Summary
כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.
Abstract
אינטראקציות חלבון-חלבון הם מנגנוני היסוד ממסר אותות ב תהליכים תאיים ביותר; לכן, זיהוי של זוגות אינטראקציית חלבון הרומן וניטור dynamics אינטראקציית חלבון הן עניין מיוחד לחשוף כיצד צמחים מגיבים גורמים סביבתיים ו/או אותות התפתחותית. שפע של גישות פותחו כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, או בתוך חוץ גופית או ויוו. ביניהם, קומפלמנטציה לוציפראז הוקמה לאחרונה הדמיה (LCI) וזמינותו היא השיטה הפשוטה והמהירה על הפגנת ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון. ב הזה assay, חלבון א' או חלבון B הוא התמזגו עם החצי אמינו-מסוף או carboxyl-מסוף של לוציפראז, בהתאמה. כאשר חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, מחדש את שני החצאים של לוציפראז כדי ליצור אנזים לוציפראז פונקציונלי ופעיל. ניתן לרשום לוציפראז פעילות luminometer או של מצלמות-מצלמה. לעומת גישות אחרות, וזמינותו LCI מראה אינטראקציות חלבון-חלבון איכותית והן באופן כמותי. Agrobacterium חדירה טבק benthamiana העלים היא מערכת בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ארעית. עם השילוב של LCI וביטוי ארעי, גישות אלה מראים כי האינטראקציה הפיזי בין COP1 SPA1 צומצם בהדרגה לאחר הטיפול יסמונט.
Introduction
על מנת לתאם צמיחה עם סביבתו, הצמחים התפתחו אלגנטי איתות המסלולים לחוש, מגלי, ולהגיב רמזים איתות. כמו הרצים במירוץ שליחים, חלבונים הם שחקנים הכרחי צמח מעבר אותות. זה הוכרה נרחב אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) ממלא תפקיד חשוב לקשר סוללרי. זירחון חלבונים, acetylation, והשפלה תלויים כל מגע פיזי בין חלבון המטרה ואנזימים שינוי שלה. לדוגמה, חלבונים משפחה של חלבון (ג'אז) יסמונט צים-תחום אינטראקציה עם גורם שעתוק MYC2, לדכא את פעילות גנים ברמת השעתוק1,2. לאור החשיבות של PPI, חלבון בקנה מידה גדול interactomes בצמחים כבר בחנו לאחרונה3,4,5. תוצאות interactome אלו עוד יותר לחשוף את הרשת רגולטוריות מורכבות מרכזת תאיים מגוונות.
יש כמה גישות הוקמה עבור ניטור PPI. שמרים שני וזמינותו היברידית (Y2H) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי PPI. Y2H הוא קל לביצוע, מתאים בדיקה מהירה לבדוק אינטראקציות חלבון. Y2H הוא גם משמש לסינון שותפים אינטראקציה לא ידוע עבור ספציפיים החלבון-של-הריבית. עם זאת, מכיוון Y2H מתבצעת לחלוטין בשמרים, זה אינו יכול לשקף התרחיש האמיתי בצמח תאים, מביא תעריפים חיובי כוזב. האסטרטגיה דומה נוספת היא וזמינותו נפתחים. באופן כללי, שני חלבונים הם הביעו מטוהרים מתאי Escherichia coli ו מעורב ואז מתאושש לגילוי אינטראקציות חלבון. למרות ששיטה זו אינה אורכת זמן רב, באפשרותו לקבל ויוו תוצאות האינטראקציה גם. למטרות ויוו אינטראקציה, co-immunoprecipitation (co-IP) הוא וזמינותו הפופולרי ביותר, אשר דורש נוגדן באיכות גבוהה כדי immunoprecipitate החלבון-של-הריבית לא יכול לפסול את האפשרות של להדברה עקיף. יתר על כן, בשל ההליכים ניסויי הסבוכים ב- co-IP, התוצאות בדרך כלל משתנות עם מומחיות בודדים.
מבחני שיחזור כתב מבוסס במידה רבה מראש הזיהוי ויוו PPI. שיטות אלה כוללות פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6, זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC)7ו את גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay (LCI)8. אמנם אלה שלוש גישות יותר co-IP כדי לשקף את ישירה ויוו PPI, סריג, BiFC צריך מיקרוסקופ ספציפי כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית אותות, בקלות לא יכול לכמת את עוצמת האינטראקציה. לעומת זאת, LCI מנצל גחלילית לוציפראז, אשר יווצר מצב לאחר מגיבים luciferin המצע שלה. חשוב יותר, עוצמת PPI יכול להיקבע מהערך של לוציפראז פעילות. לפיכך, LCI מציין לא רק אם שני חלבונים אינטראקציה או לא, אך מספק מידע על הדינמיקות אינטראקציה בעת הטיפול. אמנם יש כמה שיטות הוקמה עבור ניטור אינטראקציה דינמיקה (מבוסס על משטח פלזמון תהודה או תרמו-יציבות משמרות)9,10, גישות אלה דורשות כלים עדינים או תיוג ספציפית. לעומת זאת, LCI קל לבצע ולגלות.
העיקרון של LCI זה החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז (בשם N-לוק או C-לוק, בהתאמה) היו התמזגו עם חלבון A ו- B, אלה היתוך שני חלבונים היו בו זמנית לידי תאי צמחים. אם חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, להיות מחדש את שני החצאים של לוציפראז להיות אנזים לוציפראז פעיל. לוציפראז פעילות יכול להתגלות עם luminometer או מצלמת CCD. זה לא הכרחי כדי לקבל transformants יציב LCI; הביטוי ארעי מספיקה כדי להשיג תוצאה אינטראקציה באיכות גבוהה.
סוג הטבעת E3 אוביקוויטין ליגאז קונסטיטוטיביות photomorphogenic 1 (COP1) אינטראקציה עם מספר עצום של גורמי שעתוק ומקדם שפלותם דרך ה 26 פרוטאוזום11. כמה גורמי שעתוק, ממוקדות COP1 אלה הם חיוביים לשסתומי פוטומורפוגנזה. באפלה, COP1 מקיים אינטראקציה עם משתיק קול של פיטוכרום A-105 1 (SPA1), אשר מגביר פעילות COP1 E38. לאחר תפיסת האור, photoreceptors ביטל את האינטראקציה COP1-SPA1 לעכב פעילות COP1 ו אז תייצב COP1 סובסטרטים12,13,14. דוגמה זו ממחישה את משמעות ביולוגית לומד PPI וקביעת PPI dynamics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הצמחים (8 שבועות)
- הכניסו זרעי benthamiana טבק 50 1.5 mL microcentrifuge שפופרת אחת המכילה 1 מ"ל של 5% NaClO ו- 0.1% טריטון X-100 (וי/V) פתרון ולהשאיר למשך 5 דקות לחטא את הזרעים.
- לשטוף את הזרעים במים סטריליים 5 פעמים, להשעות את הזרעים ב 200 µL של מים סטריליים.
- בזהירות המקום בודדים זרעים על גבי המשטח של MS-אגר בינוני (1 l: 1 x מלחי Murashige & Skoog, 10 גרם סוכרוז, pH 5.8 (KOH), 1% אגר) עם טיפים בסדר, חנות צלחות בינוני ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לסנכרן את הנביטה.
הערה: כדי למנוע זיהום חיידק, יש לבצע פעולה זו על ספסל נקי. אין צורך לנער את הצינור במהלך עיקור. - מניחים צלחות בינוניות בתנאים הצמיחה רגילה (22 ° C, 80-90-2µmolm s-1 לבן עוצמת האור) למשך 10 ימים, ולאחר מכן להעביר את השתילים מונבטים לתוך הקרקע.
הערה: הקפד להוסיף שורשים שתיל באדמה, לא לעשות נזק שורשי. מכסים את המגש עם שקוף פלסטיק מכסה למשך הלילה כדי לשמור על לחות. - לגדל צמחים בחדר גדילה מבוקרת על 16 h/8 h/כהה מחזור ו- 70% לחות. בת שבוע 7 צמחים benthamiana ש מוכנים Agrobacteriumtumefaciens חדירה (איור 1א').
הערה: מים צמחים ושליטה מזיקים לפי הצורך כדי לשמור על הצמחים בריא.
2. ארעי ביטוי עלים (ש ע) Benthamiana (7-10 ימים)
- לספק 150 ng של פלסמידים (pEGAD-HA-לוק פקד פלסמיד וקטור ריק, פלסמיד נבנה עבור LCI assay, במקרה זה השתמשנו pCAMBIA1300-Nluc ו- pCAMBIA1300-Cluc לבנייה פלסמיד) לתא המוסמך tumefaciens א זן GV3101 עם שיטת אלקטרופורציה סטנדרטי.
- תרבות tumefaciens א -לוריא-Bertani (LB) אגר בינוני (1 l: 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 גרם, 10 גרם טריפטון, 1.5% אגר) המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין ב 28 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.
הערה: הבחירה של אנטיביוטיקה תלוי וקטור ואת המתח tumefaciens א בשימוש. - לחסן אחד יחיד tumefaciens א המושבה של כל צלחת לתוך 3 מ ל LB בינוני נוזלי המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- 50 µg/mL של ריפאמפיצין וללחוץ על סל ד 220-28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה להפיץ תרבית תאים.
- העברת µL 75 של התרבות חיידקי לתוך 15 מ"ל טריים LB נוזלי בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 50 של ריפאמפיצין, לדלל אותה לפי פקטור של 200. התרבות החיידק ב 220 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך כ- 8 שעות, עד OD600 בין 0.5 ל 1.0.
- העברת התרבות נוזלי א tumefaciens 15 mL צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה ב g 4,000 x ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של טרנספורמציה פתרון לרחוץ גלולה.
- לסובב את הצינור ב 4,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם נוספת.
- Resuspend בגדר ב 5 מ של טרנספורמציה פתרון ולשמור על 2 h בטמפרטורת החדר. התאם את הצפיפות של תאים tumefaciens א גלולה עם השינוי פתרון עד הריכוז הסופי של יתר600 הוא 0.5, או לערבב שני מדגמים עם נפח שווה עבור אינטראקציות חלבון לזווג הבדיקה.
- לחדור מושעה תאים לתוך 4th ל 7th עוזב עם מזרק needleless 1 מ"ל (איור 1בג). לאחר חדירה, לכסות את הצמחים מיד עם כיסוי פלסטיק שחור ומניחים את המגש באפלה במשך 12 שעות. לאחר מכן, לגדל צמחים כרגיל במשך 2-4 ימים לפני גילוי לוק פעילויות.
הערה: בחר עלים בריאים גודל דומה. החדירה של ארבעה אזורים שונים בתוך עלה אחד בסדר גמור
3. זיהוי פעילות לוציפראז (יום אחד)
הערה: יש שתי דרכים לעקוב אחר פעילות לוציפראז. אחד מבוסס על הדמיה, והשני הוא למדוד באופן כמותי לוציפראז פעילות.
-
שיטת הדמיה
- ניתוק של עלה הסתנן ולשים את התשמ"ו באמצעי MS-אגר.
- תרסיס luciferin מאגר עובדים על גבי המשטח adaxial עלה עם בקבוק ספריי 50-mL. להשאיר את החומרים באפלה במשך 5 דקות כדי להרוות את כלורופיל האוטומטי-ידי קרינה פלואורסצנטית.
- השתמש תאורה CCD מקורר הדמיה המנגנון (מקורר עד למינוס 30 מעלות) כדי ללכוד תמונות (איור 2). חשיפה הגיש אור השעה 50 מילישניות, זמן הארה זיהוי 1 דקות.
הערה: להתאים את הפרמטרים על פי המדריך המכונה. טמפרטורות נמוכות יותר יהיה לשפר את יחס אות לרעש לשיפור איכות התמונה.
- לחלופין, למדוד לומינסנציה ישירות עם luminometer מסחרי.
- בזהירות לגזור קטעים עלה (כ 0.25 ס מ2) מהאזור הסתננות של העלים (ש ע) benthamiana , לטבול את הדיסק עלה לתוך µL 100 יונים מים בצלחת לבנה 96-ובכן (איור 3).
- להוסיף 10 µL luciferin עבודה מאגר ולהשאיר למשך 5 דקות. לאחר מכן לבצע טיפולים ספציפיים כדי ללמוד את הדינמיקה אינטראקציית חלבון.
הערה: לזהות את הפריה חוץ גופית עם luminometer בנקודות זמן שונות כדי להשיג את הדינמיקה פעילות לוציפראז, אשר מייצגים את קינטיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון תחת טיפול מסוים. בשיטה זו יש יתרונות לבדיקת מספר רב של זוגות חלבון בו זמנית. אלה שאינם luminometer מסחרי לבחון את abundances חלבון לוציפראז על ידי תספיג, ולכן מתייחסים quantitively פעילות לוק. אם האור אינו נדרש בהכרח, רק לשמור את הצלחת luminometer ומדידת לומינסנציה בנקודות זמן שונות. אחרת, להעביר את הצלחת לתוך תא הצמיחה במהלך הפער זיהוי. כדי להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, השתמש משכפל ביולוגית לפחות שלושה. אף לוק פעילויות מאזורי חדירה שונים משתנים, דפוסי שינוי שלהם הם עקביים לאחר נורמליזציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה שלבים עיקריים יכול עכישו ב פרוטוקול קומפלמנטציה זה לוציפראז ללמוד חלבון אינטראקציות בויוו, כולל צימוח, טבק חדירה ואת וזמינותו לוציפראז. הצעד המכריע ביותר פרוטוקול זה הוא חדירה נוזלי tumefaciens א לתוך עלים (ש ע) benthamiana (איור 1).
הנה דוגמה של התועלת של טכניקה זו המאשרת יסמונט הפחתת אינטראקציות COP1-SPA1. החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז היו התמזגו עם COP1 (COP1-NLuc) או SPA1 (CLuc-SPA1), בהתאמה. COP1-SPA1 אינטראקציות להניב קומפלמנטציה של לוציפראז פונקציונלי. הפעילות לוציפראז צולמה על ידי מצלמת CCD (איור 2), ניתן להבחין הפעילות האנזימטית מתרחשת עם luminometer (איור 3). כדי לא לכלול האפשרות הזו לוציפראז עצמו מושפע על ידי טיפול, הגן באורך מלא לוציפראז (לוק) היה גם transiently מבוטא benthamiana (ש ע) העלים לשמש פקד. הפעילות לוציפראז לפני הטיפול יסמונט (זמן 0) הוגדר כ- 1 ולאחר מכן כל ערך פעילות לוציפראז שהושגו תחת טיפול יסמונט היה מנורמל עם הזמן 0 כדי לקבל את הפעילות היחסית לוציפראז (איור 4). התוצאות הראו כי COP1-SPA1 אינטראקציות (לידי לוציפראז פעילות) בהדרגה ירדה חשיכה, יחס טוב יה נוסף מופחת האינטראקציות שלהם.
איור 1 . תהליך חדירה benthamiana ש .
(א) Abaxial, נוף adaxial של צמחים לפני החדירה. (B) נציג תמונה כדי להציג את הפרוטוקול הסתננות. (ג) Abaxial, נוף adaxial של צמחים לאחר חדירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הדמיה לוציפראז פעילות תחת מצלמות-מצלמה.
