要一个免疫来检测蛋白质的表达, 以防一个或两个蛋白质没有成功表达。最后的可能性是, 蛋白质的相互作用可能阻碍荧光互补由于蛋白质构象的原因。如果发生这种情况, 使用截断蛋白质或切换与 N-卢克或 C-卢克的蛋白质融合将有助于解决这个问题。
虽然原生质体在瞬态表达中也很流行, 但原生质体和质粒的分离需要特定的专门知识, 并且需要有害的中和 large-scale 质粒的2 。此外, 在原生质体分离期间, 植物严重受伤, 这可能会影响 PPI 测定。
没有金色的标准化验。根据我们的知识, 这容易执行荧光互补试验可以提供有用的蛋白质相互作用的动力学信息。当然, 研究蛋白质相互作用的替代方法在体内将证实这些结果并提高对细胞中生物化学事件的了解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了江苏省自然科学基金 (BK20140919)、中国国家自然科学基金 (31470375)、江苏高等教育机构重点学术项目开发和青兰项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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