Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forbigående udtryk af fremmede gener i insekt celler (sf9) for Protein funktionel analyse

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Denne protokol beskriver en heat shock-induceret protein udtryk system (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system), som kan bruges til enten at udtrykke fremmede proteiner eller evaluere det anti-apoptotiske aktivitet af potentielle udenlandske proteiner og deres afkortet amino syrer i insekt celler.

Abstract

Forbigående gen expression system er en af de vigtigste teknologier til at udføre protein funktionel analyse i baculovirus i vitro celle kultur system. Dette system blev udviklet for at udtrykke fremmede gener under for baculoviral i forbigående udtryk plasmider kontrol. Dette system kan endvidere anvendes til en funktionel analyse af enten baculovirus selv eller fremmede proteiner. Mest almindeligt og kommercielt tilgængelige forbigående gen expression system er udviklet baseret på umiddelbar-tidlig gen (IE) promotor af Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Men en lav udtryk niveau af fremmede gener i insekt celler blev observeret. Derfor, en forbigående gen expression system blev bygget for at forbedre protein udtryk. I dette system, var rekombinant plasmider konstrueret til at indeholde mål sekvens under kontrol af Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promotor. Denne protokol udgør anvendelsen af dette heat shock-baserede pDHsp/V5-hans (V5 epitop med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) system; Dette system er ikke kun tilgængelig for genekspression men også for at vurdere den anti-apoptotiske aktivitet af kandidat proteiner i insekt celler. Desuden, dette system kan være enten transfekteret med en rekombinant plasmid eller co transfekteret to potentielt funktionelt antagonistiske rekombinant plasmider i insekt celler. Protokollen viser systemets effektivitet og giver en praktisk sagen om denne teknik.

Introduction

To protein udtryk systemer har været almindeligt anvendt til fremstilling af proteiner: prokaryot protein udtryk systemer (Escherichia coli gen expression system) og eukaryote protein udtryk systemer. En populær eukaryote protein udtryk system er baculovirus udtryk vektor system (BEVS)1. Baculoviruses blev først brugt som verdensomspændende biologisk kontrol agenser af landbrugs og skov skadedyr. I de sidste par årtier, var baculoviruses udviklet som bioteknologiske værktøjer til protein udtryk vektorer så godt. Genomer af baculoviruses består af dobbelt-strenget cirkulære DNA og indhyllede nucleocapsids2. Til dato har mere end 78 baculovirus blevet isolater sekventeret3. Baseret på den tidsmæssige kaskade af baculoviral gen udtryk i værtsceller insekt, kan gen transskription inddeles i fire tidsmæssige cascades, deriblandt øjeblikkelig-tidlig, forsinket-begyndelsen, slutningen og meget sent gener4.

BEVSs blev udpeget, således at de meget sent gen initiativtagere (dvs, polyeder eller p10 promotor) blev brugt til at drive mål gener, mens den rekombinante baculovirus blev genereret af homologe rekombination. Udtryk for fremmede proteiner i insekt celler af rekombinante baculovirus der ligner pattedyr proteiner i posttranslationelle modifikationer (velegnet til glycoprotein produktion). Således, at baculovirus har været udbredte5,6,7. Dog er en begrænsning tilstedeværelsen af forskellige N-glykosylering veje i insekt celler7.

Derfor blev en ny baculovirus ekspressionssystem, ekspressionssystem forbigående gen udviklet. Dette system giver udtryk for fremmede gener under kørsel af baculoviral umiddelbare-tidlig initiativtagere (dvs 1 promotor) i insekt celler. Ved hjælp af dette system, kan target proteinet være straks udtrykt under kontrol af ie-1 promotor mens du ændrer N-glykosylering pathway i insekt celler, hvilket resulterer i bedre N-linked oligosaccharider7. Desuden baculoviral umiddelbare-tidlige gener er transskriberet af cellen vært RNA polymerase II og kræver ikke nogen viral faktor for aktivering4. Derfor, fremmede proteiner kan udtrykkes i insekt celler inden for kort tid. Til dato, forbigående er gen expression system en af de vigtigste teknologier til at udføre protein funktionelle assays i baculovirus i vitro celle kultur system. Systemet kan anvendes til at analysere funktionen af enten baculovirus eller fremmede proteiner. En af de kommercielt tilgængelige forbigående gen expression systemer er baseret på umiddelbar-tidlig gen (IE) initiativtagerne til Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 og OpIE1 projektledere).

Den lavere udtryk niveau af fremmede gener i insekt celler var imidlertid stadig et problem når OpIE promotor-baserede forbigående gen expression system blev brugt8,9,10. Således, en anden forbigående gen expression system blev bygget baseret på promotor af Drosophila heat shock protein 70 (hsp70) gen8,9. Promotor af hsp70 arbejder mere effektivt end baculoviral IE promotor når induceret af heat shock i insekt celler10. I dette system, var målet gener udtrykt under kørsel af Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promotor. Fremmede gener kan klones nemt i forbigående gen expression plasmid af PCR-baseret kloning metoder. Endvidere kan foretages kontrol af timing for genekspression af heat shock induktion.

I denne betænkning, vi følger tilgangen og udtrykke tre forskellige udeladelser af baculoviral-genet (hæmmer af apoptose 3, iap3 fra Lymantria xylina MNPV) ved hjælp af heat shock-baserede forbigående protein udtryk system og yderligere gælde disse udtrykte proteiner på anti-apoptotiske aktivitet analyse. Dette system kan enten udtrykke fremmede proteiner hurtigt eller påføres yderligere evaluering af protein anti-apoptotiske aktivitet i sf9 celler, mens der også har potentiale til at blive anvendt til andre protein aktivitet assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. Insekt cellekultur
    1. Forberede 50 mL i cellekulturmedium. Det gør tilføje 500 µL af antibiotika (Amphotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 enhed/mL, Streptomycin = 100 µg/mL) og 5 mL af varme-inaktiverede føtal bovint serum i serumfrit cellekulturmedium (uden FBS eller antibiotika).
      Bemærk: Varme den føtale bovint serum på 65 ° C i 30 minutter i et bad med vand før brug.
    2. Vedligeholde Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), sf9 insekt celler. Frigøre ca. 80% af celler fra 25 cm2 celle kultur kolben ved at ryste kolben og tjekke under lysmikroskopi. Derefter overføres 50% af cellesuspension til en ny 25 cm2 celle kultur kolbe og tillade cellerne til at vedhæfte i 15 min. ved stuetemperatur. Udskift mediet med 5 mL frisk cellekulturmedium og vokse i en inkubator ved 28 ° C. Passage celler hver 2-3 dage afhængig af cellevækst.
  2. Forberedelse af plasmider for celle Transfektion
    1. Indsæt target DNA fragmenter (f.eks. Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen og dens sletning konstruktioner) i pDHsp/V5-hans af PCR-baseret kloning metode11. Tjek vækst af transformerede kolonier koloni PCR ved hjælp af PCR Master Mix (2 X) og pDhsp-F2/Op-IE2R primer sæt. Bekræfte plasmid sekvenser af kommercielle sekventering service.
      Bemærk: Tabel 1 viser de primere, der anvendes til PCR og de tilsvarende konstruktioner.
    2. Kultur indre sekventeret bakteriel kolonier, som indeholder ovennævnte plasmid konstruktioner (trin 1.2) i 200 mL LB medium indeholdende valgt antibiotika (50 µg/mL), henholdsvis.
    3. Uddrag plasmider fra den kulturperler E. coli ved hjælp af Midi Plasmid Kit ifølge producentens instruktioner12.
  3. Forberede plating medium ved at blande 1,5 mL i cellekulturmedium og 8,5 mL serumfrit cellekulturmedium.
  4. Forbered Actinomycin D (ActD) cellekulturmedium ved at tilføje 1,5 µL af ActD materiel (1 mg/mL) i 10 mL i cellekulturmedium (slutkoncentration = 150 ng/mL). Opbevares ved 4 ° C.

2. protein forbigående udtryk

  1. Celle såning
    1. Høste sf9 cellerne ved at ryste kultur kolbe, vælte og falder cellesuspension til 50 mL tube, og overføre 10 µL til hemocytometer af P10 pipette. Antal celle under et lysmikroskop.
    2. Plade 3 × 105 sf9 celler i hver brønd i en 24-godt plade i 15 min. ved stuetemperatur. Udskift mediet med 0,5 mL plating medium.
  2. Transfektion af plasmider
    1. Fortyndet celle Transfektion reagens: Fortynd 8 µL af celle Transfektion reagens i 100 µL serumfrit cellekulturmedium og mix af vortexing for 1 s.
    2. Tilføj 2 µg af plasmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans) i 100 µL af serumfrit cellekulturmedium og mix af vortexing for 1 s (figur 2).
    3. Kombiner den fortyndede plasmid DNA og fortyndet celle Transfektion reagens (210 µL), og bland af vortexing for 1 s. Incubate i 30 min. ved stuetemperatur.
    4. Tilføje 210 µL DNA Transfektion reagens blandingen dråbevis på cellerne med P1000 pipette. Inkuber ved 28 ° C i 5 h.
    5. Erstatte plating medium med 0,5 mL i cellekulturmedium ved hjælp af en P1000 pipette. Forsegle den 24-godt plade med tape og inkuberes celler ved 28 ° C i 16 h.
  3. Heat shock de transfected celler: sætter pladen i et 42 ° C vandbad (flyder på vandoverfladen). Opvarmes i 30 min og vende tilbage den 24-godt plade til 28 ° C inkubator.
  4. Påvisning af protein udtryk
    1. Efter 1 time eller 5 h heat shock, vaske cellerne med 0,5 mL af 1 x PBS buffer kort tre gange.
      Bemærk: Fortynde 10 x PBS buffer til 1 x PBS buffer ved tilsætning af 1 mL af 10 x PBS buffer til 9 mL steriliseret ddH2O
    2. Lyse celler med 40 µL 1 x SDS lastning farvestof af pipettering op og ned.
      Bemærk: Fortynd 4 x SDS lastning farvestof ved at blande 30 µL 1 x PBS buffer og 10 µL af 4 x SDS prøvebuffer.
    3. Varme protein prøver på 98 ° C i 10 min i en varme blok, spin ned til 1 min og lagt på is til vestlige skamplet assay.
    4. Western blot analysen
      Følg proceduren for Western blot analysen fra Eslami og Lujan13. Køre SDS-PAGE geler14: en gel underkastes Coomassie blå farvning (lastning kontrol for at kontrollere, at mængden af protein prøver indlæst i hver godt er lig i mængde) og den anden underkastes Western blot analyse, ifølge Eslami og Lujan13 .
    5. Opdage V5-mærkede fusion proteiner med kanin anti-V5 antistof (5 mg/mL) (1:5000 fortynding i TBST buffer til arbejder koncentration 1 µg/mL) og ged anti-kanin IgG-peberrod peberrodsperoxidase (HRP) konjugat (0,8 mg/mL) (1: 10000 fortynding i TBST buffer at arbejde koncentration 0,08 µg/mL).
      Bemærk: Justere procentdelen af polyacrylamid til 17,5% når protein molekylvægt at være < 17 kDa.

3. anti-apoptotiske aktivitet assay

  1. Gen-induceret celle apoptose: Gentag den ovennævnte fremgangsmåde fra 2.1 til 2.3. Co transfect 1 µg for pDHsp/D-rpr/FLAG-hans plasmid DNA (indeholdende apoptose inducer gen) med 1 µg af plasmid DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontrol), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, hhv.]. Under 5 h efter varme chokbehandling, gennemføre celle levedygtighed assay (figur 2).
  2. Kemiske-induceret celle apoptose: Gentag den ovennævnte fremgangsmåde fra 2.1 til 2.3. Taktfast 2.1.2 plade 1 x 106 sf9 celler i hver brønd i en 6-godt plade. Transfect 4 µg af plasmid DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontrol), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, hhv.]. På 5 h efter varme chok, behandle sf9 celler med 2 mL af ActD cellekulturmedium for 16 h og gennemføre celle levedygtighed assay (figur 2).
    Bemærk: Minimum mængde til at dække et godt 6-godt plade er 1 mL.
  3. Udføre i ovenfor anti-apoptotiske aktivitet assay eksperimenter, herunder 3.1 og 3.2 i tre.

4. celle levedygtighed assay

  1. Vask de behandlede celler ved tilsætning af 1 mL af 1 x PBS buffer for 1 min 3 gange. Resuspend cellerne når der afpipetteres 1 mL 1 x PBS buffer indeholdende 0,04% trypan blå og plet til 3 min. ved stuetemperatur. Overføre cellesuspension til en 1,5 mL microtube.
    Bemærk: Fortynd 0,4% trypan blå løsning ved at blande 9 mL 1 x PBS buffer og 1 mL 0,4% trypan blå løsning.
  2. Overfør 10 µL trypan blå-farvede cellesuspension til hemocytometer med en P10 pipette og tælle de levedygtige intakte celler under et lysmikroskop.
  3. Statistisk analyse
    1. Beregne den registrerede data og præsentere som middel ± S.D. for alle tæller.
    2. Analysere data ved hjælp af Students to-sidede t-test af med Microsoft Excel. Definere statistisk signifikante data som P-værdien < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den fulde længde og andre to udeladelser (BIR og RING domæner) af Ly-IAP3 fra LyxyMNPV blev overexpressed i sf9 celler, baseret på den varme chok-baserede pDHsp/V5-hans /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) system. PDHsp/V5-hans indeholdt en Drosophila heat shock protein promotor, som drev nedstrøms genekspression ved en temperatur på 42 ° C tilstand ved hjælp af cellulære transcriptional faktorer og oversættelse systemet (figur 1)8 ,9,11. Det hele teknologiske rutediagram er vist i figur 2. Efter 1 time eller 5 h heat shock, blev cellerne mængden med protein prøvebuffer og underkastes Western blot analysen at bekræfte protein udtryk. Resultaterne er angivet at de fuld længde proteiner, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR og Ly-IAP3-RING, kunne påvises i transfekteret celler på enten 1 h eller 5 h efter varme chok. Desuden fandtes protein ophobninger på 5 h efter heat shock (figur 3). Ifølge data, blev protein funktionel analyse udført for maksimal protein udtryk tidspunkt (5 h efter varme chok).

Både gen-induceret celle apoptose og kemiske-induceret celle apoptose kunne tilpasses til dette system til evaluering af anti-apoptotiske aktivitet (figur 2). For gen-induceret celle apoptose var to konstruktioner (apoptose inducer og target gen plasmid konstruktioner) Co transfected ind i sf9 celler og derefter varme chokeret over at activite genekspression. Desuden, det anti-apoptotiske protein Ac-P35 (positiv kontrol) og en apoptose-inducer protein (D-RPR) blev også udtrykt ved hjælp af dette heat shock forbigående udtryk system.

Efter varme chok begyndte begge gener at blive udtrykt og omsættes til proteiner. I forhold til vektor/D-RPR, den positive kontrol (Ac-P35/D-RPR) viste høj anti-apoptotiske aktivitet, som nåede op til 80% af satsen, levedygtighed. Fra celle levedygtighed resultaterne af de andre konstruktioner, kunne forskerne sammenligne anti-apoptotiske aktivitet til hinanden eller den positive kontrol (figur 4A). For kemiske-induceret celle apoptose, var kun én konstruktion transfekteret i sf9 celler. Efter 5 h efter varme stød, kemikalier (ActD) blev tilføjet, og cellernes levedygtighed blev målt efter 16 h (figur 2). Sammenlignet med den positive kontrol (AC-P35) eller den negative kontrol (vektor), hver konstruere viste de forskellige effekter på anti-apoptotiske aktivitet (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Diagram og nukleotid-sekvenser af ly-iap3 relative plasmid konstruktioner baseret på pDHsp/V5-hans vektor. Start codon (ATG) er vist i fed skrift. Understregningen angiver begrænsning enzym skæring websteder (HindIII i rød farve; BamHI i blå farve); sekvens i grøn farve angiver Dhsp70 promotor-regionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: flowdiagram af heat shock induceret protein ekspressionssystem (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system). Gen-induceret celle apoptose og kemiske-induceret celle apoptose behandlinger var angivet til de indledende trin (co Transfektion med apoptose inducer gen plasmid) eller til de senere trin efter heat shock (kemiske-induceret apoptose), henholdsvis, for anti-apoptose assay. Modificerede figur og legende gengivet med tilladelse fra Springer11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: overekspression af AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR og Ly-IAP3-RING ved hjælp af heat shock induceret protein ekspressionssystem (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system). På 1 h eller 5 h post heat shock, var cellelysater høstet og udsat for Western blot analysen og SDS/side. (A) vestlige skamplet assay med α-V5 antistof og (B) SDS/side farves med Coomassie blå som kontrolelementet lastning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levedygtighed undersøgelser for D-rpr eller Actinomycin D-induceret apoptose. (A) sf9 celler blev transfekteret med pDHsp70/V5-hans vektor (kun vektor) og co transfekteret pDHsp70/drpr/FLAG-hans med pDHsp70/V5-hans vektor, pDHsp70/Ac-P35/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70 / Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis. Forskelle mellem vektor og P35 og vektor og Ly-IAP3 er statistisk signifikant (t-test; P < 0,05). (B) sf9 celler blev transfekteret med enten pDHsp70/V5-hans vektor eller pDHsp70/Ac-P35/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis på 5 h efter varme chok, ActD blev tilføjet og 16 h senere, cellernes levedygtighed blev målt. Forskellen mellem vektor og P35 er statistisk signifikant (t-test; P < 0,05). Modificerede figur og legende gengivet med tilladelse fra Springer11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Sekvenser
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
iap3-BIR-BamHI-r 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´
iap3-RING-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
Op-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tabel 1: primer sæt anvendes til PCR-baserede kloning metode. * De understregede DNA-basepar angivet begrænsning enzym websteder. Listen over ændrede primer gengivet med tilladelse fra Springer11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Begrebet heat shock-baserede pDHsp/V5-hans/sf9 celle system blev første gang beskrevet af Clem et al. 19948. Sammenligning af baculoviral gen promoter (IE1) og Drosophila hsp70 viste, at hsp70 havde en højere effektivitet i myg celler10. På grund af heat shock induktion, kunne timingen af protein udtryk være kontrolleret netop efter varmebehandling chok. Dette system blev derefter anvendt for protein funktionelle assays af rejer og nucleopolyhedrovirus (nutidsværdi) IAP proteiner9,11. I denne protokol, ialt 6 plasmid konstruktioner blev brugt: tre (pDHsp/V5-hans, pDHsp/Ac-p35/V5-hans og pDHsp/D-rpr/FLAG-hans) blev leveret af Jian-Horng Leu9, og de andre tre konstruktioner (pDHsp-iap3/V5-hans, pDHsp-iap3-BIR/V5-hans, og pDHsp-iap3-RING/V5-hans) blev bygget af Nai mfl., 201611. Det synes, at denne promotor i insekt celler arbejder mere effektivt end baculoviral gen initiativtagere. Men under manipulation af denne protokol, der er flere punkter, der skal overvejes. Før plasmid Transfektion, kontrollere indsættelse af DNA-sekvens er vigtigt for genekspression; således bør det sammensmeltet med V5 epitop til at danne en V5-mærkede fusion protein i slutningen af target sekvens. Desuden kunne forskellige fusion tags (dvs., FLAG epitop) også være udformet i de pDHsp-baserede vektor for en in vitro- protein bindende assay. Denne forlængelse procedure vil bidrage til yderligere at undersøge protein-protein interaktioner9. Derfor, den kommercielle V5 polyklonale antistof kunne anvendes til påvisning af proteiner. Transfektion forholdet i forskellige insekt celler skal testes før eksperimentet. Lavere Transfektion satser kan resultere i ikke-sporbare protein udtryk; således, en pDHsp vektor indeholdende en passende betænkning genet (dvs., grøn fluorescerer gen) kunne være transfekteret i insekt celler til at evaluere Transfektion effektivitet.

Den store begrænsning af denne varme chok udtryk platform er protein udtryk niveau. I nogle tilfælde, blev en lav protein udtryk niveau fundet. Efter en pilotundersøgelse var der ingen signifikant dosisafhængig effekt, der opstod, da flere plasmid DNA var transfekteret i sf9 celler (data ikke vist). Således, denne virkning kan være forårsaget af ubiquitin proteasom sti (UPP) eller andre ukendte mekanismer11. Forskere skal undersøge protein udtrykket proteasom hæmmer (dvs., MG-132) at præcisere og recolve dette spørgsmål11. Anden begrænsningen er, at bæredygtig produktion af protein associeret med de rekombinante virus ikke kunne opnås. Således, stabilisering og mængden af protein udtryk er også bekymringer vedrørende dette system. Et tidsforløb af protein produktion bør derfor også testes af vestlige skamplet assay før den funktionelle analyse. I denne protokol, vi sammenlignede to tidspunkter (1 og 5 h efter heat shock) og observeret ophobning af target protein produktion fra 1 h 5 h. En stigning i tiden point er foreslået for at bestemme de bedste timing betingelser for protein funktionelle analyse.

For protein funktionelle assay, anti-apoptotiske protein Ac-P35 (positiv kontrol) og en apoptose-inducer protein (D-RPR) blev også udtrykt ved hjælp af dette heat shock forbigående udtryk system. Disse to proteiner er beskrevet som funktionelt antagonister9,11,15. Derfor, vektor/D-RPR og Ac-P35/D-RPR kunne tjene som en negativ kontrol og positiv kontrol, henholdsvis. Ved hjælp af denne sammenligning, kunne anti-apoptotiske aktivitet af target proteiner bestemmes.

Præsenteres protokollen kunne skabe en platform for at udtrykke fremmede proteiner hurtigere eller yderligere kunne anvendes til at evaluere protein anti-apoptotiske aktivitet i insekt celler. Når forskere får de foreløbige resultater af protein funktion, kan dette system anvendes til yderligere undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Jian-Horng Leu af Marine Biologisk Institut, National Taiwan Ocean Universitet for at give 3 plasmid konstruktioner. Denne forskning blev støttet af tilskud 106-2311-B-197-001 - fra ministeriet for videnskab og teknologi (de fleste).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Tags

Genetik sag 132 forbigående udtryk protein funktionel analyse sf9 cell line Lymantria xylina flere nucleopolyhedrovirus Ly-inhinbitor af apoptose-3 Drosophila heat shock 70 promotor pDHsp/V5-hans Drosophilia Reaper actinomycin-D
Forbigående udtryk af fremmede gener i insekt celler (sf9) for Protein funktionel analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter