두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.
유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.
유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.
여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,3,4에 집중 하 고 내 생 신체적인 mosaicism5,6 그린 모자이크에 따라 그들의 결론 뇌 조직입니다. 조건부 삭제 Cre lox 재결합 시스템을 통해 유전자의 유전자 변형 마우스 라인의 좋은 가용성을 최대한 활용 하는 방법입니다. 이 방법에서는, 2 개의 loxP 사이트 loxP 사이트 같은 방향으로 (“floxed”)에서 두 얼굴을 있는 그것을 떠나 (예:는 exon), 유전자의 필요한 시퀀스의 양쪽에 소개 된다. Cre recombinase loxP 사이트7사이 시퀀스 excises. Cre 중재 재결합 Cre recombinase 셀 (“Cre 기자 선”)의 하위 집합에서 형광 표식 함께 표현 하는 또 다른 마우스 라인을 건너 floxed 마우스에 의해 얻을 수 있습니다. 이 다양 한 방법으로 흥분 성의 뉴런 등 이다8셀의 하위 집합에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 입증 되었습니다. Cre 기자 라인 Cre 중재 재결합 마약을 유도할 수 있는 (단일 신경 라벨 유도할 수 있는 Cre 중재 녹아웃 또는 매끄러운) 될 수 있도록 있다T2 를 표현할 수 있습니다9. 다른 전략 이라는 이중 표식 (MADM)10,11모자이크 분석, Cre 중재 interchromosomal 재결합 homozygous 돌연변이 heterozygous 조직 함께 만들 수 있습니다. 이러한 방식에서 쥐의 새로운 라인 각 후보 유전자 또는 세포 하위 테스트에 대 한 각 시간 제작 될 필요가 있다. 또는, Cre recombinase 소개 될 수 있다 postnatally 또는 바이러스 성 벡터 (예를들면 adeno 관련 바이러스13 또는 lentiviruses14 셀룰러 하위 형식 관련 운반 iontophoresis12 통해 발기인)입니다. 이 전략 강력 하 고 산 후 라벨을 만듭니다. 대뇌 피 질 뉴런을 띄엄띄엄 prenatally 개발 대상으로 이상적인 전략의 형광 표시와 함께 Cre recombinase electroporation utero에 입니다.
Cre lox 재결합 electroporation utero에서 생성을 통해 결합 뿐만 아니라 vivo에서조직 모자이크, 다른 게시 프로토콜15,,16에서 프로시저에 여러 각 색 한 소개 17,,1819,,2021. 우리는 사육 타임-임신 여성에서 성공을 개선 하는 정보를 제공 합니다. 우리 또한 우리의 두 전략 스파스 하 고 밝은 대뇌 피 질의 조직에서 뉴런의 라벨을 소개 하는 개요: 하나의 전략 Cre recombinase 및 형광 마커22단일 구문을 코딩의 수준을 적정 하는 것입니다. 또 다른 전략 마음23,24에 이러한 매개 변수를 특별히 설계 된 “초신성” 시스템을 사용 하는 것입니다. 또한, 생산 하는 일관 된 microinjection 펫 및 단순화에 utero electroporation 수술에 개선을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 더 얼룩 또는 immunohistochemistry 없이 모 수석 등뼈와 수지상 및 axonal 아 버의 분석을 허용 하는 간단한 조직학 준비에서 중요 한 단계를 개요.
여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,16</s…
The authors have nothing to disclose.
저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ‘ 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ‘ 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |