Inducerande Cre-lox rekombination i mus hjärnbarken genom In Utero elektroporation
Summary
Cell-autonoma funktioner av gener i hjärnan kan studeras genom att inducera förlust eller vinst på funktion i glesa populationer av celler. Här beskriver vi i livmodern elektroporation för att leverera Cre recombinase i glesa populationer av utveckla kortikala nervceller med floxed gener att orsaka förlust av funktion i vivo.
Abstract
Cell-autonoma neuronala funktioner av gener kan avslöjas genom orsakar förlust eller vinst på funktionen av en gen i en liten och gles befolkning av nervceller. För att göra detta kräver genererar en mosaik där nervceller med förlust eller vinst av funktionen av en gen omges av genetiskt oberörd vävnad. Här kombinerar vi Cre-lox rekombination systemet med Utero elektroporation för att generera mosaik hjärnvävnaden som kan användas för att studera cell-autonom funktion av gener i nervceller. DNA-konstruktioner (tillgängligt via databaser), som kodar för en fluorescerande etikett och Cre recombinase, införs i utveckla kortikala nervceller som innehåller gener flankerad med loxP platser i hjärnan hos musembryon som använder i utero elektroporation. Dessutom beskriver vi olika anpassningar till metoden i livmodern elektroporation som ökar överlevnadsförmågan och reproducerbarhet. Metoden innebär också att upprätta en titer för Cre-medierad rekombination i en gles eller tät population av nervceller. Histologiska preparat av märkt hjärnvävnaden inte kräver (men kan anpassas till) immunohistokemi. Konstruktioner används garanterar att fluorescently märkt nervceller bära genen för Cre recombinase. Histologiska preparat kan Morfologisk analys av nervceller genom confocal avbildning av dendritiska och axonal arbors och Dendritutskotten. Eftersom förlust eller vinst av funktion uppnås i glesa mosaik vävnad, tillåter denna metod studien av cell-autonoma nödvändighet och tillräckliga gen produkter i vivo.
Introduction
Generera en genetisk mosaik är en klassisk experimentella paradigm för att förstå funktionen av en gen av intresse. För att avgöra om en gen är nödvändigt för en cellulär fenotyp, orsakar det enklaste tillvägagångssättet en förlust av funktion av genen i hela organismen (t.ex. knockout). Men för att avgöra om en gen krävs specifikt i en viss celltyp, är knockout av genen i hela organismen inte en giltig metod. I stället krävs en metod som kommer att orsaka förlust av funktion av en gen i en viss cell medan det är omgivet av vildtyp (dvs genetiskt oberörd) vävnad — med andra ord, skapa mosaik vävnad. Om den muterade cellen visar en mutant fenotyp, men omgivande vildtyp celler inte, gen funktionerna i en cell-självständigt sätt. Analys av mosaik vävnad, som muterade celler omges av vildtyp vävnad, är idealisk för att förstå cell-autonoma funktioner av gener, särskilt i hjärnan där nervceller och glia bildar ett sammanhängande nätverk av vävnad.
Flera former av mosaik hjärnvävnad har gett kraftfulla modeller för att undersöka cell-autonoma funktioner av gener. Studier inriktade på neuronal transplantation1, kvinnliga X-länkade mosaicism2,3,4, och endogena somatisk mosaicism5,6 har dragit sina slutsatser baserat på mosaik hjärnvävnaden. Villkorliga radering av en gen via systemets Cre-lox rekombination är en metod som utnyttjar stora tillgången på transgena möss linjer. Den här metoden introduceras två loxP platser på vardera sidan av en krävs sekvens av en gen (till exempel en exon), lämnar den flankerad av loxP platser att både möta i samma riktning (”floxed”). CRE recombinase punktskatter sekvensen mellan loxP platser7. CRE-medierad rekombination kan uppnås genom korsning floxed möss till en annan mus linje uttrycker Cre recombinase tillsammans med en fluorescerande markör i en delmängd av celler (”Cre reporter line”). Detta har visats i en mängd olika sätt att avslöja en gen hos grupper av celler, till exempel excitatoriska nervceller eller astrocyter8funktioner. CRE reporter linjer kan uttrycka CreERT2 för att tillåta Cre-medierad rekombination vara drog-inducerbara (singel-neuron märkning med inducerbara Cre-medierad knockout eller SLICK)9. I en annan strategi kallas mosaik analys med dubbel markörer (MADM)10,11, tillåter Cre-medierad interchromosomal rekombination en homozygot muterad skapas tillsammans med heterozygot vävnad. I dessa synsätt behöver en ny linje av möss produceras varje gång för varje kandidat gene eller cellulära subtyp som testas. Alternativt, Cre recombinase kan införas efter födseln via Jontofores12 eller virala vektorer (t.ex. adeno-associerade virus13 eller lentiviruses14 transporterar cellulära subtyp-specifika initiativtagare). Denna strategi skapar starka och postnatal märkning. För att rikta utveckla hjärnans kortikala nervceller glest och prenatalt, är en idealisk strategi i livmodern elektroporation av Cre recombinase med en fluorescerande markör.
Förutom att kombinera Cre-lox rekombination genom Utero elektroporation att producera mosaik vävnad i vivo, vi introducera flera anpassningar till förfaranden från andra publicerade protokoll15,16, 17,18,19,20,21. Vi tillhandahåller information för att förbättra framgång i avel timed-dräktiga honor. Vi beskriver också våra två strategier för att införa glesa och ljusa märkning av nervceller i kortikal vävnad: en strategi är att titrera nivåerna av en enda konstruktion som kodar för Cre recombinase och en fluorescerande markör22. En annan strategi är att använda ”Supernova” system, designad speciellt med dessa parametrar i åtanke23,24. Dessutom erbjuder vi förbättringar på producerar konsekvent Mikroskop pipetter och förenklingar till Utero elektroporation kirurgi. Slutligen beskriver vi kritiska stegen i en förenklad histologiska preparat som tillåter analys av Dendritutskotten och dendritiska och axonal arbors, utan ytterligare färgning eller immunohistokemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar vi kombinationen av Utero elektroporation med Cre recombinase i floxed möss att generera mosaik hjärnvävnad. En fördel med detta tillvägagångssätt är att en ny mus rad inte behöver genereras varje gång en annan cellulär undertyp ska riktas: Utero elektroporation kan användas för att rikta excitatoriska nervceller, hämmande nervceller eller glia beroende på tid och plats för elektroporation15,16,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar generöst stöd av James Madison University Institutionen för biologi och James Madison University ljus Microscopy och Imaging anläggning. Dr. Mark L. Gabriele för hjälpsamma råd angående unga postnatal vävnad förberedelse, och Drs. Justin W. Brown och Corey L. Cleland för generösa samordning av kirurgiska material och utrymme. Denna forskning finansierades delvis av en kollaborativ forskningsbidrag av 4-VA, ett samarbete för att främja det Commonwealth av Virginia (G.S.V.), och av Virginia akademin av vetenskap små projekt forskningsbidrag (G.S.V.). Har varit generöst stöd av en Betty Jo kärleksfull Butler ‘ 58 Endowment för grundutbildning forskning Scholarship (till K.M.B.), en Farrell sommaren forskning Scholarship (till K.M.B.), James Madison University andra talet stipendium (till K.M.B.), en James Madison University Centennial stipendium (till C.J.H.), James Madison University Lucy Robinson Sök ‘ 30 Memorial stipendium (till Z.L.H.) och en James Madison University College vetenskap och matematik fakultet stöd Grant (till G.S.V.).
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
References
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
- McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
- Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
- Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
- De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
- Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
- Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
- Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
- Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
- . . Plasmids 101: A Desktop Resource. , (2017).
- . . Pipette Cookbook. , (2015).
- Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
- Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
- Kim, J. -. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
