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Neuroscience

宫内电穿孔诱导小鼠大脑皮质中氧合酶的重组

doi: 10.3791/56675 Published: November 17, 2017
* These authors contributed equally

Summary

在稀疏的细胞群中, 可以通过诱导功能的丧失或增益来研究脑内基因的细胞自主功能。在这里, 我们描述在子宫内电穿孔, 以提供重组到稀疏的人群发育皮层神经元与 floxed 基因, 导致功能丧失在体内

Abstract

基因的细胞自主神经元功能可以通过在小的和稀疏的神经元中造成基因功能的丧失或增益而显露出来。要做到这一点, 就需要生成一个镶嵌体, 其中基因的功能丧失或增益的神经元被不受基因扰动的组织包围。在这里, 我们结合了综合考试-液氧复合系统与在宫内电穿孔, 以产生马赛克脑组织, 可用于研究细胞自主功能的基因在神经元。DNA 结构 (可通过存储库提供), 编码的荧光标签和重组, 被引入到开发的皮层神经元含有基因的 loxP 部位的大脑中的小鼠胚胎使用在子宫穿孔.此外, 我们描述了各种适应的子宫内电穿孔方法, 提高生存能力和再现性。该方法还包括建立一个在稀疏或稠密的神经元中的重组的效价。标记脑组织的组织学准备不需要 (但可以适应) 免疫组化。该结构的使用保证了荧光标记神经元携带的基因重组。组织学准备可以通过对树突和轴突和树突棘的共聚焦成像对神经元进行形态学分析。由于稀疏镶嵌组织中功能的丧失或增益达到了目的, 因此, 该方法允许研究基因产品的细胞自主性和足够度在体内

Introduction

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生成一个遗传马赛克是一个经典的实验范式, 以了解的功能基因的兴趣。为了确定基因是否是细胞表型的必要条件, 最简单的方法是在整个生物体中导致基因功能的丧失 (例如击倒)。然而, 要确定某一基因是否需要特定的细胞类型, 基因在整个生物体中的击倒并不是一种有效的方法。相反, 一个方法是需要的, 这将导致在一个给定的细胞中的基因功能丧失, 而它是由野生 (不受基因干扰) tissue-in 换句话说, 创造马赛克组织。如果突变细胞显示出突变的表型, 但周围的野生细胞没有, 该基因功能的细胞自主的方式。分析的马赛克组织, 其中突变细胞周围的野生组织, 是理想的理解细胞自主功能的基因, 特别是在大脑中的神经元和神经胶质形成一个巨大的互联网络的组织。

多种形式的马赛克脑组织为研究基因的细胞自主功能提供了强有力的模型。研究的重点是神经元移植1, 女性 X 链接嵌2,3,4, 以及内生体细胞嵌5,6根据马赛克得出了他们的结论脑组织。有条件地删除基因通过 "氧合酶复合系统" 是一种充分利用转基因小鼠品系的方法。在这个方法中, 两个 loxP 站点被引入到一个必需的基因序列的两侧 (如外显子), 它的两侧是 loxP 的站点, 它们都朝同一方向 ("floxed")。重组将 loxP 站点之间的顺序7。通过将 floxed 小鼠转到另一条表达重组的老鼠线上, 并在细胞子集 ("记者行") 中使用荧光标记, 可以实现对重组的再组合。这已被证明在各种方法, 以揭示的功能, 一个基因的细胞子集, 如兴奋性神经元或胶质细胞8。记者线可以表达 CreER 的T2 , 以允许由药物诱导的重组 (神经元标记与诱导的综合治疗的淘汰赛, 或光滑)9。在另一种称为 "镶嵌分析双标记 (决策)"10,11的策略中, interchromosomal 重组允许与杂组织一起创建一个纯合突变体。在这些方法中, 每个候选基因或细胞亚型都需要在每次测试时产生一条新的小鼠。另外, 通过导入12或通过病毒载体 (例如腺相关病毒13或慢14携带特定于细胞的子类型, 可以引入后天重组。发起人)。这一策略产生强烈的产后标记。为靶向发育的脑皮质神经元稀少和产前, 一个理想的策略是宫内电穿孔重组与荧光标记。

除了通过在子宫内电穿孔, 通过在体内生成马赛克组织, 我们还对其他已发布的协议1516中的过程进行了一些改编. 17,18,19,20,21。我们提供信息, 以提高成功繁殖定时怀孕的女性。我们还概述了在皮层组织中引入稀疏和明亮的神经元标记的两个策略: 一种策略是滴定重组的单个构造编码的级别和一个荧光标记22。另一种策略是使用 "超新星" 系统, 这些参数专门设计为23,24。此外, 我们提供了改进的生产一致的显微注射管和简化的在子宫内电穿孔手术。最后, 我们概述的关键步骤, 简化组织学准备, 允许分析树突棘和树突和轴突乔木, 没有进一步染色或免疫组化。

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Protocol

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这里描述的方法已经得到了詹姆斯麦迪逊大学动物护理和使用委员会 (ACUC) 的批准, 并符合所有相关的法规和机构准则。

1. 鼠标设置

  1. 房子一个年轻的 (> P60) 男性和女性合 floxed 小鼠一起建立一个饲养员对25
    注意: 一个好的负控制是建立一个额外的增殖对野生小鼠, 其中综合重组表达不会导致马赛克26
  2. 让雌鸟生下她的头, 并与雄性一起养育她的第一个垃圾。将雄性与雌性保持在一起, 以增加垃圾的存活率。断奶后的垃圾,例如在产后日 (P) 21, 分开的女性和男性。
  3. 小鼠繁殖
    1. 设置女性和男性25之间的定时交配。使用视觉提示来确定女性的发情周期27, 并检查阴道插头在交配后的早晨25
    2. 如果找到一个插头, 分开, 并称女性。数天作为胚胎天 (E) 0.5。
    3. 继续称女性每3-5 天, 以确定她是否怀孕。怀孕的女性将有10-20% 的体重增加7-10 天后受孕 (E0)。
      注意: 此步骤比目视检查25更早、更可靠地确认怀孕。
    4. 如果女性没有怀孕, 重复步骤 1.3. 1-1. 3.3。
  4. 一旦确认怀孕, 请选择在子宫内电穿孔的日期。靶层 II/III 皮层锥体神经元祖细胞, 在 E15.5 进行电穿孔。

2. DNA 设置

  1. 选择一个单一的 DNA 结构, 该编码重组以及荧光标记, 如绿色荧光蛋白 (GFP)28,29。或者, 使用 "超新星" 系统, 在以前的出版物中详细描述23,24。参见材料的名单例如构造。
  2. 使用标准微生物技术30从大肠杆菌的步骤2.1 中放大 DNA 结构。
  3. 按照制造商的指示, 用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化 DNA 结构。用无内毒素水洗结构。
    注: 在标准纯化试剂盒上选择无内毒素纯化试剂盒是至关重要的。
  4. 根据所需的标记密度26将 DNA 洗集中到1-3 毫克/毫升。
    注: 在使用新的 DNA 结构时, 必须建立一个效价, 因为它们有不同的长度和促进剂。考虑在几个不同的浓度和/或数额中注入一个结构来评估表达。例如, 注射1µL 或1.5 µL 的2.0 毫克/毫升 GFP。可以引起稀疏 (1 µL) 或致密 (1.5 µL) 标记层 II/III 视觉皮层锥体神经元26
  5. 在1x 磷酸缓冲盐水中加入0.4% 台台盼蓝 (PBS; 137 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10 毫米 Na2HPO4, 1.8 mm 在 H2O 中 4, 调整为 pH 2 与 HCl) 7.4 至浓缩 DNA 溶液。
  6. 在浓缩的 DNA 溶液中加入 10x PBS 1:10。
  7. 将浓缩的 DNA 溶液储存在4° c。解决方案可以无限期地存储。

3. 吸管设置

  1. 使用玻璃毛细管拉拔器, 拉动一个非常长的 (10-15 毫米) 锥度和非常细尖端的吸管, 典型的管胚胎干细胞注射或核转移31
    注意: 为防止碎片污染管, 应在手术后2天内进行。
    1. 按照制造商的指示, 通过执行斜坡测试来校准玻璃毛细管拉拔器。使用所产生的热值来编程使用以下参数的牵引协议: 热 = (斜坡试验值 + 15), 拉 = 30, 威尔 = 120, 时间 = 100, 压力 = 200。插入玻璃毛细管, 紧固在拉拔器上, 并激活程序化的牵引协议, 在玻璃毛细管上产生锥度。
    2. 使用复合光显微镜 (例如10X 目标)31, 确保锥度长度介于 10-15 mm 之间。
  2. 打破吸管, 形成一个粗略的尖端到20-25 µm 直径。
    1. 中心一个单任务擦拭 (见材料清单) 超过50毫升烧杯和舒展擦拭拉紧用一只手。另一方面, 按住并将吸管 (锥形侧向下) 垂直和完全通过擦拭的中心, 在锥形31中造成干净的断裂。
      注: 将吸管完全通过擦拭将产生20-25 µm 直径约70% 的时间。
    2. 在复合光显微镜下确认 (例如20x 目标)。
      注意: 打破玻璃时要用眼睛保护。
  3. 通过在 1x PBS 中将0.4% 台台台蓝的1µL 吸进一个部分填充的 piptte, 然后在吸管中以1µL 的高度进行1µL 标记, 使用一个细尖的耐酒精的标记来校准吸管。使用校准过的吸管在丢弃前管其他的。将管放在吸管保持器中, 不含灰尘和其他微粒。

4.在子宫内电穿孔

  1. 将 Graefe 钳、虹膜剪刀、哈特曼蚊香钳、无纺布纱布海绵、环尖钳和培养皿放在不锈钢托盘上, 用铝箔包好。在高压釜中放置托盘和1升0.9% 盐水 (0.9% 重量/卷氯化钠)。高压釜在121° c 和3.5 人民军40分钟, 从高压釜和消毒的手术区中取出。
    注意: 在手术中保持无菌状态是至关重要的。
  2. 将蒸压1升盐水瓶在小水浴中加热至38° c, 至少在手术前2小时。
  3. 将镊子型电极和脚踏板连接到发电机 (见材料清单)。按照制造商的说明, 设置发电机, 以提供五 50 ms 脉冲 50 V (与950毫秒间隔) 时, 由脚踏板触发。消毒镊子型电极, 并将其置于消毒手术区。
  4. 做一个麻醉鼻锥像以前公布的32, 但使用一个腈或乳胶手套手指的一端形成一个膜片, 适合安全地在鼻子锥开口。在膜片上切一个大的洞, 以适应老鼠的鼻子。
  5. 深麻醉怀孕小鼠在 E15.5 的诱导室充满异氟醚 (2-4%) 在纯氧流动1升/分钟。1分钟后, 测试扶正反射 (轻轻地倾斜感应腔, 确保鼠标不正确)。称量小鼠以确定手术后的镇痛剂量。
  6. 将鼠标转移到手术区, 并在纯氧中通过鼻锥将吸入的异氟醚 (1-2%) 输送到1升/分钟, 以维持手术平面上的小鼠。使用镊子测试踏板反射 (轻轻捏爪, 确保鼠标不返回反射) 来验证麻醉。监测呼吸率和努力, 寻找深, 定期呼吸 (〜70-100 呼吸/分钟), 粘膜是粉红色的颜色和湿润。
  7. 在手术过程中, 将足够的兽医眼膏涂抹在眼睛上, 以完全遮盖, 防止干燥。
  8. 用饱和盐溶液填充的密封袋的金属活化剂盘 (见材料清单), 活化盐的放热结晶。放置2单任务湿巾在袋顶部, 并把鼠标放在邮袋, 以保持体温。
  9. 按摩脱毛奶油到腹部区域与棉签, 直到腹部毛皮溶化 (大约 20-40 s), 然后抹掉腹部毛皮。用70% 的乙醇和棉签仔细清洁残留的残余物和脱毛奶油。在腹部部位放置一个内皮无菌的外科悬垂。
  10. 采用无菌技术, 用 Graefe 钳将皮肤从腹部向上拉出, 用虹膜剪刀在皮肤上做一个2厘米的腹中线切口, 以确保底层肌肉不被割断。
    注: 用 Graefe 钳和虹膜剪刀做切口的一个可接受的替代方法是使用手术刀, 如以前发布的17
  11. 发现式阿尔巴, 以可视化的中线腹直肌。用 Graefe 钳将肌肉向上和远离腹部, 用虹膜剪刀使另一条2厘米中线切口, 露出腹腔 (子宫是半透明的, 胚胎将在下方可见)。确保下层子宫和肠道组织不被切断。使切口足够大 (典型地 ~ 2 cm) 拔出并且舒适地显露子宫。
    注: 用 Graefe 钳和虹膜剪刀做切口的一个可接受的替代方法是使用手术刀, 如以前发布的17
  12. 使用无菌10µL 微提示, 免除卡洛芬 (溶于无菌0.9% 盐水) 在4毫克/千克到腹腔内镇痛。
  13. 在腹直肌切口左边缘夹住一只哈特曼蚊虫钳。将培养皿上的镊子放在切口左侧, 保持切口左侧的开口。夹在腹直肌切口右侧的另一只哈特曼蚊子钳, 并将镊子放在切口右侧的翻转培养皿上, 保持切口右侧开着。将纱布海绵放在切口区域周围。
  14. 使用环形钳 (没有附加的限制螺钉), 在任何两个相邻的胚胎之间的子宫上拉, 不挤压或损伤任何组织。开始通过切口取出所有的胚胎, 把它们放在纱布海绵上面。当从腹腔取出最后的胚胎时, 一定不要拉扯卵巢或子宫颈。一旦暴露, 这是至关重要的保持子宫湿润的温盐水。子宫通常包含5至8胚胎。
    注: 有可能添加青霉素和链霉素到生理盐水17
  15. 将校准的吸管连接到器管组件 (见材料清单), 并将步骤2中准备的 DNA 溶液的1µL 注入到每个胚胎的侧脑室中。侧脑室出现作为两个补丁的背部端的胚胎 (补丁比周围的组织端)。使用拇指和食指在注射和电穿孔操作的胚胎, 揭示了侧脑室, 并允许胚胎被轻轻地推对子宫壁在注入期间。通过观察台盼蓝填充侧脑室, 确认成功注射。
  16. 将镊子型电极的阴极 (见材料清单) 放在子宫上, 直接在内侧和尾皮层以视觉皮层为靶 (靶区的大脑需要不同的电极位置)16, 26。将阳极放在子宫上, 就在胚胎头部的前部。
  17. 确认阳极和阴极在适当的位置接触到胚胎周围的子宫。用脚踏板, 在电极上触发五 50 ms 脉冲的 50 V (950 毫秒间隔) 的传递。
    注: 注射后, 带负电荷的 DNA 将向阴极移动, 并将被纳入最接近阴极的心室区细胞。
  18. 以同样的方向将子宫返回腹腔。使用生理盐水来润滑子宫, 同时引导它手动和极端温和, 注意不要取代胚胎从他们的位置在子宫。
  19. 用可吸收的缝合线 (参见材料清单) 关闭腹部肌肉用一个简单的中断的缝合, 用外科医生的结栓末端。不要夹紧两端太近结或结将成为解开。
    注意: 缝合腹部肌肉是至关重要的, 这样伤口的边缘完全闭合, 但不会引起肌肉的热烫。结应该是紧的, 所以他们不能解开。
  20. 关闭皮肤层与可吸收缝合 (简单中断缝合, 外科医生的结, 如在步骤 4.19)。用少量的组织粘合剂封住伤口。将组织粘合剂涂抹在结节上以防止松开。使用微去除周围的伤口, 可以由微吸气的组织粘合剂。
  21. 将异氟烷水平降低至 0.5-1.5%。一旦组织粘合剂是干的 (通过接触手套测试胶粘剂), 从异氟醚中取出, 让女性独自在一个温暖的笼子里恢复。使用1毫升注射器与 26G, ½ "针管理丁丙诺啡腹腔在0.03 毫克/千克。
  22. 继续监视鼠标, 直到鼠标完全恢复并正常运行 (梳理、探索笼子、进食或饮用)。一旦康复, 就把雌鸟放回笼子里。
    注意: 如果遵循所有步骤, 鼠标通常会在2分钟内恢复知觉, 并立即开始移动笼, 显示没有任何不适的迹象。
  23. 如果鼠标出现不适的迹象 (驼背的姿势, 卟啉分泌物)33, 管理卡洛芬在0.1 毫克/毫升的供水。如果有几个不舒服的迹象存在, 或者如果不舒服持续超过4小时, 尽管卡洛芬管理, 立即安乐的老鼠通过管理腹腔内致死注射氯胺酮 (240 毫克/千克)-嗪 (48 毫克/千克)-乙酰 (1.85 毫克/千克) 鸡尾酒使用1毫升注射器与26克, ½ "针, 并遵循一个批准的第二形式的安乐死33
  24. 为了提高 electroporated 胚胎出生后的存活率, 将笼子保持在一个安静的房间里, 不受噪音和震动的束缚。用塑料圆顶、筑巢材料和诸如葵花籽等膳食补充物来丰富环境 (见材料清单)。不要移动或扰乱笼子, 特别是在分娩后的前3天。

5. 荧光显微镜的组织学准备

注意: 这个组织学协议的优化, 以准备从动物的组织, 比产后日 (P) 13, 是 electroporated在子宫。为了准备来自较年轻的产后动物 (P0-P13) 的组织, 建议遵循所有步骤 (包括 transcardial 灌注), 虽然大脑应该在准备切片之前植入琼脂 (步骤 5.9)。组织甚至可以在电穿孔后1-2 天内从胚胎中制备, 使用以前描述的方法18,20

  1. 准备甲醛 (粉煤灰) 解决方案。
    注意: 在实验的一天内准备新鲜的粉煤灰势在必行。
    注意: 甲醛是有毒的, 应该在通风柜里用适当的个人防护设备来处理。
    1. 使50毫升4% 的粉煤灰, 热40毫升水到60° c。加入2克粉煤灰时, 用玻璃棒或搅拌棒搅拌。每2分钟增加10µL 10 米氢氧化钠, 直到粉煤灰溶解。
    2. 加入5毫升的 10x PBS 和带来的解决方案的最后一卷50毫升水。
    3. 在50毫升的解决方案后, 根据需要调整 pH 值为 7.4, 10 M HCl. 让溶液冷却并贮存在4° c。
  2. 安乐鼠腹腔注射氯胺酮 (240 毫克/千克)-嗪 (48 毫克/千克)-乙酰 (1.85 毫克/千克) 鸡尾酒使用1毫升注射器与 26G, ½ "针。Transcardially 灌注10或20毫升 ice-cold 1x PBS, 后跟25或40毫升新鲜制造, ice-cold 4% 粉煤灰17。使用较低体积的幼仔 (P0-P13) 小鼠和更大的体积为年长的小鼠 (P14 和以上)。
  3. 立即灌注后, 斩首鼠胴体之间的枕骨和 C1 椎与大剪刀和剥离, 并丢弃大部分的皮肤周围的头骨使用虹膜剪刀, 特别是皮肤周围额, 顶叶, 和枕骨头.保持头骨和大脑完好
  4. 将头骨和大脑放在10毫升4% 的粉煤灰中, 在50毫升的锥形管中放置24小时, 在4° c 至 post-fix 组织。然后添加30毫升 1x PBS 到锥形管, 以稀释解决方案, 以1% 粉煤灰为存储在4° c。
    注: 为每个头骨和大脑使用一个单独的锥形管 post-fixed。不要在1% 粉煤灰中孵育超过2周的大脑, 否则荧光就会开始消退。
  5. 将大脑和头骨放在一个平坦的表面上, 单任务湿巾用 1x PBS 浸湿。使用一双镊子 (见材料清单) 来去除头骨周围的任何残留的皮肤或膜。
  6. 使用镊子, 首先取出枕骨, 然后小心地移除顶骨骨, 移动的镊子, 远离大脑的表面。小心地取出任何脑膜以防止损伤皮质。
  7. 将脑部下的镊子的背部楔入颅骨, 切断颅神经, 并取出大脑。
  8. 年轻的产后 (P0-P13) 脑
    1. 通过加热25毫升 1x PBS 到80° c, 使25毫升的4% 琼脂。用玻璃棒或搅拌棒搅拌和溶解1克琼脂)。
    2. 冷却溶液到35° c 同时继续搅拌。把大脑放在一个小容器里 (例如一个50毫升锥形管的盖子), 然后将琼脂溶液倒在脑部。让琼脂硬化。
  9. 用单边刀片通过大脑, 大约0.5 毫米侧到 bregma, 手工制作冠状切口。使另一冠状切口穿过大脑大约0.5 毫米的尾鳍到视觉皮层。在振动切片试样盘的中心放置一个与侧端相同直径的氰胶池。将大脑的侧端放在胶池的顶部, 确保整个侧表面的组织是绑定到标本盘与胶水。
  10. 安装缓冲托盘到振动切片和安全的内置夹杆。将刀片插入刀架, 并将刀架固定在带有内置夹紧螺钉的振动切片上。使用内置夹紧装置将带脑的标本盘固定在缓冲托盘上。设置速度设置为 5.70 (= 0.285 毫米/秒), 频率设置为 5.33 (53.3 Hz)。
  11. 用 1x pbs 在大脑的水平上方填充腔室, 然后将刀片式服务器降低到 pbs。开始服用100µm 冠状部分通过组织。
  12. 如果不需要进一步的处理, 如 4, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 核染色或免疫组织化学。
    1. 使用精美的倾斜画笔, 直接从振动切片到显微镜幻灯片, 每张幻灯片上安装4-6 节。
    2. 允许部分通过吸汗的解决方案与罚款的倾斜画笔, 使大脑切片不再漂移的幻灯片。
    3. 然后, 在幻灯片的每个部分放置一滴 mountant (参见材料列表)。
    4. 轻轻地放置一个 24 x 50 毫米片在上面, 确保 1) 没有气泡形成的部分, 2) 的部分不移动, 和 3) mountant 完全覆盖的区域之间的幻灯片和片。允许 mountant 治疗至少24-48 小时。
  13. 用 DAPI 染色核进行皮质层的组织学检查
    1. 使用精美的倾斜画笔将每个部分转换为包含10µg/毫升 DAPI (参见材料清单) 的解决方案, 从库存解决方案中稀释的 1x PBS (20 毫克/毫升 DAPI 水)。
    2. 在室温下孵育 DAPI 溶液5分钟, 然后用细尖的画笔将 DAPI 溶液中的部分转移至 1x pbs, 并在 1x pbs 中孵育5分钟室温。转移部分两次, 以新鲜 1x PBS 每5分钟。然后, 使用一个精美的倾斜的画笔, 将剖面转移到显微镜幻灯片上, 按照步骤 5.11.2-5.11.4, 然后继续步骤5.13。
  14. 在热板上加热一个含有 Valap (等量的凡士林, 羊毛脂和石蜡) 的玻璃培养皿, 直到完全融化。通过在熔化的 Valap 上刷牙来密封幻灯片的边缘。
  15. 要检查组织中的荧光, 请使用光学显微镜或共聚焦显微镜 (见材料列表) 和足够的过滤器集以查看荧光 (例如DAPI: 激发 325-375 nm, 发射 435-485 nm;GFP: 激发 450-490 nm, 发射 500-550 nm)17。共焦图像可以采取低-(4X, 数字光圈, na = 0.20), 中-(20X, na = 0.75), 和大功率 (60X, na = 1.40) 的目标。

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Representative Results

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单一结构的 GFP。electroporated 在 E15.5 和可视化的 P14。根据结构的浓度和注入量, 可以获得稀疏或稠密的结果22,26。例如, 注射1µL 2 毫克/毫升 GFP。考试结果在稀疏分布的标记细胞, 其中一些可以是明亮的 (图 1A), 并本地化第二层/III (图 1B)。由于组织是100µm 厚, 大多数树突乔木保存 (图 1C)。树突棘可观察高放大 (60X;图 1D)。注射1.5 µL 在同一浓度导致非常密集的标签 (图 2A) 在第二层/III (图 2B), 这可能是次优, 因为它是很难跟踪的来源突起和树突棘 (图 2C)。但是, 通过在标记区域的外围 (图 2D) 中选择一个明亮的单元格, 仍然可以对神经元 (图 2D) 及其进程 (图 2E) 进行图像处理。

最后, 可以最大限度地提高神经元的亮度, 同时保持标记细胞的稀疏分布。在这里, 超新星-GFP (见材料清单) 是 electroporated 在 E15.5 和可视化的 P23。请注意, 根据对不同出生年龄的脑组织的观察, 在这里使用的任何萤光构造的亮度都不会出现年龄的影响23,24,26。注射1µL 的混合物, 含有1毫克/毫升锡-GFP (CAG-loxP-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) 和10µg/毫升的测试结果在稀疏分布的大多数明亮的细胞 (图 3A) 在第二层/III (图 3B)。树突和轴突过程 (图 3B) 和树突棘 (图 3C) 可以可视化。在我们的经验, 目标与任何一个单一的结构, 如 GFP。在至少75% 的 electroporated 胚胎中, "超新星" 构造将性屈服表达。

Figure 1
图 1:后的稀疏和明亮的表达在宫内电穿孔与一个单一的结构含有 GFP 和重组.(A) 低放大率 (4X) 荧光显微图像的大脑皮层在 P23, 后电穿孔在 E15.5。(B) 中等放大率 (20X) 荧光显微图像 DAPI 核染色, 显露皮层层压 (层 I, II/III, iv, 和层深至 iv)。(C) 中等放大倍数 (20X) 单个神经元的荧光显微图像。(D) 高放大率 (60X) 的树突棘荧光显微图像。缩放条形图 = 200 µm (A);100µm (B、C);和5µm (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:后的稠密和明亮的表达在宫内电穿孔与一个单一的结构含有 GFP 和重组.(A) 低放大率 (4X) 荧光显微图像的大脑皮层在 P14, 后电穿孔在 E15.5。(B) 中等放大率 (20X) 荧光显微图像 DAPI 核染色, 显露皮层层压 (层 I, II/III, iv, 和层深至 iv)。(C) 中等放大率 (20X) 荧光显微图像的神经元在最密集的标签区。(D) 中等放大率 (20X) 荧光显微图像, 在最致密的标记区周围的神经元。(E) 高放大率 (60X) 的树突棘荧光显微图像。缩放条形图 = 200 µm (A);100µm (B、C、D);和5µm (E)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:后的稀疏和明亮的表达在宫内电穿孔与超新星-gfp 结构含有 gfp 和重组.(A) 低放大率 (4X) 荧光显微图像的大脑皮层在 P14, 后电穿孔在 E15.5。(B) 中等放大率 (20X) 荧光显微图像 DAPI 核染色, 显露皮层层压 (层 I, II/III, iv, 和层深至 iv)。(C) 中等放大倍数 (20X) 单个神经元的荧光显微图像。(D) 高放大率 (60X) 的树突棘荧光显微图像。缩放条形图 = 200 µm (A);100µm (B、C);和5µm (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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在这里, 我们介绍了在子宫内电穿孔与重组在 floxed 小鼠的组合, 以产生马赛克脑组织。这种方法的优点是, 每次要针对不同的蜂窝子类型时都不需要生成新的鼠标线:在子宫内电穿孔可用于针对兴奋性神经元、抑制性神经元或胶质细胞, 这取决于时间以及电穿孔的位置15,16,17,18,19,20,21,34。在我们的方法中, 靶向大脑皮层是一致的和可重复的, 因为我们使用5毫米直径电穿孔电极, 可以放置在大面积的发展端。要针对大脑中的替代性部位 (间脑、视网膜), 或针对大脑皮层区域的更具体的靶点, 可为此目的明确设计的程序和电极可以使用15, 16. 我们还提供了一个单一的结构, 提供明亮的标签和保证每个荧光标记的神经元包含重组。使用单个构造来实现明亮标记的一个缺点是标记的填充可能过于稠密 (图 2C), 但这可以通过标记区域外围的成像单元 (图 2D) 来解决。另外, 一个荧光结构的表达式可以设计为依赖于重组表达式17, 但低表达式水平可能需要免疫的荧光标记。这个限制是由 "超新星" 系统的相关荧光标记表达式 (图 3A)23,24

除了结合氧合酶与宫内电穿孔, 我们提供了一些改进, 优化育种的定时怀孕的女性。重要的是要保持在一个不受噪音和振动造成的设备, 如层流罩的小鼠在一个控股室。用塑料圆顶、筑巢材料和像葵花籽这样的膳食补充剂来丰富环境 (见材料清单)。除了环境方面的考虑外, 我们注意到女性的第一批垃圾通常有最低的生存率。因此, 我们的协议建议等待, 直到第二次怀孕的女性执行在子宫电穿孔。虽然这一战略增加了垃圾的生存, 它也往往增加垃圾的大小, 这可以延长手术时间, 从而降低手术的成功。因此, 如果遇到特别多的胚胎 (例如超过 8), 我们建议跳过一些胚胎的电穿孔, 尤其是最接近卵巢和子宫颈的胚胎, 那里的组织最容易受伤。此外, 使用上述相同的环境富集策略 (塑料圆顶、筑巢材料、膳食补充剂) 往往会增加出生后凋落物的存活率。同样重要的是要注意到, 发情可能发生在雌鸟产后几个小时后的第一个垃圾。在这种情况下, 允许雌性生下她的第二个垃圾, 然后在断奶后分开, 以尝试定时交配。当寻找阴道插头时, 最好将雌性分离, 即使没有找到插头, 特别是女性在前一天晚上发情的时候。某些菌株的插头很难发现, 而且可能已经发生了。

另一个改进的地方是为子宫内电穿孔产生足够的微注射管。将管用于侧脑室的 DNA 注射是关键的一步。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 以建立一个一致的尖端大小和粗糙尖端边缘管。其他方法还包括用手术刀刀片15或用镊子拧断尖端,1617。请注意, 如果吸管尖端太小, 他们会正确地刺穿子宫壁, 但注射流速会太低, 延长的时间, 吸管是在胚胎的大脑。如果吸管的尖端太大, 可能会损害子宫壁和胚胎的大脑。如果吸管的尖端太平滑, 他们会导致在子宫壁和/或胚胎头骨大草皮前突破, 可能损害胚胎。练习创建一个粗略的突破, 以产生20-25 µm 提示和检查提示下的简单光显微镜 (例如与10X 目标), 直到达到一致的结果。测试液体可以 pipetted 在一个合理的速度 (例如〜0.5 µL/秒) 与一个器管组件是另一种方法, 以确保尖端大小在一个可接受的范围内。由于注射管的校准和毕业, 确切数量的 DNA 传递到侧脑室是已知的。这是实现所需稀疏性到一个数量级的最关键的步骤。换言之, 给定浓度应在特定范围内产生标记,例如10 到100标记的神经元。

协议中最重要的步骤是在子宫内电穿孔过程。露出子宫时要格外轻柔。当从腹腔取出最后的胚胎时, 一定不要拉扯卵巢或子宫颈。使用拇指和食指在微注射和电穿孔允许温和, 灵巧的操作的胚胎, 以揭示侧脑室和允许胚胎被轻轻地推对子宫壁。在处理子宫和胚胎时, 极其轻柔的触摸是至关重要的。如果很难达到一个温和的触摸, 使用环钳与内置的限制螺钉, 以防止钳夹在胚胎或子宫, 造成组织损害。进一步的考虑是在手术前立即对卡洛芬和丁丙诺啡进行管理, 这一做法似乎能在宫内手术期间提供有效的疼痛管理, 而不影响胚胎存活率35.

根据我们的简化的组织学程序, 几个步骤是关键的。在灌注实验的大脑与固定, 保持大脑完整的头骨, 以保护大脑组织在 post-fixation 的损害。虽然可以将大脑储存1% 天至数周, 但请注意, 随着粉煤灰溶液的聚合, 荧光会减少。切片100µm 冠状截面通常是足够薄, 以允许共聚焦显微镜通过整个部分, 同时保留大部分的树突和轴突形态学。如果固定正确, P13 的动物的大脑可以安装到振动切片简单的氰胶。然而, 如果大脑是太柔韧的, 而被振动切片切割, 胶水下来一个小琼脂或琼脂糖块后, 以防止它弯曲, 而它是被切片。如果问题没有解决, 嵌入在琼脂的大脑形成一个块, 以减少与振动切片, 建议为年轻的产后大脑 (步骤 5.8)。

该方法将混合氧合酶系统与宫内电穿孔相结合, 生成可用于研究神经元细胞自主功能的马赛克。此方法还可以配置为支持在子宫内基因编辑构造的电穿孔 (例如CRISPR/Cas9)6或其他 site-specific recombinases (Flp/首次登记税或/或火箭24), 这些都可能用于制作马赛克脑组织。一个有前途的替代技术, 可用于生产马赛克组织是病毒传递通过脑室注射到新生小鼠36结合脑室内注射在胚胎年龄如这里和其他地方显示15,16,17,1819,20, 212237、病毒载体编码重组可在出生前交付, 以感染 floxed 祖细胞在心室区。一个关键的考虑是确保病毒载体被稀释得足够, 以实现稀疏切除和标记。但是, 这也会导致正在交付的构造的拷贝数减少, 包括神经观测所必需的荧光标记 (例如树突棘或树枝)24。为了应对这一缺陷, 新的构造使用与此处演示的 "超新星" 构造相同的策略, 可以用来实现稀疏标记, 而不会相应减少标记单元格的亮度24。病毒传递的另一个重要考虑是确保所交付的构造具有特定于所研究的细胞群的启动子 (例如兴奋性锥体神经元)。脑室注射病毒载体引起的所有组织周围的脑室, 不仅包括心室区的背部端皮层和海马兴奋神经元的产生, 但也内侧和侧节主教, 许多皮质神经元生于34在子宫内的另一个特征是, 与病毒传递相比, 其传送时间窗口相对较窄。植入侧脑室的病毒可以在手术后持续, 继续感染心室内壁细胞。相比之下, 电穿孔以秒为单位, 以一组更具体的细胞为目标。这可能是一个优势或劣势的调查员, 取决于细胞亚群的研究。

我们的方法是通过引入单一结构或 "超新星" 结构来支持氧合酶的重组。在 "超新星" 构造的情况下, 我们敦促调查人员熟悉使用该策略的优点和局限性。例如, 在大脑皮层的 II/III 层兴奋性神经元的2天内, 出现了综合招聘考试删除时间的显示,24。因此, 这是似是而非的, 在48小时的电穿孔后, 可能发生的, 而不是立即继电穿孔。因此, 其他形式的确证时间和位置的综合招聘考试 (例如使用了综合招聘记者鼠标线) 应该被用来补充这项新技术的使用, 特别是在研究中, 在一个小的时间表内的切割是一个关键审议.另一个潜在的缺陷是, 在 "超新星" 实验中, 一小部分未标记的细胞可以表达重组。例如, 在图 3中, 我们 co-electroporated 了两个质粒: 高浓度的 CAG-loxP-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE, 以及低浓度的综合考试。因为这是一个漏水的启动子, 重组可以表达的细胞, 接受了 loxP-loxP-EGFP-tTA 质粒, 虽然这将是一个罕见的发生。在一个非常重要的实验中, 所有未标记的细胞都没有任何的以综合评分法进行的切除, "超新星" 实验可能需要辅以一项对照实验, 在该试验中, 对标记神经元外的重组表达进行评估。通过其他方法 (例如重组免疫组织化学)。

总之, 我们的协议很容易修改, 以适应这些新的结构, 使在子宫电穿孔一个更有用和适应性的方法, 马赛克分析。因此,子宫内电穿孔可以与基因重组的力量结合在一起, 以多种方式研究镶嵌脑组织的体内

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Disclosures

作者没有利益冲突透露。

Acknowledgments

作者感谢詹姆斯麦迪逊大学生物学系和詹姆斯麦迪逊大学光显微镜和成像设施的慷慨支持。Dr. 马克 l. 加布里埃尔关于年轻的产后组织准备的有用建议,和 Drs. 贾斯汀 w. 布朗和科里. 克莱兰德为外科手术材料和空间的慷慨协调。这项研究部分由 4 VA 合作研究基金资助, 这是一个促进弗吉尼亚联邦 (G.S.V.) 的合作伙伴关系, 以及弗吉尼亚科学院小项目研究补助金 (G.S.V.)。支持已慷慨提供的贝蒂祖爱管家58的本科研究奖学金 (K.M.B.), 法雷尔暑期研究奖学金 (K.M.B.), 詹姆斯麦迪逊大学第二世纪奖学金 (K.M.B.), 詹姆斯麦迪逊大学百年奖学金 (到 C.J.H.), 詹姆斯麦迪逊大学露西鲁宾逊查寻30纪念奖学金 (对 Z.L.H.) 和詹姆斯麦迪逊大学科学和数学学院协助津贴 (对 G.S.V.)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

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References

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<em>宫内</em>电穿孔诱导小鼠大脑皮质中氧合酶的重组
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Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).More

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