Celle-autonome funktioner af gener i hjernen kan studeres ved at inducere tab eller gevinst på funktion i spredte populationer af celler. Her beskriver vi i utero elektroporation for at levere Cre recombinase i sparsomme befolkninger for at udvikle kortikale neuroner med floxed gener til at forårsage tab af funktion in vivo.
Celle-selvstændig neuronal funktioner af gener kan blive afsløret ved at forårsage tab eller gevinst på funktionen af et gen i en lille og spredte befolkning af neuroner. For at gøre det kræver, at skabe en mosaik, hvor neuroner med tab eller gevinst på funktionen af et gen er omgivet af genetisk uforstyrrede væv. Her, kombinerer vi Cre-lox rekombination system med i utero elektroporation for at generere mosaik hjernevæv, der kan bruges til at studere funktionen celle-selvstændig af gener i neuroner. DNA konstruktioner (tilgængelig via repositories), der koder for en fluorescerende etiket og Cre recombinase, føres ind i udvikle kortikale neuroner indeholdende gener flankeret med loxP steder i hjernen hos mus embryoner ved hjælp af in utero elektroporation. Derudover beskriver vi forskellige tilpasninger i utero elektroporation metode at øger overlevelsesevne og reproducerbarhed. Denne metode indebærer også etablering af en titer for Cre-medieret rekombination i en sparsom eller tætte befolkning af neuroner. Histologiske præparater af mærket hjernevæv ikke kræver (men kan tilpasses) Immunhistokemi. Konstruktioner anvendes sikre, at fluorescently mærket neuroner bære genet for Cre recombinase. Histologiske præparater tillade morfologisk analyse af neuroner gennem Konfokal billeddannelse af dendritiske og cytoskeletale Dorne og dendritiske pigge. Fordi tab eller gevinst på funktion opnås i sparsomme mosaik væv, tillader denne metode undersøgelse af celle-selvstændig nødvendighed og tilstrækkeligheden af genet produkter i vivo.
Generere en genetiske mosaik er en klassisk eksperimentelle paradigme for at forstå funktionen af et gen af interesse. For at afgøre, om et gen er nødvendige for en cellulær fænotype, er den enkleste forårsager tab af funktion af genet i hele organismen (f.eks knockout). Men for at bestemme, hvis et gen der kræves specielt i en bestemt celletype, knockout af genet i hele organismen er ikke en gyldig tilgang. I stedet, en metode der kræves der vil forårsage tab af funktion af et gen i en given celle, mens det er omgivet af vildtype (dvs. genetisk uforstyrrede) væv — med andre ord skabe mosaik væv. Hvis cellen mutant viser en mutant fænotype, men omkringliggende vildtype celler ikke genet funktioner i en celle-selvstændig måde. Analyse af mosaik væv, som muterede celler er omgivet af vildtype væv, er ideel for at forstå celle-autonome funktioner af gener, især i hjernen hvor neuroner og glia danner et stort sammenhængende netværk af væv.
Flere former for mosaik hjernevæv har givet effektive modeller for at undersøge celle-autonome funktioner af gener. Undersøgelser fokuseret på neuronal transplantation1, kvindelige X-linked mosaicisme2,3,4, og endogene somatiske mosaicisme5,6 har trukket deres konklusioner baseret på mosaik hjernevæv. Betinget sletning af et gen gennem Cre-lox rekombination system er en metode, der tager fuld fordel af den store tilgængelighed af Transgene mus linjer. I denne metode introduceres to loxP websteder på begge sider af en påkrævet sekvens af et gen (såsom en exon), forlader det flankeret af loxP steder at begge står over for i den samme retning (“floxed”). CRE recombinase punktafgifter sekvens mellem loxP websteder7. CRE-medieret rekombination kan opnås ved at krydse floxed mus til en anden mus linje at udtrykke Cre recombinase sammen med en fluorescerende markør i en delmængde af celler (“Cre reporter linje”). Det er blevet påvist i en række forskellige måder at afdække funktionerne af et gen i delmængder af celler, som excitatoriske neuroner eller astrocytter8. CRE reporter linjer kan udtrykke CreERT2 for at tillade Cre-medieret rekombination være stof-inducerbar (single-neuron mærkning med inducerbar Cre-medieret knockout, eller SLICK)9. I en anden strategi kaldet mosaik analyse med dobbelt markører (MADM)10,11, tillader Cre-medieret interchromosomal rekombination en homozygot mutant skal oprettes sammen med heterozygous væv. I disse tilgange skal en ny linje af mus fremstilles hver gang for hver kandidat gen eller cellulære undertype, der er testet. Alternativt, Cre recombinase kan indføres efter fødslen, gennem iontophoresis12 eller virale vektorer (fx adeno-associeret virus13 eller lentiviruses14 transporterer cellulære undertype-specifikke initiativtagere). Denne strategi skaber stærke og postnatal mærkning. For at målrette udvikler cerebral kortikale neuroner sparsomt og prænatalt, er en ideel strategi i utero elektroporation af Cre recombinase med en fluorescerende markør.
Ud over kombinerer Cre-lox rekombination gennem i utero elektroporation at producere mosaik væv i vivo, vi introducere flere tilpasninger til procedurer fra andre publicerede protokoller15,16, 17,18,19,20,21. Vi leverer oplysninger til at forbedre succes i avl timed-gravide kvinder. Vi også skitsere vores to strategier til at indføre sparsom og lyse mærkning af neuroner i kortikale væv: én strategi er at titrere niveauer af en enkelt konstruere kodning for Cre recombinase og en fluorescerende markør22. En anden strategi er at bruge “Supernova”-systemet, designet specifikt med disse parametre i betragtning23,24. Derudover tilbyder vi forbedringer på at producere konsekvent mikroinjektion pipetter og forenklinger til i utero elektroporation kirurgi. Endelig vil skitsere vi kritiske trin i et forenklet histologiske præparat, der giver mulighed for analyse af dendritiske pigge og dendritiske og cytoskeletale dorne, uden yderligere farvning eller Immunhistokemi.
Her introducerer vi kombinationen af i utero elektroporation med Cre recombinase i floxed mus til at generere mosaik hjernevæv. En fordel ved denne tilgang er, at en ny mus linje ikke behøver at blive genereret hver gang en forskellige cellulære subtype er målrettet: i utero elektroporation kan bruges til at målrette excitatoriske neuroner, hæmmende neuroner og glia afhængigt af tidspunktet og placering af elektroporation15,16,…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke generøs støtte fra James Madison University Institut for biologi og James Madison University Light mikroskopi og Imaging facilitet. Dr. Mark L. Gabriele for nyttige råd om unge postnatal væv forberedelse, og Drs. Justin W. Brown og Corey L. Cleland for generøse koordinering af kirurgisk materialer og rum. Denne forskning blev delvis finansieret af kollaborative forskning tilskud af 4-VA, en samarbejdsorienteret partnerskab for at fremme Commonwealth Virginia (G.S.V.), og af Virginia akademi for videnskab lille projekt forskning tilskud (G.S.V.). Støtte er blevet generøst leveret af en Betty Jo kærlig Butler ‘ 58 Endowment for Undergraduate Research Scholarship (til K.M.B.), en Farrell sommer forskning Scholarship (til K.M.B.), en James Madison University andet århundrede stipendium (til K.M.B.), en James Madison University Centennial stipendium (til C.J.H.), en søgning ‘ 30 James Madison University Lucy Robinson Mindelegat (til Z.L.H.) og en James Madison University College af videnskab og matematik fakultet støtte Grant (til G.S.V.).
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |