कोशिका-मस्तिष्क में जीन के स्वायत्त कार्यों उत्प्रेरण नुकसान या कोशिकाओं की विरल आबादी में समारोह का लाभ द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । यहां, हम utero electroporation में वर्णन करने के लिए cortical के साथ floxed ंयूरॉंस के विकास के विरल आबादी में Cre recombinase देने के जीन vivo मेंसमारोह के नुकसान का कारण है ।
सेल-जीन के स्वायत्त ंयूरॉंस कार्य हानि या ंयूरॉंस की एक छोटी और विरल जनसंख्या में एक जीन के समारोह के लाभ के कारण से पता चला जा सकता है । ऐसा करने के लिए एक मोज़ेक जो एक जीन के नुकसान या समारोह के लाभ के साथ ंयूरॉंस में आनुवंशिक रूप से बेफिक्र ऊतक से घिरे है पैदा करने की आवश्यकता है । यहां, हम utero electroporation में के साथ Cre-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली गठबंधन के क्रम में मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक है कि सेल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन करने के लिए-ंयूरॉंस में जीन के स्वायत्त समारोह । डीएनए constructs (खजाने के माध्यम से उपलब्ध है), एक फ्लोरोसेंट लेबल और Cre recombinase के लिए कोडिंग, cortical माउस के दिमाग में loxP साइटों के साथ निहित जीन युक्त के विकास में पेश कर रहे है utero में प्रयोग भ्रूण electroporation । इसके अतिरिक्त, हम utero electroporation विधि में विभिन्न रूपांतरों का वर्णन करते हैं जो बचे हुए और reproducibility को बढ़ाते हैं । इस विधि भी न्यूरॉन्स की एक विरल या घने जनसंख्या में Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के लिए एक titer की स्थापना शामिल है. लेबल मस्तिष्क ऊतक की ऊतकीय तैयारी की आवश्यकता नहीं है (लेकिन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है) immunohistochemistry । निर्माण की गारंटी है कि फ्लोरोसेंट लेबल ंयूरॉंस Cre recombinase के लिए जीन ले इस्तेमाल किया । ऊतकीय तैयारी वृक्ष और axonal arbors और वृक्ष spins के फोकल इमेजिंग के माध्यम से ंयूरॉंस के रूपात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं । क्योंकि हानि या समारोह के लाभ विरल मोज़ेक ऊतक में हासिल की है, इस विधि सेल स्वायत्त आवश्यकता और vivo मेंजीन उत्पादों की प्रचुरता के अध्ययन परमिट ।
एक आनुवंशिक मोज़ेक सृजन ब्याज की एक जीन के समारोह को समझने के लिए एक क्लासिक प्रयोगात्मक प्रतिमान है । यदि एक जीन एक सेलुलर phenotype के लिए आवश्यक है यह निर्धारित करने के लिए, सरल दृष्टिकोण जीव भर में जीन के समारोह की हानि पैदा कर रहा है (जैसे नॉकआउट) । हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए यदि एक जीन विशेष रूप से एक निश्चित कोशिका प्रकार में आवश्यक है, जीव भर जीन की नॉकआउट एक वैध दृष्टिकोण नहीं है । इसके बजाय, एक विधि की आवश्यकता है कि किसी दिए गए कक्ष में एक जीन के समारोह के नुकसान का कारण है जबकि यह wildtype (यानी आनुवंशिक रूप से बेफिक्र) ऊतक-दूसरे शब्दों में, मोज़ेक ऊतक बनाने से घिरा हुआ है । यदि उत्परिवर्ती सेल एक उत्परिवर्ती phenotype से पता चलता है, लेकिन आसपास के wildtype कोशिकाओं नहीं है, एक सेल में जीन कार्य स्वायत्त तरीके से । मोज़ेक ऊतक के विश्लेषण, जिसमें उत्परिवर्ती कोशिकाओं wildtype ऊतक से घिरे रहे हैं, कोशिका को समझने के लिए आदर्श है-जीन के स्वायत्त कार्यों, विशेष रूप से मस्तिष्क में जहां ंयूरॉंस और glia फार्म ऊतक के एक विशाल परस्पर जुड़े नेटवर्क ।
मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक के कई रूपों शक्तिशाली मॉडल की जांच करने के लिए सेल-जीन के स्वायत्त कार्यों प्रदान की है । अध्ययन ंयूरॉन प्रत्यारोपण1, महिला एक्स से जुड़ा हुआ मोज़ेक2,3,4, और अंतर्जात दैहिक मोज़ेक5,6 तैयार किया है पर ध्यान केंद्रित मोज़ेक के आधार पर अपने निष्कर्ष मस्तिष्क ऊतक । Cre-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली के माध्यम से एक जीन के सशर्त विलोपन एक तरीका है कि ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की महान उपलब्धता का पूरा फायदा लेता है । इस विधि में, दो loxP साइटों को एक जीन की एक आवश्यक अनुक्रम के दोनों ओर से पेश कर रहे है (जैसे एक एक्सॉन के रूप में), यह loxP साइटों कि दोनों एक ही दिशा में चेहरा (“floxed”) द्वारा पार्श्व जा । Cre recombinase loxP साइटों के बीच परिक्रमा7एक्साइज । Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन से प्राप्त किया जा सकता है floxed चूहों को पार करने के लिए एक और माउस लाइन के साथ व्यक्त Cre recombinase एक सबसेट में एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ कोशिकाओं (“Cre रिपोर्टर लाइन”). इस तरह के उत्तेजक ंयूरॉंस या astrocytes8के रूप में कोशिकाओं के सबसेट में एक जीन के कार्यों को उजागर करने के तरीके की एक किस्म में प्रदर्शन किया गया है । Cre रिपोर्टर लाइनों CreERटी 2 व्यक्त करने के लिए Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन की अनुमति के लिए दवा-inducible (एकल-ंयूरॉन inducible Cre के साथ लेबलिंग-पीटा, या चालाक)9सकता है । एक और डबल मार्करों (MADM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण बुलाया रणनीति में10,11, Cre-interchromosomal पुनर्संयोजन मध्यस्थता एक homozygous उत्परिवर्ती heterozygous ऊतक के साथ बनाया जा करने की अनुमति देता है । इन दृष्टिकोणों में, चूहों की एक नई लाइन प्रत्येक उंमीदवार जीन या सेलुलर उपप्रकार है कि परीक्षण के लिए हर बार उत्पादन किया जा की जरूरत है । वैकल्पिक रूप से, Cre recombinase iontophoresis12 के माध्यम से या वायरल वैक्टर के माध्यम से postnatally पेश किया जा सकता है (उदा. adeno-जुड़े वायरस13 या lentiviruses14 सेलुलर उपप्रकार-विशिष्ट ले प्रवर्तक). यह रणनीति मजबूत और प्रसव लेबलिंग बनाता है । सेरेब्रल cortical न्यूरॉन्स के विकास को लक्षित करने के लिए विरल और एक आदर्श रणनीति एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ Cre recombinase के utero electroporation में है.
vivo मेंमोज़ेक ऊतक का उत्पादन करने के लिए utero electroporation में के माध्यम से Cre-लोक्स संयोजन के संयोजन के अलावा, हम अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल से प्रक्रियाओं के लिए कई रूपांतरों परिचय15,16, 17,18,19,20,21. हम प्रजनन समय-गर्भवती महिलाओं में सफलता में सुधार करने के लिए जानकारी प्रदान करते हैं । हम भी हमारे दो रणनीतियों cortical ऊतक में ंयूरॉंस की विरल और उज्ज्वल लेबलिंग परिचय के लिए रूपरेखा: एक रणनीति Cre recombinase और एक फ्लोरोसेंट मार्कर22के लिए एक एकल निर्माण कोडिंग के स्तर अनुमापन है । एक अंय रणनीति के लिए “सुपरनोवा” प्रणाली,23,24मन में इन मापदंडों के साथ विशेष रूप से डिजाइन का उपयोग है । इसके अतिरिक्त, हम utero electroporation सर्जरी में अनुरूप microinjection पिपेट और सरलीकरण के उत्पादन पर सुधार की पेशकश करते हैं । अंत में, हम एक सरलीकृत ऊतकीय तैयारी में महत्वपूर्ण कदम है कि वृक्ष spins और वृक्ष और axonal arbors, आगे धुंधला या immunohistochemistry बिना के विश्लेषण परमिट की रूपरेखा ।
यहां, हम floxed चूहों में Cre recombinase के साथ मोज़ेक मस्तिष्क ऊतक उत्पंन करने के लिए utero electroporation में का संयोजन परिचय । इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि एक नई माउस लाइन के लिए हर बार एक अलग सेलुलर उपप्रकार के लिए लक्षि?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय जीवविज्ञान विभाग और जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा के उदार समर्थन का धंयवाद । डॉ मार्क एल गैब्रिएल युवा प्रसव ऊतक तैयारी के बारे में उपयोगी सलाह के लिए, और डीआरएस । सर्जिकल सामग्री और अंतरिक्ष के उदार समंवय के लिए जस्टिन डब्ल्यू ब्राउन और कोरी एल Cleland । इस शोध के हिस्से में 4 द्वारा एक सहयोगी अनुसंधान अनुदान-VA, वर्जीनिया के राष्ट्रमंडल (G.S.V.) के आगे बढ़ने के लिए एक सहयोगी भागीदारी द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और विज्ञान लघु परियोजना अनुसंधान अनुदान (G.S.V.) के एक वर्जीनिया अकादमी द्वारा । समर्थन उदारता स्नातक अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए एक बेटी जो प्यार ‘ बटलर ५८ बंदोबस्ती द्वारा प्रदान की गई है (K.M.B.), एक Farrell ग्रीष्मकालीन अनुसंधान छात्रवृत्ति (K.M.B. के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय दूसरी सदी छात्रवृत्ति (K.M.B. के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय सौ छात्रवृत्ति (C.J.H. करने के लिए), एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय लुसी रॉबिंसन ‘ खोज 30 मेमोरियल छात्रवृत्ति (Z.L.H. के लिए), और एक जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय विज्ञान और गणित संकाय सहायता अनुदान के कॉलेज (G.S.V. के लिए) ।
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |