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Neuroscience

उत्प्रेरण Cre-लोक्स reयुग्म में माउस सेरेब्रल प्रांतस्था के माध्यम से Utero में Electroporation

doi: 10.3791/56675 Published: November 17, 2017
* These authors contributed equally

Summary

कोशिका-मस्तिष्क में जीन के स्वायत्त कार्यों उत्प्रेरण नुकसान या कोशिकाओं की विरल आबादी में समारोह का लाभ द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । यहां, हम utero electroporation में वर्णन करने के लिए cortical के साथ floxed ंयूरॉंस के विकास के विरल आबादी में Cre recombinase देने के जीन vivo मेंसमारोह के नुकसान का कारण है ।

Abstract

सेल-जीन के स्वायत्त ंयूरॉंस कार्य हानि या ंयूरॉंस की एक छोटी और विरल जनसंख्या में एक जीन के समारोह के लाभ के कारण से पता चला जा सकता है । ऐसा करने के लिए एक मोज़ेक जो एक जीन के नुकसान या समारोह के लाभ के साथ ंयूरॉंस में आनुवंशिक रूप से बेफिक्र ऊतक से घिरे है पैदा करने की आवश्यकता है । यहां, हम utero electroporation में के साथ Cre-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली गठबंधन के क्रम में मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक है कि सेल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन करने के लिए-ंयूरॉंस में जीन के स्वायत्त समारोह । डीएनए constructs (खजाने के माध्यम से उपलब्ध है), एक फ्लोरोसेंट लेबल और Cre recombinase के लिए कोडिंग, cortical माउस के दिमाग में loxP साइटों के साथ निहित जीन युक्त के विकास में पेश कर रहे है utero में प्रयोग भ्रूण electroporation । इसके अतिरिक्त, हम utero electroporation विधि में विभिन्न रूपांतरों का वर्णन करते हैं जो बचे हुए और reproducibility को बढ़ाते हैं । इस विधि भी न्यूरॉन्स की एक विरल या घने जनसंख्या में Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के लिए एक titer की स्थापना शामिल है. लेबल मस्तिष्क ऊतक की ऊतकीय तैयारी की आवश्यकता नहीं है (लेकिन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है) immunohistochemistry । निर्माण की गारंटी है कि फ्लोरोसेंट लेबल ंयूरॉंस Cre recombinase के लिए जीन ले इस्तेमाल किया । ऊतकीय तैयारी वृक्ष और axonal arbors और वृक्ष spins के फोकल इमेजिंग के माध्यम से ंयूरॉंस के रूपात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं । क्योंकि हानि या समारोह के लाभ विरल मोज़ेक ऊतक में हासिल की है, इस विधि सेल स्वायत्त आवश्यकता और vivo मेंजीन उत्पादों की प्रचुरता के अध्ययन परमिट ।

Introduction

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एक आनुवंशिक मोज़ेक सृजन ब्याज की एक जीन के समारोह को समझने के लिए एक क्लासिक प्रयोगात्मक प्रतिमान है । यदि एक जीन एक सेलुलर phenotype के लिए आवश्यक है यह निर्धारित करने के लिए, सरल दृष्टिकोण जीव भर में जीन के समारोह की हानि पैदा कर रहा है (जैसे नॉकआउट) । हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए यदि एक जीन विशेष रूप से एक निश्चित कोशिका प्रकार में आवश्यक है, जीव भर जीन की नॉकआउट एक वैध दृष्टिकोण नहीं है । इसके बजाय, एक विधि की आवश्यकता है कि किसी दिए गए कक्ष में एक जीन के समारोह के नुकसान का कारण है जबकि यह wildtype (यानी आनुवंशिक रूप से बेफिक्र) ऊतक-दूसरे शब्दों में, मोज़ेक ऊतक बनाने से घिरा हुआ है । यदि उत्परिवर्ती सेल एक उत्परिवर्ती phenotype से पता चलता है, लेकिन आसपास के wildtype कोशिकाओं नहीं है, एक सेल में जीन कार्य स्वायत्त तरीके से । मोज़ेक ऊतक के विश्लेषण, जिसमें उत्परिवर्ती कोशिकाओं wildtype ऊतक से घिरे रहे हैं, कोशिका को समझने के लिए आदर्श है-जीन के स्वायत्त कार्यों, विशेष रूप से मस्तिष्क में जहां ंयूरॉंस और glia फार्म ऊतक के एक विशाल परस्पर जुड़े नेटवर्क ।

मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक के कई रूपों शक्तिशाली मॉडल की जांच करने के लिए सेल-जीन के स्वायत्त कार्यों प्रदान की है । अध्ययन ंयूरॉन प्रत्यारोपण1, महिला एक्स से जुड़ा हुआ मोज़ेक2,3,4, और अंतर्जात दैहिक मोज़ेक5,6 तैयार किया है पर ध्यान केंद्रित मोज़ेक के आधार पर अपने निष्कर्ष मस्तिष्क ऊतक । Cre-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली के माध्यम से एक जीन के सशर्त विलोपन एक तरीका है कि ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की महान उपलब्धता का पूरा फायदा लेता है । इस विधि में, दो loxP साइटों को एक जीन की एक आवश्यक अनुक्रम के दोनों ओर से पेश कर रहे है (जैसे एक एक्सॉन के रूप में), यह loxP साइटों कि दोनों एक ही दिशा में चेहरा ("floxed") द्वारा पार्श्व जा । Cre recombinase loxP साइटों के बीच परिक्रमा7एक्साइज । Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन से प्राप्त किया जा सकता है floxed चूहों को पार करने के लिए एक और माउस लाइन के साथ व्यक्त Cre recombinase एक सबसेट में एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ कोशिकाओं ("Cre रिपोर्टर लाइन"). इस तरह के उत्तेजक ंयूरॉंस या astrocytes8के रूप में कोशिकाओं के सबसेट में एक जीन के कार्यों को उजागर करने के तरीके की एक किस्म में प्रदर्शन किया गया है । Cre रिपोर्टर लाइनों CreERटी 2 व्यक्त करने के लिए Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन की अनुमति के लिए दवा-inducible (एकल-ंयूरॉन inducible Cre के साथ लेबलिंग-पीटा, या चालाक)9सकता है । एक और डबल मार्करों (MADM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण बुलाया रणनीति में10,11, Cre-interchromosomal पुनर्संयोजन मध्यस्थता एक homozygous उत्परिवर्ती heterozygous ऊतक के साथ बनाया जा करने की अनुमति देता है । इन दृष्टिकोणों में, चूहों की एक नई लाइन प्रत्येक उंमीदवार जीन या सेलुलर उपप्रकार है कि परीक्षण के लिए हर बार उत्पादन किया जा की जरूरत है । वैकल्पिक रूप से, Cre recombinase iontophoresis12 के माध्यम से या वायरल वैक्टर के माध्यम से postnatally पेश किया जा सकता है (उदा. adeno-जुड़े वायरस13 या lentiviruses14 सेलुलर उपप्रकार-विशिष्ट ले प्रवर्तक). यह रणनीति मजबूत और प्रसव लेबलिंग बनाता है । सेरेब्रल cortical न्यूरॉन्स के विकास को लक्षित करने के लिए विरल और एक आदर्श रणनीति एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ Cre recombinase के utero electroporation में है.

vivo मेंमोज़ेक ऊतक का उत्पादन करने के लिए utero electroporation में के माध्यम से Cre-लोक्स संयोजन के संयोजन के अलावा, हम अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल से प्रक्रियाओं के लिए कई रूपांतरों परिचय15,16, 17,18,19,20,21. हम प्रजनन समय-गर्भवती महिलाओं में सफलता में सुधार करने के लिए जानकारी प्रदान करते हैं । हम भी हमारे दो रणनीतियों cortical ऊतक में ंयूरॉंस की विरल और उज्ज्वल लेबलिंग परिचय के लिए रूपरेखा: एक रणनीति Cre recombinase और एक फ्लोरोसेंट मार्कर22के लिए एक एकल निर्माण कोडिंग के स्तर अनुमापन है । एक अंय रणनीति के लिए "सुपरनोवा" प्रणाली,23,24मन में इन मापदंडों के साथ विशेष रूप से डिजाइन का उपयोग है । इसके अतिरिक्त, हम utero electroporation सर्जरी में अनुरूप microinjection पिपेट और सरलीकरण के उत्पादन पर सुधार की पेशकश करते हैं । अंत में, हम एक सरलीकृत ऊतकीय तैयारी में महत्वपूर्ण कदम है कि वृक्ष spins और वृक्ष और axonal arbors, आगे धुंधला या immunohistochemistry बिना के विश्लेषण परमिट की रूपरेखा ।

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Protocol

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यहां वर्णित तरीके पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है, और अनुसार सभी संबंधित विनियामक और संस्थागत दिशा निर्देशों के साथ अनुपालन कर रहे हैं ।

1. माउस सेट-अप

  1. घर एक युवा (> P60) पुरुष और महिला homozygous floxed माउस एक साथ एक ब्रीडर जोड़ी25सेट ।
    नोट: एक अच्छा नकारात्मक नियंत्रण wildtype चूहों, जिसमें Cre recombinase अभिव्यक्ति एक मोज़ेक26का कारण नहीं होगा की एक अतिरिक्त ब्रीडर जोड़ी स्थापित करने के लिए है ।
  2. मादा को जन्म देने और पुरुष के साथ उसे पहले कूड़े को उठाने की अनुमति दें. कूड़े के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए महिला के साथ पुरुष को भी साथ रखें । प्रातः के बाद कूड़े को, उदा प्रसव दिन (P) 21 पर, महिला और पुरुष को अलग करें ।
  3. Murine प्रजनन
    1. महिला और पुरुष25के बीच एक समय पर सहवास सेट करें । महिला27का मद चक्र निर्धारित करने के लिए दृश्य संकेतों का उपयोग करें, और संभोग के बाद सुबह योनि प्लग के लिए जांचें25
    2. एक प्लग पाया जाता है, अलग है, और महिला तौलना. भ्रूण दिवस के रूप में दिन गिनती (ई) ०.५ ।
    3. महिला हर 3-5 दिन वजनी अगर वह गर्भवती है निर्धारित करने के लिए जारी है । गर्भवती महिलाओं के शरीर के वजन में 10-20% की वृद्धि होगी 7-10 दिन गर्भाधान के बाद (E0) ।
      नोट: यह कदम गर्भावस्था की पुष्टि पहले और अधिक मज़बूती से दृश्य निरीक्षण25
    4. महिला गर्भवती नहीं है, तो दोहराएँ कदम 1.3.1-1.3.3.
  4. गर्भावस्था की पुष्टि होने के बाद, utero electroporation में की तिथि चुनें । को लक्ष्य परत द्वितीय/III cortical हवामहल progenitors, 15.5 ई पर electroporation प्रदर्शन करते हैं ।

2. डीएनए सेट अप

  1. एक भी डीएनए का निर्माण चुनें कि Cre recombinase के लिए कोड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)28,29के रूप में एक फ्लोरोसेंट मार्कर, । वैकल्पिक रूप से, पिछले प्रकाशन23,24में विस्तार से वर्णित "सुपरनोवा" प्रणाली का उपयोग करें । सामग्री की सूची देखें उदाहरण के निर्माण के लिए ।
  2. बढ़ाना डीएनए का निर्माण ई. कोलाई में २.१ कदम से मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी तकनीकों का प्रयोग30
  3. शुद्ध डीएनए एक endotoxin-मुक्त प्लाज्मिड शोधन किट के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ निर्माण । Elute endotoxin-मुक्त पानी के साथ निर्माण ।
    नोट: एक मानक शोधन किट पर एक endotoxin-मुफ्त शोधन किट का चयन महत्वपूर्ण है ।
  4. 1-3 मिलीग्राम/एमएल के लिए वांछित लेबलिंग घनत्व के आधार पर डीएनए eluate ध्यान केंद्रित26
    नोट: एक titer हमेशा की जरूरत है जब एक नए डीएनए के साथ काम करने की स्थापना की है, यह देखते हुए कि वे अलग लंबाई और प्रमोटरों है । एक कई अलग सांद्रता और/या मात्रा में अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए निर्माण इंजेक्शन पर विचार करें । उदाहरण के लिए, के इंजेक्शन 1 µ l या १.५ µ l की २.० मिलीग्राम/एमएल GFP. Cre (1 µ एल) या घने (१.५ µ एल) परत द्वितीय के लेबलिंग/III दृश्य cortical हवामहल न्यूरॉन्स के कारण करने में सक्षम है26
  5. जोड़ें ०.४% trypan ब्लू में 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब; १३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 10 मिमी एनए2HPO4, १.८ मिमी KH2पीओ4 में एच2ओ, एचसीएल के साथ पीएच ७.४ करने के लिए समायोजित) केंद्रित डीएनए समाधान के लिए 1:10.
  6. केंद्रित डीएनए समाधान के लिए 10x 1:10 पंजाबियों जोड़ें ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित डीएनए समाधान की दुकान । समाधान अनिश्चित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. पिपेट सेट अप

  1. एक गिलास केशिका खींचने का उपयोग करना, एक बहुत लंबे (10-15 मिमी) शंकु और बहुत ठीक टिप, भ्रूण स्टेम सेल इंजेक्शन या परमाणु हस्तांतरण के लिए पिपेट की खासियत के साथ एक पिपेट खींचो31.
    नोट: पिपेट को दूषित होने से रोकने के लिए, उन्हें सर्जरी के 2 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए ।
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन, एक रैंप परीक्षण प्रदर्शन करके कांच केशिका खींचने जांचना । एक पुलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रोग्राम करने के लिए परिणामी ताप मान का उपयोग करें: हीट = (रैंप टेस्ट मूल्य + 15), पुल = 30, vel = १२०, समय = १००, दबाव = २०० । कांच केशिका डालें, खींचने पर clamps करने के लिए जकड़ना, और क्रमादेशित खींच प्रोटोकॉल को सक्रिय, कांच केशिका पर एक शंकु बनाने ।
    2. सुनिश्चित करें कि शंकु लंबाई 10-15 mm के बीच एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप (जैसे 10x उद्देश्य)31का उपयोग कर रहा है ।
  2. वापस पिपेट तोड़ने के लिए एक मोटा-20-25 µm व्यास के लिए टिप धार फार्म ।
    1. केंद्र एक एकल प्लाई टास्क पोंछें (सामग्री की सूची देखें) पर एक ५० मिलीलीटर चोंच और खिंचाव पोंछ एक हाथ से तना हुआ । दूसरे हाथ के साथ, पकड़ और धक्का एक पिपेट (शंकु नीचे की ओर) सीधा और पूरी तरह से पोंछ के केंद्र के माध्यम से, शंकु में एक साफ तोड़ के कारण31
      नोट: पिपेट पूरी तरह से पोंछ के माध्यम से धक्का एक 20-25 µm व्यास समय के बारे में ७०% टिप उत्पादन होगा ।
    2. एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत की पुष्टि करें (उदा 20x उद्देश्य) ।
      सावधानी: शीशे को तोड़ते समय आंखों की सुरक्षा का प्रयोग करें ।
  3. 1x पंजाब में ०.४% trypan ब्लू के aspirating 1 µ एल द्वारा एक आंशिक रूप से भरा piptte में एक पिपेट जांचना, तो पिपेट में 1 µ एल की ऊंचाई के आधार पर 1 µ एल चिह्नों के साथ पिपेट ग्रेजुएशन, एक ठीक से इत्तला दे दी शराब प्रतिरोधी मार्कर का उपयोग कर । दूसरे पिपेट को परित्याग करने से पहले ही ग्रेजुएट करने के लिए नपे पिपेट का प्रयोग करें । धूल और अन्य कणों से मुक्त एक पिपेट धारक में पिपेट रखें ।

4. Utero Electroporation में

  1. प्लेस Graefe संदंश, आईरिस कैंची, Hartman मच्छर संदंश, गैर बुना धुंध स्पंज, अंगूठी इत्तला दे दी संदंश, और एक स्टेनलेस स्टील ट्रे पर पेट्री व्यंजन, और एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटो । प्लेस ट्रे और 1 एल ०.९% खारा (०.९% wt/NaCl पानी में) आटोक्लेव में । १२१ डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और ४० मिनट के लिए ३.५ केपीए आटोक्लेव से निकालें और एक संक्रमित शल्य क्षेत्र में जगह है ।
    नोट: यह शल्य चिकित्सा के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  2. autoclaved 1 L खारा बोतल को एक छोटे से पानी में नहाने के लिए ३८ डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज सर्जरी से पहले गर्म करें ।
  3. नोचना-प्रकार इलेक्ट्रोड और जनरेटर के लिए पैर पेडल कनेक्ट (सामग्री की सूची देखें). निर्माता के निर्देशों के बाद, जनरेटर के लिए ५० वी (एक ९५० एमएस अंतराल के साथ) जब पैर पेडल द्वारा ट्रिगर के साथ ५ ५० एमएस पल्स वितरित करने के लिए सेट । संक्रमित शल्य क्षेत्र पर नोचना-प्रकार इलेक्ट्रोड और जगह को संक्रमित.
  4. पहले प्रकाशित३२के रूप में एक संज्ञाहरण नाक शंकु बनाओ, लेकिन नाक शंकु खोलने पर सुरक्षित रूप से फिट बैठता है कि एक डायाफ्राम फार्म करने के लिए एक नाइट्राइल या लेटेक्स दस्ताने उंगली के अंत का उपयोग करें । डायाफ्राम में एक छेद में कटौती करने के लिए काफी बड़ी है माउस थूथन पर फिट ।
  5. गहरा ई 15.5 पर anesthetize गर्भवती चूहों में एक प्रेरण isoflurane से भरा चैंबर में (2-4%) शुद्ध ऑक्सीजन में बह 1 L/ ~ 1 मिनट के बाद, लेकन पलटा परीक्षण (धीरे प्रेरण चैंबर झुकाव और यह सुनिश्चित करें कि माउस ही सही नहीं है) । analgesia की खुराकों का निर्धारण करने के लिए माउस तौलना सर्जरी के दौरान बाद में प्रशासित ।
  6. सर्जिकल क्षेत्र के लिए माउस स्थानांतरण और सर्जिकल विमान में माउस को बनाए रखने के लिए एक नाक शंकु के माध्यम से 1 एल/मिनट में बह शुद्ध ऑक्सीजन में सांस isoflurane (1-2%) का प्रयोग करें संदंश पेडल पलटा परीक्षण करने के लिए (धीरे पंजा चुटकी और सुनिश्चित करें कि माउस एक पलटा वापस नहीं करता है) anesthetization सत्यापित करने के लिए । श्वसन दर और प्रयास की निगरानी, गहरी, नियमित सांस लेने के लिए देख (~ 70-100 सांसों/मिनट), और है कि श्लेष्मा झिल्ली रंग और नम में गुलाबी हैं ।
  7. आंखों पर पर्याप्त पशु चिकित्सा नेत्र मरहम लागू करने के लिए प्रक्रिया के दौरान सुखाने के खिलाफ संरक्षण के लिए उंहें पूरी तरह से कवर ।
  8. फ्लेक्स एक सील supersaturated नमक समाधान से भरा थैली के धातु उत्प्रेरक डिस्क (सामग्री की सूची देखें), नमक की एक अमबर क्रिस्टलीकरण सक्रिय । थैली के शीर्ष पर 2 एकल प्लाई कार्य पोंछे रखना, और थैली पर माउस जगह शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए ।
  9. पेट फर (लगभग 20-40 s) भंग जब तक कपास झाड़ू के साथ उदर क्षेत्र पर लोमनाशक क्रीम मालिश, तो बंद पेट फर पोंछ । ७०% इथेनॉल और कपास झाड़ू के साथ किसी भी शेष अवशेषों और लोमनाशक क्रीम को सावधानीपूर्वक साफ करें । उदर क्षेत्र पर एक fenestrated बाँझ सर्जिकल कपड़े की स्थिति.
  10. रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग, त्वचा खींच और Graefe संदंश के साथ पेट से दूर, और एक ~ 2 सेमी ventral आईरिस कैंची का उपयोग कर त्वचा पर midline चीरा, सुनिश्चित करना है कि अंतर्निहित मांसपेशी कटौती नहीं है ।
    नोट: Graefe संदंश और आइरिस कैंची के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक स्वीकार्य विकल्प एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए है, के रूप में पहले से ही प्रकाशित17.
  11. लीनिया अल्बा rectus एब्डोमिनिस के midline कल्पना करने के लिए खोजें । मांसपेशियों को ऊपर और Graefe संदंश के साथ पेट से दूर खींचो, और एक और ~ 2 सेमी midline आईरिस कैंची के साथ वहां चीरा, उदर गुहा (गर्भाशय पारदर्शी और भ्रूण के नीचे दिखाई जाएगी) को उजागर करना । सुनिश्चित करें कि अंतर्निहित गर्भाशय और आंतों के ऊतकों में कटौती नहीं है । चीरा केवल काफी बड़े (आम तौर पर ~ 2 सेमी) बाहर खींचने के लिए और आराम से गर्भाशय का पर्दाफाश करने के लिए बनाओ ।
    नोट: Graefe संदंश और आइरिस कैंची के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक स्वीकार्य विकल्प एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए है, के रूप में पहले से ही प्रकाशित17.
  12. एक बाँझ 10 µ l micropipette टिप का उपयोग करना, carprofen वितरण (बाँझ ०.९% खारा में भंग) में 4 मिलीग्राम/analgesia के लिए उदर गुहा में.
  13. rectus एब्डोमिनिस चीरा के बाएँ किनारे पर एक Hartman मच्छर संदंश दबाना. चीरा के बाईं ओर रखने के लिए खुला पेट्री डिश पर संदंश आराम करो, चीरा के बाईं तरफ रखते हुए. rectus एब्डोमिनिस चीरा के सही किनारे पर एक और Hartman मच्छर संदंश दबाना और चीरा के अधिकार के लिए एक पलट संदंश डिश पर पेट्री आराम, खुले चीरा के दाईं ओर रखते हुए. चीरा के क्षेत्र के आसपास धुंध स्पंज प्लेस ।
  14. अंगूठी संदंश का प्रयोग (एक संलग्न सीमा पेंच के बिना), कुचल या किसी भी ऊतक घायल बिना किसी भी दो पड़ोसी भ्रूण के बीच गर्भाशय पर खींचो । चीरा के माध्यम से सभी भ्रूण बाहर खींच शुरू, धुंध स्पंज के शीर्ष पर उन्हें बिछाने. जब उदर गुहा से बाहर पिछले भ्रूण खींच, अंडाशय या गर्भाशय ग्रीवा पर खींचने के लिए नहीं सुनिश्चित करें । एक बार उजागर, यह गर्म खारा के साथ गर्भाशय नम रखने के लिए महत्वपूर्ण है । गर्भाशय आमतौर पर 5 और 8 भ्रूण के बीच होता है ।
    नोट: यह खारा17के लिए पेनिसिलिन और streptomycin जोड़ने के लिए संभव है.
  15. aspirator ट्यूब विधानसभा के लिए एक नपे पिपेट कनेक्ट (सामग्री की सूची देखें), और प्रत्येक भ्रूण की एक पार्श्व निलय में गर्भाशय की दीवार के माध्यम से चरण 2 में तैयार डीएनए समाधान के ठीक 1 µ एल सुई. पार्श्व निलय भ्रूण के पृष्ठीय telencephalon पर दो पैच के रूप में दिखाई देते हैं (पैच telencephalon के आसपास के ऊतकों की तुलना में गहरा रहे हैं). microinjection और electroporation के दौरान अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग करें भ्रूण में हेरफेर करने के लिए, पार्श्व निलय खुलासा और भ्रूण इंजेक्शन के दौरान गर्भाशय की दीवार के खिलाफ धीरे धकेल दिया जा करने की अनुमति । trypan ब्लू पार्श्व निलय भरने को देख कर सफल इंजेक्शन की पुष्टि करें ।
  16. नोचना प्रकार इलेक्ट्रोड के कैथोड प्लेस (सामग्री की सूची देखें) गर्भाशय पर, सीधे औसत दर्जे का और caudal प्रांतस्था लक्ष्य करने के लिए दृश्य प्रांतस्था (मस्तिष्क के वैकल्पिक क्षेत्रों लक्ष्यीकरण अलग इलेक्ट्रोड स्थान की आवश्यकता होगी)16, 26. गर्भाशय पर anode, सिर्फ हीन और पूर्वकाल में भ्रूण के सिर पर रखें ।
  17. पुष्टि करें कि anode और कैथोड उपयुक्त स्थानों पर भ्रूण आसपास के गर्भाशय को छू रहे हैं । एक पैर पेडल के साथ, ५० वी के ५ ५० एमएस पल्स की डिलीवरी ट्रिगर (एक ९५० एमएस अंतराल के साथ) इलेक्ट्रोड भर में.
    नोट: इंजेक्शन, नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए कैथोड की ओर कदम होगा और वेंट्रिकुलर क्षेत्र की कोशिकाओं को कैथोड के निकटतम में शामिल किया जाएगा ।
  18. उदर गुहा के लिए गर्भाशय वापस एक ही अभिविंयास में यह पाया गया था । खारा का उपयोग करने के लिए गर्भाशय चिकना जबकि मार्गदर्शक यह मैंयुअल रूप से और बहुत धीरे, देखभाल के लिए गर्भाशय में अपनी स्थिति से भ्रूण विस्थापन नहीं ले ।
  19. एक सरल बाधित सिलाई का उपयोग कर अवशोषित टांके (सामग्री की सूची देखें) के साथ पेट की मांसपेशियों को बंद करें, एक सर्जन की गांठ के साथ समाप्त होता है बांधने । अंत भी गाँठ या गाँठ के करीब क्लिप नहीं है unमुंड हो जाएगा ।
    नोट: यह पेट की मांसपेशियों को सीवन के लिए महत्वपूर्ण है कि घाव के किनारों पूरी तरह से बंद कर रहे हैं, लेकिन मांसपेशियों की blanching के कारण के बिना । नॉट टाइट होने चाहिए इसलिए इन्हें अनबन्धन नहीं किया जा सकता ।
  20. अवशोषित टांके (सरल बाधित सिलाई, सर्जन की गांठ, ४.१९ कदम के रूप में) के साथ त्वचा की परत को बंद करें । ऊतक चिपकने वाला घाव सील करने के लिए एक छोटी राशि लागू करें । लागू करने के लिए गांठ पर ऊतक चिपकने वाला को रोकने के । किसी भी ऊतक घाव है कि micropipette द्वारा aspirated जा सकता है आसपास चिपकने हटाने के लिए एक micropipette का प्रयोग करें ।
  21. 0.5-1.5% कम isoflurane स्तर । एक बार ऊतक चिपकने वाला सूखा (चिपकने के लिए दस्ताने को छूने से परीक्षण), isoflurane से हटाने और महिला एक गर्म पिंजरे में अकेले ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं । प्रशासन buprenorphine intraperitoneally पर ०.०३ मिलीग्राम/kg एक 26G, ½ "सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ।
  22. माउस को मॉनिटर करने के लिए जारी रखें जब तक माउस को पूरी तरह से बरामद किया है और आम तौर पर बर्ताव (यानी दूल्हे, पिंजरे की खोज, खाने, या पीने) । एक बार बरामद, पुरुष के साथ पिंजरे में जगह महिला वापस ।
    नोट: यदि सभी चरणों का पालन कर रहे हैं, माउस आम तौर पर 2 मिनट के भीतर चेतना हासिल करेंगे और तुरंत पिंजरे के बारे में आगे बढ़ शुरू, असुविधा के कोई संकेत नहीं दिखा ।
  23. यदि माउस के संकेत असुविधा का प्रदर्शन (जैसे कूबड़ आसन, porphyrin स्राव)३३, प्रशासन carprofen पर ०.१ मिलीग्राम/एमएल में पानी की आपूर्ति । असुविधा के कई लक्षण मौजूद हैं, या यदि परेशानी carprofen प्रशासन के बावजूद अधिक से अधिक 4 एच के लिए बनी हुई है, तुरंत ketamine के एक intraperitoneal घातक इंजेक्शन प्रशासन द्वारा माउस euthanize (२४० मिलीग्राम/-xylazine (४८ मिलीग्राम/ acepromazine (१.८५ मिलीग्राम/कॉकटेल एक 26 जी, ½ "सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर, और इच्छामृत्यु३३के एक अनुमोदित माध्यमिक फार्म के साथ पालन करें ।
  24. जन्म के बाद electroporated भ्रूण के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए, शोर और कंपन से मुक्त, एक शांत जोत कमरे में पिंजरे रखने के लिए । प्लास्टिक igloos, घोंसले के साथ सामग्री, और इस तरह के सूरजमुखी के बीज के रूप में पूरक आहार के साथ पर्यावरण को समृद्ध (सामग्री की सूची देखें) । हिलना मत या पिंजरे परेशान, विशेष रूप से प्रसव के बाद पहले 3 दिनों के दौरान ।

5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतकीय तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल प्रसव दिन (पी) 13 कि utero मेंelectroporated थे से पुराने पशुओं से ऊतक तैयार करने के लिए अनुकूलित है । छोटे प्रसव जानवरों (P0-P13) से ऊतक तैयार करने के लिए, यह (transcardial छिड़काव सहित) सभी चरणों का पालन करने के लिए सिफारिश की है, हालांकि मस्तिष्क वर्गों (चरण ५.९) तैयार करने से पहले आगर में एंबेडेड किया जाना चाहिए । ऊतक भी electroporation के बाद 1-2 दिनों के भीतर भ्रूण से तैयार किया जा सकता है, तरीकों का उपयोग कर पहले18,20वर्णित है ।

  1. paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार करें ।
    नोट: प्रयोग के एक दिन के भीतर, ताजा पीएफए तैयार करना अनिवार्य है ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde विषाक्त है और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    1. ५० मिलीलीटर 4% पीएफए, गर्मी ४० मिलीलीटर पानी के लिए ६० ° c बनाने के लिए । ग्लास रॉड या सरगर्मी बार के साथ सरगर्मी करते हुए 2 ग्राम पीएफए जोड़ें । 10 एम NaOH हर 2 मिनट की µ एल जोड़ें जब तक पीएफए घुल ।
    2. 10x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़ें और पानी के साथ ५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए समाधान लाने के लिए ।
    3. ५० मिलीलीटर के समाधान लाने के बाद, 10 एम एचसीएल के साथ आवश्यकतानुसार पीएच को ७.४ पर समायोजित करें । समाधान को शांत करने की अनुमति दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  2. ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ Euthanize माउस (२४० मिलीग्राम/-xylazine (४८ मिलीग्राम/)-acepromazine (१.८५ मिलीग्राम/कॉकटेल एक 26G, ½ "सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर । Transcardially perfuse 10 या 20 मिलीलीटर बर्फ ठंडा 1x पंजाबियों, 25 या ४० मिलीलीटर हौसले से बनाया के बाद, बर्फ ठंडा 4% पीएफए17। युवा प्रसव (P0-P13) चूहों और पुराने चूहों (P14 और ऊपर) के लिए उच्च मात्रा के लिए कम मात्रा का उपयोग करें ।
  3. तुरंत बाद छिड़काव, decapitate माउस लोथ बड़ी कैंची के साथ पश्चकपाल हड्डी और C1 ग्रीवा के बीच और दूर छील और आईरिस कैंची का उपयोग खोपड़ी आसपास त्वचा के अधिकांश त्याग, विशेष रूप से ललाट के आसपास त्वचा, पार्श्विका, और पश्चकपाल हड्डियों. खोपड़ी और मस्तिष्क को अक्षुण्ण रखें ।
  4. खोपड़ी और मस्तिष्क में 10 मिलीलीटर 4% पीएफए में एक ५० एमएल शंकु ट्यूब में 24 घंटे के लिए 4 ° c के लिए पोस्ट-फिक्स ऊतक । तो 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 1% पीएफए के समाधान को पतला करने के लिए शंकु ट्यूब के लिए 30 मिलीलीटर 1x पंजाबियों जोड़ें ।
    नोट: प्रत्येक खोपड़ी और मस्तिष्क के लिए एक अलग शंकु ट्यूब का उपयोग करने के बाद तय हो । 1% पीएफए में 2 सप्ताह से अधिक समय के लिए मस्तिष्क मशीन नहीं है, या प्रतिदीप्ति फीका करने के लिए शुरू हो जाएगा ।
  5. एकल प्लाई टास्क पोंछे 1x पंजाबियों के साथ गीला के साथ एक सपाट सतह पर मस्तिष्क और खोपड़ी प्लेस । खोपड़ी आसपास के किसी भी शेष त्वचा या झिल्ली को दूर करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी (सामग्री की सूची देखें) का उपयोग करें ।
  6. चिमटी का प्रयोग, पहले पश्चकपाल हड्डी को दूर, फिर ध्यान से पार्श्विका हड्डियों को हटाने, चिमटी बाहर ले जाने और मस्तिष्क की सतह से दूर. प्रांतस्था के नुकसान को रोकने के लिए किसी भी मेनिन्जेस को सावधानीपूर्वक निकालें ।
  7. खोपड़ी के साथ मस्तिष्क के तहत चिमटी के पीछे कील किसी भी कपाल नसों विच्छेद करने के लिए, और मस्तिष्क को हटा दें ।
  8. युवा प्रसव (P0-P13) दिमाग के लिए
    1. ८० डिग्री सेल्सियस के लिए 25 मिलीलीटर 1x पंजाबियों हीटिंग द्वारा 4% आगर के 25 मिलीलीटर बनाओ । हलचल और एक ग्लास रॉड या सरगर्मी बार के साथ 1 जी आगर भंग) ।
    2. ३५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत समाधान है, जबकि हलचल जारी है । एक छोटे कंटेनर (जैसे एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब की टोपी) में मस्तिष्क प्लेस, और मस्तिष्क पर समाधान आगर डालो. आगर को कठोर करने की अनुमति दें ।
  9. एक राज्याभिषेक मैंयुअल रूप से मस्तिष्क के माध्यम से एक एकल बढ़त उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर कटौती, लगभग ०.५ mm bregma को rostral । मस्तिष्क के माध्यम से एक और कोरोनरी काट कर लगभग ०.५ mm caudal to visual प्रांतस्था. हिल microtome नमूना डिस्क के केंद्र पर मस्तिष्क के rostral अंत के रूप में एक ही व्यास के साथ cyanoacrylate गोंद के एक पूल प्लेस । गोंद के पूल के शीर्ष पर मस्तिष्क के rostral अंत प्लेस, सुनिश्चित करना है कि ऊतक के पूरे rostral सतह गोंद के साथ नमूना डिस्क करने के लिए बाध्य है ।
  10. microtome हिल पर बफर ट्रे माउंट और निर्मित में clamping लीवर के साथ सुरक्षित । चाकू धारक में डालें ब्लेड, और mounted पेंच में निर्मित के साथ microtome हिल पर चाकू धारक माउंट । अंतर्निहित clamping डिवाइस का उपयोग बफर ट्रे पर मस्तिष्क के साथ सुरक्षित नमूना डिस्क । सेट गति सेटिंग को ५.७० (= ०.२८५ mm/s), और आवृत्ति सेटिंग करने के लिए ५.३३ (५३.३ हर्ट्ज) ।
  11. 1x पंजाबियों के साथ मस्तिष्क के स्तर से ऊपर चैंबर भरें और पंजाब में ब्लेड कम । ऊतक के माध्यम से १०० µm राज्याभिषेक वर्गों लेने शुरू करते हैं ।
  12. यदि आगे प्रसंस्करण की आवश्यकता नहीं है, जैसे 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) परमाणु धुंधला या immunohistochemistry ।
    1. एक ठीक का उपयोग करें तूलिका एक खुर्दबीन स्लाइड पर हिल microtome से सीधे वर्गों के हस्तांतरण के लिए, प्रत्येक स्लाइड पर 4-6 वर्गों फिटिंग ।
    2. वर्गों की अनुमति दें बाती दूर से सूखी के साथ समाधान एक ठीक इत्तला दे दी तूलिका, कि मस्तिष्क स्लाइसें अब स्लाइड पर बहाव ।
    3. फिर, स्लाइड पर प्रत्येक अनुभाग पर mounter की एक बूंद (सामग्री की सूची देखें) प्लेस ।
    4. धीरे शीर्ष पर एक 24 x ५० mm coverslip करना, यह सुनिश्चित करना है कि 1) कोई हवा वर्गों, पर फार्म का बुलबुले 2) वर्गों हिलना नहीं है, और 3) mounter पूरी तरह से स्लाइड और coverslip के बीच क्षेत्र को शामिल किया गया । की अनुमति देने के लिए ंयूनतम 24-48 एच के लिए इलाज के लिए माउंट ।
  13. cortical laminae की ऊतकीय परीक्षा के लिए DAPI के साथ दाग नाभिक को
    1. एक ठीक का उपयोग करें तूलिका एक 10 µ जी/एमएल DAPI युक्त समाधान में प्रत्येक अनुभाग हस्तांतरण (सामग्री की सूची देखें) स्टॉक समाधान से 1x पंजाब में पतला (20 मिलीग्राम/
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए DAPI समाधान में मशीन है, तो एक ठीक का उपयोग करने के लिए DAPI समाधान से खंड 1x पंजाबियों को स्थानांतरित करने और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब में कमरे के तापमान पर मशीन स्थानांतरण । 5 मिनट प्रत्येक के लिए ताजा 1x पंजाबियों के लिए दो और अधिक बार खंड स्थानांतरण । फिर, एक ठीक का उपयोग तूलिका इत्तला दे दी, एक खुर्दबीन स्लाइड पर अनुभाग हस्तांतरण, कदम 5.11.2-5.11.4 का पालन करें, और कदम ५.१३ के साथ आगे बढ़ना ।
  14. एक गिलास पेट्री डिश वलाप युक्त (बराबर भागों वैसलीन, लेनोलिन, और आयल) एक गर्म थाली पर एक कम गर्मी सेटिंग में पूरी तरह से पिघल जब तक गर्मी । पिघल वलाप पर ब्रश द्वारा स्लाइड के उजागर किनारों सील ।
  15. ऊतक में प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप या फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (सामग्री की सूची देखें) और एक फिल्टर fluorophore देखने के लिए पर्याप्त सेट (जैसे DAPI: उत्तेजना 325-375 एनएम, उत्सर्जन 435-485 एनएम; GFP: उत्तेजना 450-490 एनएम, उत्सर्जन 500-550 एनएम)17। फोकल छवियां कम के साथ लिया जा सकता है-(4x, संख्यात्मक एपर्चर, na = ०.२०), मध्यम-(20X, na = ०.७५), और उच्च शक्ति (60X, na = १.४०) उद्देश्य ।

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Representative Results

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एकल निर्माण GFP । Cre (सामग्री की सूची देखें) ई 15.5 पर electroporated था और P14 में visualized । निर्माण की एकाग्रता और इंजेक्शन की मात्रा के आधार पर, एक विरल या घने परिणाम22,26प्राप्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम/एमएल GFP के 1 µ एल के इंजेक्शन । लेबल किए गए कक्षों के स्पार्स वितरण में Cre परिणाम, जिनमें से कुछ चमकीले हो सकते हैं (चित्र 1a), और लेयर II/III (चित्र 1b) में स्थानीयकृत । क्योंकि ऊतक १०० µm मोटी है, वृक्ष arbors के अधिकांश (चित्रा 1C) संरक्षित कर रहे हैं । वृक्ष spins उच्च आवर्धन पर मनाया जा सकता है (60X; चित्र 1 d) । १.५ µ एल के इंजेक्शन बहुत घने लेबल में एक ही एकाग्रता परिणामों में (चित्रा 2a) परत द्वितीय/III (चित्रा 2 बी), जो उप इष्टतम हो सकता है के रूप में यह neurites और वृक्ष के स्रोत ट्रैक करने के लिए मुश्किल है spins (चित्रा 2c) । हालांकि, यह अभी भी एक ंयूरॉन (चित्रा 2d) और उसकी प्रक्रियाओं (चित्रा 2E) लेबल क्षेत्र (चित्रा 2d) की परिधि में एक उज्ज्वल कक्ष का चयन करके छवि के लिए संभव है ।

अंत में, यह संभव है ंयूरॉंस की चमक को अधिकतम जबकि लेबल कोशिकाओं के एक विरल वितरण को बनाए रखने । यहां, सुपरनोवा-GFP (सामग्री की सूची देखें) ई 15.5 पर electroporated था और P23 में visualized । ध्यान दें कि, मस्तिष्क के विभिंन प्रसव उंर में लिया ऊतक की टिप्पणियों के आधार पर, वहां किसी भी फ्लोरोसेंट की चमक पर उंर का असर नहीं प्रकट होता है यहां इस्तेमाल किया23,24,26। 1 मिलीग्राम/एमएल एसएन-GFP (सीएजी-loxP-स्टॉप-loxP-EGFP-आयरेस-tTA-WPRE) और 10 युक्त मिश्रण के 1 µ l का इंजेक्शन µ g/mL TRE-Cre ज्यादातर उज्ज्वल कोशिकाओं के एक स्पार्स वितरण में परिणाम (चित्रा 3) परत द्वितीय में/ वृक्ष और axonal प्रक्रियाओं (चित्रा 3 बी) और वृक्ष spins (चित्रासी) visualized किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, या तो GFP के रूप में एक भी निर्माण के साथ लक्ष्यीकरण । Cre या के साथ "सुपरनोवा" constructs electroporated भ्रूण के कम से ७५% में उपज अभिव्यक्ति reproducibly होगा ।

Figure 1
चित्र 1: विरल और उज्ज्वल अभिव्यक्ति के बाद utero electroporation में एक एकल GFP और Cre recombinase युक्त निर्माण के साथ । () कम आवर्धन (4x) प्रतिदीप्ति micrograph मस्तिष्क प्रांतस्था के P23 पर, electroporation के बाद ई 15.5 पर । () मध्यम-आवर्धन (20X) DAPI नाभिकीय दाग के प्रतिदीप्ति micrograph, cortical फाड़ना का खुलासा (परतें I, II/III, iv, और चतुर्थ से गहरी परतें) । () मध्यम आवर्धन (20X) एक एकल ंयूरॉन के प्रतिदीप्ति micrograph । () उच्च आवर्धन (60X) वृक्ष spins के प्रतिदीप्ति micrograph । स्केल पट्टियां = २०० µm (A); १०० µm (ख, ग); और 5 µm (D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: घने और उज्ज्वल अभिव्यक्ति के बाद utero electroporation में एक एकल GFP और Cre recombinase युक्त निर्माण के साथ । () कम आवर्धन (4x) प्रतिदीप्ति micrograph मस्तिष्क प्रांतस्था के P14 पर, electroporation के बाद ई 15.5 पर । () मध्यम-आवर्धन (20X) DAPI नाभिकीय दाग के प्रतिदीप्ति micrograph, cortical फाड़ना का खुलासा (परतें I, II/III, iv, और चतुर्थ से गहरी परतें) । () मध्यम आवर्धन (20X) प्रतिदीप्ति micrograph के क्षेत्र में न्यूरॉन्स की सघन लेबलिंग. () मध्यम-आवर्धन (20X) प्रतिदीप्ति micrograph के क्षेत्र की परिधि में लिए गए न्यूरॉन्स की सघन लेबलिंग. () उच्च आवर्धन (60X) वृक्ष spins के प्रतिदीप्ति micrograph. स्केल पट्टियां = २०० µm (A); १०० µm (B, C, D); और 5 µm (E) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: विरल और उज्जवल अभिव्यक्ति के बाद utero electroporation के साथ सुपरनोवा-GFP construction with GFP and Cre recombinase. () कम आवर्धन (4x) प्रतिदीप्ति micrograph मस्तिष्क प्रांतस्था के P14 पर, electroporation के बाद ई 15.5 पर । () मध्यम-आवर्धन (20X) DAPI नाभिकीय दाग के प्रतिदीप्ति micrograph, cortical फाड़ना का खुलासा (परतें I, II/III, iv, और चतुर्थ से गहरी परतें) । () मध्यम आवर्धन (20X) एक एकल ंयूरॉन के प्रतिदीप्ति micrograph । () उच्च आवर्धन (60X) वृक्ष spins के प्रतिदीप्ति micrograph । स्केल पट्टियां = २०० µm (A); १०० µm (ख, ग); और 5 µm (D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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यहां, हम floxed चूहों में Cre recombinase के साथ मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक उत्पंन करने के लिए utero electroporation में का संयोजन परिचय । इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि एक नई माउस लाइन के लिए हर बार एक अलग सेलुलर उपप्रकार के लिए लक्षित किया जा रहा है उत्पंन करने की जरूरत नहीं है: utero electroporation में उत्तेजक न्यूरॉन्स, निरोधात्मक न्यूरॉन्स, या glia लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता समय पर निर्भर करता है और electroporation के स्थान15,16,17,18,19,20,21,३४. हमारे दृष्टिकोण में, मस्तिष्क प्रांतस्था लक्ष्यीकरण सुसंगत और प्रतिलिपि है क्योंकि हम 5 मिमी व्यास electroporation इलेक्ट्रोड है कि विकासशील telencephalon के एक बड़े क्षेत्र पर रखा जा सकता है का उपयोग करें । मस्तिष्क में वैकल्पिक साइटों को लक्षित करने के लिए (जैसे diencephalon, रेटिना), या मस्तिष्क प्रांतस्था के भीतर क्षेत्रों के अधिक विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए, प्रक्रियाओं और इस प्रयोजन के लिए स्पष्ट रूप से डिजाइन इलेक्ट्रोड15इस्तेमाल किया जा सकता है, 16. हम भी एक ही निर्माण प्रदान करते है कि उज्ज्वल लेबल प्रदान करता है और गारंटी देता है कि हर फ्लोरोसेंट-लेबल ंयूरॉन Cre recombinase शामिल हैं । उज्ज्वल लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए एक एकल निर्माण का उपयोग करने का एक नुकसान यह है कि लेबल वाली जनसंख्या भी सघन हो सकती है (चित्र 2c), लेकिन यह लेबल क्षेत्र (चित्रा 2d) की परिधि में इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा हल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट निर्माण की अभिव्यक्ति के लिए Cre recombinase अभिव्यक्ति पर निर्भर डिजाइन किया जा सकता है17, लेकिन कम अभिव्यक्ति स्तर फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए immunostaining की आवश्यकता हो सकती है । इस सीमा "सुपरनोवा" Cre-निर्भर फ्लोरोसेंट मार्कर अभिव्यक्ति (चित्र 3)23,24की प्रणाली द्वारा संबोधित किया है ।

utero electroporation में के साथ Cre-लोक्स पुनर्संयोजन के संयोजन के अलावा, हम समय पर गर्भवती महिलाओं के इष्टतम प्रजनन के लिए कई सुधार प्रदान करते हैं । यह एक होल्डिंग कमरे में चूहों कि लामिना प्रवाह डाकू के रूप में उपकरणों की वजह से शोर और कंपन से मुक्त है रखने के लिए महत्वपूर्ण है । प्लास्टिक igloos, घोंसले के साथ सामग्री, और सूरजमुखी के बीज की तरह पूरक आहार के साथ पर्यावरण को समृद्ध (सामग्री की सूची देखें) । पर्यावरण के अलावा विचार से, हमने देखा है कि एक महिला के पहले कूड़े आम तौर पर सबसे कम जीवित रहने की दर है । इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल utero electroporation में प्रदर्शन करने के लिए महिला की दूसरी गर्भावस्था तक इंतजार कर पता चलता है. हालांकि इस रणनीति कूड़े का अस्तित्व बढ़ जाती है, यह भी करने के लिए कूड़े का आकार बढ़ाने के लिए जाता है, जो शल्य समय लंबा और इस प्रकार शल्य चिकित्सा की सफलता कम कर सकते हैं । इसलिए, अगर भ्रूण की एक विशेष रूप से बड़ी संख्या का सामना (जैसे 8 से अधिक), हम भ्रूण में से कुछ पर electroporation लंघन सुझाव है, विशेष रूप से अंडाशय और गर्भाशय ग्रीवा के निकटतम भ्रूण, जहां ऊतक सबसे अधिक चोट का खतरा है । इसके अलावा, एक ही पर्यावरण संवर्धन ऊपर उल्लेख किया रणनीति का उपयोग (प्लास्टिक igloos, घोंसले के रूप में सामग्री, पूरक आहार) जंम के बाद कूड़े के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए जाता है । यह भी ध्यान रखना जरूरी है कि मद पहले कूड़े के प्रसव के कुछ घंटों बाद मादा में हो सकती है । इस मामले में, महिला को उसके दूसरे कूड़े को जंम देने के लिए अनुमति देते हैं, तो प्रातः के बाद अलग करने के लिए समय पर संभोग का प्रयास । जब योनि प्लग के लिए देख, यह अच्छा अभ्यास के लिए महिला भी अगर एक प्लग नहीं मिला है, विशेष रूप से अगर महिला मद में था पहले रात को अलग है । कुछ उपभेदों में प्लग के लिए जगह मुश्किल हैं, और गर्भाधान पहले से ही हुआ हो सकता है ।

सुधार का एक अंय क्षेत्र utero electroporation में के लिए पर्याप्त microinjection पिपेट के उत्पादन में है । पार्श्व निलय में डीएनए इंजेक्शन के लिए खींच पिपेट एक महत्वपूर्ण कदम है । यहां, हम एक सुसंगत टिप आकार और किसी न किसी टिप एज के साथ पिपेट स्थापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । अंय तरीकों में शामिल है एक स्केलपेल ब्लेड के साथ वापस टिप तोड़कर15 या संदंश16,17के साथ टिप बंद चुटकी । ध्यान दें कि अगर पिपेट सुझाव बहुत छोटे हैं, वे सही ढंग से गर्भाशय की दीवार पंचर होगा, लेकिन इंजेक्शन प्रवाह दर भी कम हो जाएगा, समय है जिसमें पिपेट भ्रूण मस्तिष्क में दर्ज की गई है लंबी । यदि पिपेट सुझाव बहुत बड़े हैं, वे गर्भाशय की दीवार और भ्रूण मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है । यदि पिपेट सुझाव भी चिकनी हैं, वे गर्भाशय की दीवार और/या भ्रूण खोपड़ी में एक बड़ी divot के माध्यम से तोड़ने से पहले कारण होगा, संभवतः भ्रूण हानिकारक । एक किसी न किसी ब्रेक बनाने के लिए एक 20-25 µm टिप का उत्पादन और एक सरल प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सुझावों का निरीक्षण (एक 10x उद्देश्य के साथउदाहरण के लिए) एक सुसंगत परिणाम जब तक हासिल की है । परीक्षण है कि तरल एक उचित दर पर pipetted जा सकता है (उदा. ~ ०.५ µ l/aspirator ट्यूब विधानसभा के साथ यह सुनिश्चित करना है कि टिप आकार एक स्वीकार्य सीमा के भीतर है की एक और विधि है । क्योंकि इंजेक्शन पिपेट पर तुले और एेसे होते हैं, पार्श्व निलय को दिए गए डीएनए की सही मात्रा ज्ञात होती है. यह परिमाण के एक आदेश के लिए एक वांछित विरल reproducibly को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है । दूसरे शब्दों में, एक दिया एकाग्रता एक विशेष रेंज के भीतर लेबलिंग उपज चाहिए, जैसे 10 से १०० लेबल ंयूरॉंस ।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम utero electroporation प्रक्रिया में है । अत्यंत कोमल हो, जबकि गर्भाशय को उजागर । जब उदर गुहा से बाहर पिछले भ्रूण खींच, अंडाशय या गर्भाशय ग्रीवा पर खींचने के लिए नहीं सुनिश्चित करें । microinjection और electroporation के दौरान अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग भ्रूण के कोमल, निपुण हेरफेर की अनुमति देता है पार्श्व निलय प्रकट और भ्रूण धीरे गर्भाशय की दीवार के खिलाफ धक्का दिया जा करने की अनुमति देता है । एक अत्यंत कोमल स्पर्श महत्वपूर्ण है जब गर्भाशय और भ्रूण से निपटने । यदि यह एक सज्जन स्पर्श को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, एक अंतर्निहित सीमा पेंच के साथ अंगूठी संदंश का उपयोग करने के लिए एक भ्रूण या गर्भाशय पर नीचे clamping से रोकने के संदंश, ऊतक क्षति के कारण । एक और विचार के लिए दोनों carprofen और buprenorphine तुरंत सर्जरी से पहले प्रशासन, एक अभ्यास है कि utero सर्जरी में के दौरान प्रभावी दर्द प्रबंधन प्रदान करने के लिए भ्रूण जीवित रहने की दर को प्रभावित किए बिना प्रतीत होता है३५ .

हमारे सरलीकृत ऊतकीय प्रक्रिया के बाद, कई कदम महत्वपूर्ण हैं । perfusing के बाद निर्धारण के साथ प्रयोगात्मक दिमाग, मस्तिष्क ऊतक को पद-निर्धारण के दौरान नुकसान से बचाने के लिए खोपड़ी में बरकरार रखें । यह सप्ताह के लिए दिन के लिए 1% पीएफए में मस्तिष्क की दुकान संभव है, जबकि प्रतिदीप्ति पीएफए समाधान polymerizes के रूप में कम हो जाएगा कि ध्यान दें । टुकड़ा करने की क्रिया १०० µm राज्याभिषेक वर्गों आम तौर पर काफी पतली के लिए पूरे खंड के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोप की अनुमति है, जबकि वृक्ष और axonal आकृति विज्ञान के बहुत संरक्षण । यदि निर्धारण ठीक से हुआ, P13 से पुराने पशुओं से दिमाग cyanoacrylate गोंद के साथ बस हिल microtome पर रखा जा सकता है । हालांकि, अगर मस्तिष्क भी लचीला है, जबकि हिल microtome द्वारा काटा जा रहा है, गोंद नीचे एक छोटा सा आगर या agarose ब्लॉक मस्तिष्क के पीछे इसे झुकने से रोकने के लिए जबकि यह खोदी जा रही है । यदि समस्या का समाधान नहीं है, तो एक ब्लॉक के रूप में हिल microtome के साथ कटौती करने के लिए आगर में मस्तिष्क एंबेड, के रूप में युवा प्रसव दिमाग के लिए सुझाव दिया (५.८ कदम) ।

इस विधि के साथ Cre-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली को जोड़ती है utero electroporation में क्रम में मोज़ाइक कि कोशिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन करने के लिए-ंयूरॉंस में जीन के स्वायत्त समारोह । इस विधि को भी जीन संपादन constructs (जैसे CRISPR/Cas9)6, या अंय साइट विशिष्ट recombinases (जैसे Flp/FRT या ड्रे/rox24) के utero electroporation में समर्थन करने के लिए कॉंफ़िगर किया जा सकता है, जो सभी हो सकता है मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक का उत्पादन करने के लिए बनाया गया. एक आशाजनक वैकल्पिक तकनीक है कि मोज़ेक ऊतक का उत्पादन किया जा सकता है नवजात चूहों को संवहन इंजेक्शन के माध्यम से वायरल डिलिवरी है३६। भ्रूण उंर में संवहन इंजेक्शन के साथ संयुक्त के रूप में यहां का प्रदर्शन किया और कहीं15,16,17,18,19,20, 21,22,३७, वायरल वैक्टर Cre recombinase के लिए कोडिंग वेंट्रिकुलर क्षेत्र में संक्रमित floxed जनक कोशिकाओं को जंम से पहले दिया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना होगा कि वायरल वैक्टर पर्याप्त रूप से पतला करने के लिए स्पार्स उत्पाद और लेबल को प्राप्त कर रहे हैं । हालांकि, यह भी निर्माण के कम कॉपी संख्या में परिणाम होगा, फ्लोरोसेंट neuroanatomical टिप्पणियों के लिए आवश्यक मार्करों सहित दिया जा रहाहै (जैसे वृक्ष spins या arborization)24। इस ख़तरा का मुकाबला करने के लिए, नए "सुपरनोवा" के रूप में एक ही रणनीति का उपयोग constructs यहां का प्रदर्शन किया लेबल के लिए एक इसी कमी की चमक में बिना लेबल स्पार्स प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है24। वायरल प्रसव के साथ एक और महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना है कि वितरित निर्माण सेल जनसंख्या के लिए विशिष्ट प्रवर्तक है (जैसे उत्तेजक पिरामिड ंयूरॉंस) का अध्ययन किया जा रहा है । वायरल वैक्टर के संवहन इंजेक्शन निलय आसपास के सभी ऊतक के संक्रमण का कारण बनता है, न केवल पृष्ठीय telencephalon के वेंट्रिकुलर क्षेत्र सहित जहां cortical और हिप्पोकैम्पस उत्तेजक न्यूरॉन्स उत्पन्न कर रहे हैं, लेकिन यह भी औसत दर्जे का और पार्श्व ganglionic eminences जहां कई cortical न्यूरॉन्स पैदा होते हैं३४. constructs की वायरल डिलिवरी की तुलना में utero electroporation में की एक और विशेषता यह प्रसव के अपेक्षाकृत संकीर्ण समय खिड़की है । पार्श्व निलय में इंजेक्शन वायरस सर्जरी के बाद कायम रह सकते हैं, वेंट्रिकुलर क्षेत्र अस्तर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए जारी. इसके विपरीत, electroporation कक्षों के किसी कहीं अधिक विशिष्ट सेट को लक्षित करते हुए सेकंड में होती है. यह एक फायदा या जांचकर्ता को नुकसान हो सकता है, कोशिकाओं की उपजनसंख्या पर निर्भर करता है अध्ययन किया जाना है ।

हमारे दृष्टिकोण या तो एक भी निर्माण या "सुपरनोवा" का निर्माण की शुरूआत से Cre-लोक्स पुनर्संयोजन का समर्थन करता है । "सुपरनोवा" निर्माण के मामले में, हम जांचकर्ताओं से आग्रह करता हूं कि इस रणनीति का उपयोग करने के फायदे और सीमाओं से परिचित हो । उदाहरण के लिए, Cre विलोपन के समय परत द्वितीय में 2 दिनों के भीतर होने के लिए प्रदर्शन किया गया है/III उत्तेजक न्यूरॉन्स के सेरेब्रल प्रांतस्था24. इस प्रकार, यह है कि Cre उत्पाद ४८ ज निंनलिखित electroporation पर हो सकता है, के बजाय तुरंत electroporation निंनलिखित प्रशंसनीय है । इसलिए, corroborating समय और Cre उत्पाद के स्थान के अंय रूपों (एक Cre रिपोर्टर माउस लाइन का उपयोगउदा ) इस नई तकनीक के उपयोग के पूरक के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, विशेष रूप से अध्ययन में जहां एक छोटी सी समय सीमा के भीतर Cre उत्पाद शुल्क एक महत्वपूर्ण है विचार. एक अंय संभावित ख़तरा है कि एक "सुपरनोवा" प्रयोग में unलेबल्ड कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत Cre recombinase व्यक्त कर सकता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 3में, हम सह-electroporated दो plasmids: सीएजी-loxP-स्टॉप-loxP-EGFP-आयरेस-tTA-WPRE की एक उच्च एकाग्रता, और TRE-Cre की कम एकाग्रता । क्योंकि TRE एक टपका हुआ प्रमोटर है, Cre recombinase कोशिकाओं है कि TRE-Cre प्लाज्मिड लेकिन नहीं loxP-stop-loxP-EGFP-tTA प्लाज्मिड प्राप्त में व्यक्त किया जा सकता है, हालांकि यह एक दुर्लभ घटना होगी । एक प्रयोग में यह आवश्यक है कि सभी अनलेबल्ड कोशिकाओं के पास कोई Cre-मध्यस्थता उत्पाद जो भी हो, एक "सुपरनोवा" प्रयोग में नियंत्रण प्रयोग के साथ पूरक होने की आवश्यकता हो सकती है जिसमें लेबल न्यूरॉन्स के बाहर Cre recombinase अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया जाता है अन्य साधनों के माध्यम से (उदा. Cre recombinase immunohistochemistry).

संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल आसानी से इन नए निर्माणों को समायोजित संशोधित है, utero में बना electroporation एक और भी उपयोगी मोज़ेक विश्लेषण के लिए अनुकूल तरीका है । इस प्रकार, utero electroporation में vivo मेंमोज़ेक मस्तिष्क ऊतक का अध्ययन करने के लिए कई मायनों में आनुवंशिक पुनर्संयोजन की शक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय जीवविज्ञान विभाग और जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा के उदार समर्थन का धंयवाद । डॉ मार्क एल गैब्रिएल युवा प्रसव ऊतक तैयारी के बारे में उपयोगी सलाह के लिए, और डीआरएस । सर्जिकल सामग्री और अंतरिक्ष के उदार समंवय के लिए जस्टिन डब्ल्यू ब्राउन और कोरी एल Cleland । इस शोध के हिस्से में 4 द्वारा एक सहयोगी अनुसंधान अनुदान-VA, वर्जीनिया के राष्ट्रमंडल (G.S.V.) के आगे बढ़ने के लिए एक सहयोगी भागीदारी द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और विज्ञान लघु परियोजना अनुसंधान अनुदान (G.S.V.) के एक वर्जीनिया अकादमी द्वारा । समर्थन उदारता स्नातक अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए एक बेटी जो प्यार ' बटलर ५८ बंदोबस्ती द्वारा प्रदान की गई है (K.M.B.), एक Farrell ग्रीष्मकालीन अनुसंधान छात्रवृत्ति (K.M.B. के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय दूसरी सदी छात्रवृत्ति (K.M.B. के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय सौ छात्रवृत्ति (C.J.H. करने के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय लुसी रॉबिंसन ' खोज 30 मेमोरियल छात्रवृत्ति (Z.L.H. के लिए), और एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय विज्ञान और गणित संकाय सहायता अनुदान के कॉलेज (G.S.V. के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

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References

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Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).More

Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).

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