Summary
Dette manuskript beskriver en nem og hurtig eksperimentel procedure til bestemmelse af protein-protein interaktioner baseret på måling af luciferase aktivitet.
Abstract
Protein-protein interaktioner er grundlæggende mekanismer for genudlægning signaltransduktion i mest cellulære processer; identifikation af roman protein-protein interaktion par og overvågning protein interaktion dynamics er derfor af særlig interesse for at afsløre, hvordan planter reagere på miljøfaktorer og/eller udviklingsmæssige signaler. Et utal af metoder er blevet udviklet for at undersøge protein-protein interaktioner, enten in vitro eller i vivo. Blandt dem er den nyligt etablerede luciferase komplementering imaging (LCI) assay den enkleste og hurtigste metode til at demonstrere i vivo protein-protein interaktioner. I denne analyse, protein A eller protein B er sammenvokset med i amino-terminal eller carboxyl-terminal halvdel af luciferase, henholdsvis. Når protein A interagerer med protein B, vil de to halvdele af luciferase skal rekonstitueres til at danne en funktionel og aktive luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan registreres med en luminometrisk eller CCD-kamera. Sammenlignet med andre tilgange, viser LCI analysen protein-protein interaktioner, både kvalitativt og kvantitativt. Agrobacterium infiltration i Nicotiana benthamiana blade er et udbredt system for forbigående protein udtryk. Med kombinationen af Lønomkostningsindekset og forbigående udtryk viser disse tilgange, at den fysiske interaktion mellem COP1 og SPA1 blev gradvist reduceret efter jasmonate behandling.
Introduction
For at koordinere vækst med sine omgivelser, har planter udviklet elegante signaling veje for at fornemme, transduce og svare til signalering stikord. Som løbere i et stafetløb er proteiner nødvendige spillere i anlægget signaltransduktion. Det har været almindeligt anerkendt, at protein-protein interaktion (PPI) spiller en stor rolle for cellulære kommunikation. Protein fosforylering, acetylation og nedbrydning er alle afhængige af fysiske samspil mellem et mål protein og dens ændring enzymer. For eksempel, Jasmonate ZIM-domæne protein (JAZ) familie proteiner interagere med transskription faktor MYC2 og undertrykke sin transcriptional aktivitet1,2. I betragtning af betydningen af PPI udforsket storstilet protein interactomes i planter er blevet seneste3,4,5. Disse interactome resultater yderligere afsløre de komplekse regulerende netværk, der koordinerer forskellige cellulære funktioner.
Der er nogle etablerede metoder til overvågning af PPI. Gær to hybrid (Y2H) assay er den mest udbredte metode til registrering af PPI. Y2H er nem at udføre, og egnet til en hurtig test til at undersøge protein interaktioner. Y2H er også almindeligt anvendt til screening ukendt interaktion partnere til specifikke protein-af-interesse. Dog fordi Y2H er helt udført i gær, afspejler ikke det den virkelige scenario i plante-celler og bringer høj falsk positive priser. En anden lignende strategi er pull-down analyse. Generelt er to proteiner udtrykt og renset fra Escherichia coli celler og derefter blandes og immobiliseret til påvisning af protein interaktioner. Selv om denne metode ikke er tidskrævende, kan ikke det skaffe i vivo interaktion resultater enten. I vivo interaktion henblik er co-immunoprecipitation (co-IP) den mest populære assay, som kræver høj kvalitet antistof mod immunoprecipitate protein af interesse og ikke udelukke muligheden for indirekte ppi. Desuden, på grund af de komplicerede eksperimentelle procedurer i co-IP, resultaterne normalt variere med individuelle ekspertise.
Reporter baseret rekonstitution assays forhånd stærkt påvisning af i vivo PPI. Disse metoder omfatter fluorescens resonans energi overførsel (FRET)6, bimolecular fluorescens komplementering (BiFC)7og firefly luciferase komplementering imaging (LCI) assay8. Selv om disse tre tilgange er bedre end co-IP til at afspejle den direkte i vivo PPI, FRET og BiFC har brug for specifikke mikroskoper til at opdage fluorescens signaler og kan ikke nemt kvantificere interaktion intensitet. Derimod udnytter LCI firefly luciferase, hvilket vil glød efter reagerer med sit Bæremateriale luciferin. Endnu vigtigere, kan PPI intensitet bestemmes ud fra værdien af luciferase aktivitet. Således angiver LCI ikke kun om to proteiner interagere eller ikke, men indeholder også oplysninger om interaktion dynamikken på behandling. Selv om der er nogle etablerede metoder til overvågning af interaktion dynamics (baseret på overflade plasmon resonans eller thermo-stabilitet forskydninger)9,10, kræver disse tilgange delikat instrumenter eller specifik mærkning. Derimod er LCI lettere at udføre og opdage.
Princippet for LCI er der i amino-terminal og carboxyl-terminal halvdele af luciferase (opkaldt N-Luc eller C-Luc, henholdsvis) var sammenvokset med protein A og B, og disse to fusion proteiner var samtidig udtrykt i plantecellerne. Hvis protein A interagerer med protein B, derefter rekonstitueres de to halvdele af luciferase for at være en aktiv luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan opdages med en luminometrisk eller CCD-kamera. Det er ikke nødvendigt at opnå stabile transformants for LCI; forbigående udtryk er nok til at få en høj kvalitet interaktion resultat.
RING-type E3 ubiquitin ligase konstitutiv photomorphogenic 1 (COP1) interagerer med et utal af transkriptionsfaktorer og fremmer deres nedbrydning gennem 26S proteasom11. Nogle af disse COP1-målrettet transkriptionsfaktorer er positive tilsynsmyndigheder inden for photomorphogenesis. I mørke interagerer COP1 med suppressor af phytochrome A-105 1 (SPA1), hvilket forbedrer COP1 E3 aktivitet8. Efter opfattelsen af lys, vil fotoreceptorer ophæve COP1-SPA1 interaktionen for at hæmme COP1 aktivitet og derefter stabilisere COP1 substrater12,13,14. Dette eksempel illustrerer den biologiske betydning af at studere PPI og bestemmelse af PPI dynamics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af planter (8 uger)
- Sætte 50 Nicotiana benthamiana frø i en 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 1 mL 5% NaClO og 0,1% Triton X-100 (V/V) opløsning og henstår i 5 min til at sterilisere frøene.
- Skyl frøene med sterilt vand 5 gange og suspendere frø i 200 µL sterilt vand.
- Omhyggeligt sted enkelte frø på overfladen af MS-agarsubstratet (1 L: 1 x Murashige & Skoog salte, 10 g saccharose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) med fine tips og store medium plader i 4 ° C i 3 dage for at synkronisere spiring.
Bemærk: For at undgå mikrobe kontaminering, udføre dette trin på en ren bænk. Det er ikke nødvendigt at ryste røret under sterilisering. - Placer mellemlang plader under normale vækstbetingelser (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 hvid lysintensitet) for 10 dage, og derefter overføre de spirede planter i jorden.
Bemærk: Sørg for at indsætte sætteplante rødder i jorden og ikke skade rødderne. Dække bakken med en gennemsigtig plast dække natten til at opretholde fugt. - Dyrke planter i et kontrolleret vækst værelse på en 16 h/8 h lys/mørke cyklus og 70% luftfugtighed. 7 uger gamle N. benthamiana planter er klar til Agrobacteriumtumefaciens infiltration (fig. 1A).
Bemærk: Vandplanter og bekæmpelse af skadegørere efter behov for at holde planter sunde.
2. forbigående udtryk i N. Benthamiana blade (7-10 dage)
- Leverer 150 ng af plasmider (pEGAD-HA-LUC kontrol plasmid, Tom vektor og konstruerede plasmid for LCI assay, i dette tilfælde vi brugte pCAMBIA1300-Nluc og pCAMBIA1300-Cluc for plasmid konstruktion) i A. tumefaciens kompetente celle stamme GV3101 med en standard elektroporation metode.
- Kultur A. tumefaciens på Luria-Bertani (LB) agar medium (1 L: 10 g NaCl, 5 g gær extract, 10 g trypton, 1,5% agar) indeholdende 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL af rifampicin på 28 ° C i 4 dage.
Bemærk: Valget af antibiotika afhænger vektor og A. tumefaciens stamme anvendes. - Podes en enkelt A. tumefaciens koloni fra hver plade i 3 mL af LB flydende medium indeholdende 50 µg/mL af kanamycin og 50 µg/mL af rifampicin og ryste på 220 rpm ved 28 ° C i 24 timer til at udbrede cellekultur.
- Overføre 75 µL af bakteriekulturen til 15 mL frisk LB flydende medium indeholdende 50 µg/mL af kanamycin og 50 µg/mL af rifampicin, fortynde det med en faktor på 200. Kultur bakterier på 220 rpm ved 30 ° C for omkring 8 timer, indtil OD600 er mellem 0,5 til 1,0.
- Overføre A. tumefaciens flydende kultur i 15 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 4.000 x g og 4 ° C i 15 min. Fjern supernatanten og suspendere pellet i 15 mL af transformation løsning at vaske pellet.
- Spin røret på 4.000 x g og 4 ° C i 15 min og supernatanten. Gentag trinnet vask igen.
- Resuspenderes i 5 mL af transformation løsning og holde i 2 timer ved stuetemperatur. Juster tætheden af A. tumefaciens pellet celler med transformation løsning, indtil den endelige koncentration af OD600 er 0,5, eller mix to stikprøver med ens volumen til test parrede protein interaktioner.
- Infiltrere suspenderede celler i de 4th til 7th blade med en 1 mL needleless sprøjte (figur 1B-C). Efter infiltration, dække planter straks med en sort plastik cover og placere bakken i mørke i 12 timer. Efter at dyrke planter som sædvanlig for 2 til 4 dage før afsløre LUC aktiviteter.
Bemærk: Vælge sunde blade af samme størrelse. Infiltration af fire forskellige zoner i ét blad er fint.
3. detektering Luciferase aktivitet (en dag)
Bemærk: Der er to måder at overvåge luciferase aktivitet. Den ene er baseret på imaging, og den anden er at måle kvantitativt luciferase aktivitet.
-
Imaging metode
- Frigøre en infiltreret blade og sætte hele indlægssedlen på MS-agar medium.
- Spray luciferin arbejder buffer blad adaxial overfladen med en 50 mL sprayflaske. Holde materialerne i mørke i 5 min. til at slukke klorofyl auto-fluorescens.
- Bruge en lav-lys afkølede CCD tænkelig apparater (afkøles til 30 ° C) for at tage billeder (figur 2). Lys-gemt eksponeringstiden er 50 ms, og luminescence afsløring tid er 1 min.
Bemærk: Justere parametrene ifølge manualen maskine. Lavere temperaturer vil forbedre signal-støj-forholdet for at forbedre billedkvaliteten.
- Alternativt kan du måle luminescence direkte med en kommerciel luminometrisk.
- Forsigtigt skære blad fragmenter (ca. 0,25 cm2) fra området infiltration af N. benthamiana blade og fordybe blad disk i 100 µL med deioniseret vand i en 96-brønd hvid plade (figur 3).
- Tilsæt 10 µL af luciferin arbejde buffer og henstår i 5 min. Derefter udføre specifikke behandlinger til at undersøge protein interaktion dynamik.
Bemærk: Opdage luminescence med en luminometrisk på forskellige tidspunkter at opnå luciferase aktivitet dynamics, som repræsenterer kinetik af protein-protein interaktioner under visse behandling. Denne metode har fordele for at teste et stort antal protein par samtidigt. For dem uden en kommerciel luminometrisk, undersøge luciferase protein mængder af vestlige skamplet, derfor henvise til LUC aktivitet kvantitativt. Hvis lys ikke er nødvendigvis påkrævet, bare holde pladen i luminometrisk og måle luminescence på forskellige tidspunkter. Ellers, flytte pladen i et vækst kammer under registrering af kløften. For at opnå statistisk signifikante resultater skal bruge mindst tre biologiske replikater. Selv om LUC aktiviteter fra forskellige infiltration zoner vil variere, er deres skiftende mønstre konsekvent efter normalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre hovedtrin kan fremhæves i denne luciferase komplementering protokol for at studere protein-protein interaktioner i vivo, herunder plantevækst, tobak infiltration og luciferase assay. Det mest afgørende skridt i denne protokol er infiltrerer flydende A. tumefaciens til N. benthamiana blade (figur 1).
Her er et eksempel på nytten af denne teknik, bekræfter jasmonate reduktion af COP1-SPA1 interaktioner. Amino-terminal og carboxyl-terminal halvdele af luciferase blev fusioneret med COP1 (COP1-NLuc) eller SPA1 (CLuc-SPA1), henholdsvis. COP1-SPA1 interaktioner resulterer i komplementering af funktionelle luciferase. Luciferase aktiviteten var afbildet af CCD kamera (figur 2), og den enzymatiske aktivitet kan opdages med en luminometrisk (figur 3). At udelukke, at luciferase, selv er påvirket af behandling, fuld længde luciferase (LUC) genet blev også forbigående udtrykt i N. benthamiana blade til at tjene som en kontrol. Luciferase aktiviteten før jasmonate behandling (tid 0) var placere nemlig 1, og derefter hver luciferase aktivitet værdien opnået under jasmonate behandling var normaliseret med tiden 0 for at få relative luciferase aktiviteten (figur 4). Resultaterne viste, at COP1-SPA1 interaktioner (afspejles af luciferase aktivitet) gradvist faldt i mørket, og at JA behandling yderligere reduceret deres interaktioner.
Figur 1 . Processen for N. benthamiana infiltration.
(A) Abaxial og adaxial visning af planter før infiltration. (B) repræsentative billede at vise infiltration protokol. (C) Abaxial og adaxial visning af planter efter infiltration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Imaging luciferase aktivitet under CCD-kamera.
(A) repræsentativt billede af en N. benthamiana blad under en normal lys felt. (B) afsløring luminescence signaler under CCD-kamera til at vise luciferase aktiviteter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative billede at vise hvordan man måler luminescence fra skære blad diske.
Infiltreret blad diske blev skåret og lagt i en 96-brønd hvid plade til at måle luminescence signaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentant resultater fra en forbigående luciferase komplementering assay.
(A) behandlingen varighed (tid) og de oprindelige resultater af luminescence værdi (LUC aktivitet) blev opført. Der er tre uafhængige flergangsbestemmelser for hver prøve. For at forberede dette diagram, var LUC aktivitet på forskelligt tidspunkt punkter normaliseret med tiden 0 som den relative LUC aktivitet.
(B) kvantificering af relative LUC aktiviteter, viser COP1-SPA1 interaktioner i mørket gradvist faldt, som kan reduceres ved yderligere JA behandling. Fejllinje angiver standardafvigelse (sd). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er simpel og reproducerbar til at studere i vivo protein-protein interaktioner og især egnet til påvisning af protein interaktion dynamics under eksogene behandling. Det vigtigste skridt i denne analyse er N. benthamiana infiltration. For at sikre infiltration succes, skal planter være meget sundt. En anden afgørende faktor er, når at tjekke luciferase aktivitet efter infiltration. Der er ingen korrekt svar på dette spørgsmål. Forskere opfordres til at overvåge luciferase aktivitet på forskellige dage efter infiltration at bedømme når luciferase udtrykkes på højeste niveau, fordi vi observeret udtryk Proteinniveau svingende med tid8.
Det er muligt, at ingen luminescence kan påvises i nogle eksperimenter. Falske negativer kunne ikke udelukkes uden passende kontrol. En fuld længde luciferase kontrol er forpligtet til at bevise infiltration og luciferase påvisning værker. Så hvis der er stadig ingen luminescence formodede protein interaktion parvis, skulle en immunblot opdage protein udtryk, i tilfælde af et eller to proteiner ikke er udtrykt. Den sidste mulighed er, at protein interaktioner kan hæmme luciferase komplementering af protein konformationelle årsager. Hvis dette sker, ved hjælp af afkortet protein eller skifter protein fusion med N-Luc eller C-Luc vil være nyttigt at løse dette problem.
Selv om protoplasts er også populære for forbigående udtryk, isolation af protoplasts og plasmid levering i protoplast celler har brug for særlig ekspertise og kræver skadelige CsCl2 for storstilet plasmid udvinding. Derudover er protoplast isolation, planter stærkt såret, hvilket kan påvirke PPI assays.
Der er ingen gylden standard assay. Til vores viden, kunne dette let udføres luciferase komplementering assay give nyttig protein interaktion kinetik oplysninger. Naturligvis, vil alternative tilgange til at undersøge protein interaktioner i vivo bekræfter disse resultater og forbedre forståelsen af biokemiske begivenheder i celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of Jiangsu provins (BK20140919), National Natural Science Foundation of China (31470375), den prioriterede Program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner og Qing Lan projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