(א) תמונה ייצוגית של עלה אחד benthamiana ש תחת שדה אור רגיל. (B) Detecting אותות הפריה חוץ גופית תחת מצלמות-מצלמה כדי להציג פעילויות לוציפראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. נציג תמונה להראות כיצד למדוד הארה מן לחתוך עלה דיסקים.
עלה הסתנן דיסקים היו חותכים ולשים לתוך צלחת לבנה 96-ובכן למדידת אותות הפריה חוץ גופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . נציג נובעת לוציפראז ארעי אחד קומפלמנטציה וזמינותו.
(א) משך הטיפול (זמן) ואת התוצאות המקורי לערך לומינסנציה (לוק פעילות) נרשמו. ישנם שלושה משכפל עצמאי עבור כל דגימה. להכנת תרשים זה, לוק פעילות בנקודות זמן טיפול שונה היה מנורמל עם הזמן 0 כפעילות לוק היחסי.
(B) כימות של פעילויות לוק היחסי, מציג COP1-SPA1 אינטראקציות בחשכה בהדרגה ירדו, אשר יכול להיות מופחת על ידי טיפול JA נוסף. שורת שגיאה מציינת את סטיית התקן (sd). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ללמוד ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון, הדירים מתאים במיוחד לגילוי חלבון dynamics אינטראקציה תחת טיפול אקסוגני. הצעד מפתח זה וזמינותו היא חדירה benthamiana ש . כדי להבטיח הצלחה הסתננות, הצמחים להיות בריא מאוד. גורם קריטי נוסף הוא מתי לבדוק פעילות לוציפראז לאחר חדירה. יש תשובה נכונה לשאלה זו. חוקרים מוזמנים לעקוב אחר פעילות לוציפראז ימים שונים לאחר חדירה לשפוט כאשר לוציפראז מתבטא ברמה הגבוהה ביותר, כי ראינו את רמות ביטוי חלבון יציב עם הזמן8.
זה אפשרי כי אין הפריה חוץ גופית עשוי להתגלות כמה ניסויים. התשלילים שווא יכול לא ייכללו ללא הפקדים המתאימים. פקד לוציפראז באורך מלא נדרש להוכיח הסתננות לוציפראז זיהוי עבודות. אז אם יש עדיין אין הפריה חוץ גופית בזוגות אינטראקציית חלבון בשם, immunoblot יידרשו לזהות ביטוי חלבון, במקרה אחד או שניים חלבונים אינם מבוטאים בהצלחה. האפשרות האחרונה היא אינטראקציות חלבון עלול לעכב את קומפלמנטציה לוציפראז מסיבות הסתגלותי חלבון. במקרה כזה, באמצעות נחתך החלבון או החלפה של חלבון פיוז'ן עם N-לוק או C-לוק יהיה שימושי לפתור בעיה זו.
למרות protoplasts הם גם פופולרי ארעית ביטוי, הבידוד של protoplasts ומסירת פלסמיד לתאים פרוטופלאסט צריך התמחות ספציפית ודורש CsCl מזיקים2 לחילוץ פלסמיד בקנה מידה גדול. בנוסף, במהלך פרוטופלאסט בידוד, צמחים בכבדות פצועים, אשר עשוי להשפיע על מבחני PPI.
יש אין assay תקן הזהב. לידע שלנו, זו assay קומפלמנטציה לוציפראז שבוצעו בקלות יכול לספק מידע קינטיקה אינטראקציית חלבון שימושי. כמובן, גישות אלטרנטיביות ללימוד חלבון אינטראקציות ויוו לאשר את התוצאות הללו, לשפר את ההבנה של אירועים הביוכימי בתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140919) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31470375), עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג'יאנגסו מוסדות להשכלה גבוהה, צ'ינג Lan הפרוייקט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
