Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Published: January 22, 2018 doi: 10.3791/56702
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 2, 1
1Clinical Neuroscience, Section for Ophtalmology and Vision, Karolinska Institutet, 2Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Obstetrics and Gynecology, Karolinska Institutet
* These authors contributed equally

Summary

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Abstract

Geografische atrofie (GA), het late stadium van droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie wordt gekenmerkt door verlies van de retinale pigment epitheliale (RPE) laag, die tot verdere ontaarding van vitale retinale structuren (bijvoorbeeld, researchdieren leidt) veroorzaken ernstige visie bijzondere waardevermindering. Evenzo wordt RPE-verlies en daling van de gezichtsscherpte gezien in de lange termijn volgen omhoog van patiënten met geavanceerde natte leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die intravitreal anti-vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Dus, aan de ene kant, het is van fundamenteel belang voor het efficiënt afleiden RPE cellen uit een oneindige bron, die als substitutietherapie dienen kunnen. Aan de andere kant, het is belangrijk om te evalueren van het gedrag en de integratie van de afgeleide cellen in een model van de ziekte met als gevolg dat chirurgische en beeldvormende methoden als dicht mogelijk bij die worden toegepast bij de mens. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol op basis van onze eerdere publicaties die beschrijft de generatie van een preklinische model voor GA met behulp van het albino konijn oog, voor de evaluatie van de menselijke embryonale stamcellen afgeleid retinale pigment epitheliale cellen (hESC-RPE) in een klinisch relevante instelling. Gedifferentieerde hESC-RPE in naïef ogen of ogen met NaIO3worden getransplanteerd-geïnduceerde GA-achtige Retina degeneratie met behulp van een techniek met 25 G transvitreal pars plana. Beoordeling van gedegenereerd en getransplanteerde gebieden is uitgevoerd door multimodale high-resolution niet-invasieve real-time imaging.

Introduction

Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed preklinische model van geografische atrofie (GA), waarmee de evaluatie van de integratie van getransplanteerde hESC-RPE in de subretinal ruimte. De in detail hier beschreven methoden zijn gebruikt in 3 recente publicaties die aantonen de productie van een verrijkte, zuivere en functionele bevolking van RPE cellen van hESC1, evenals de oprichting van buitenste retinale schade en een GA-achtige fenotype dat veroorzaakt door subretinal injectie van fysiologische zoutoplossingen (d.w.z., BSS en PBS) of NaIO3 in de konijn eye2,3. We verder aangetoond dat sub retinale schorsing transplantaties van hESC-RPE uitgebreide functionele monolayers met fotoreceptor redding capaciteit2vormen.

Verschillende voordelen vergezeld gaan van het gebruik van het konijn-oog voor de generatie van een GA model van ziekte. Ten eerste, de grootte van het konijn oog, die is 70% van het volume van een volwassen menselijk oog, kan klinisch zinvolle transplantatie met behulp van een celdichtheid die veel lager is dan routinematig gebruikt in kleine knaagdieren ogen (1000 cellen/µL vs. 50.000 cellen/µL)4 , 5. ten tweede chirurgie bij knaagdieren is meestal transscleral via het vaatvlies, die het netvlies barrière in het gedrang brengt en potentieel triggers een ontstekingsreactie en een mogelijke afwijzing6. Beide factoren leiden samen tot multilayering en samendoen van getransplanteerde cellen, en een over het algemeen slechte integratie van de getransplanteerde cellen in een verstoorde inheemse retinale weefsel. Echter kunt het grote-eyed konijn model uitvoeren van een chirurgische techniek met instrumentatie identiek aan een klinische setting. Ten derde, een grote-eyed model tevens in staat hoge resolutie in vivo imaging en bewaking van de getransplanteerde cellen en het bovenliggende netvlies door tijd1,2,3. Dus beschrijven we een klinisch relevante en kosten-efficiënte preklinische model dat een aantrekkelijk alternatief voor knaagdieren voor iedereen met een interesse in onderzoek van het netvlies van normale en zieke en de sub retinale ruimte moet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het volgende protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van Karolinska Instituet. Alle dierproeven met behulp van Nieuw-Zeeland albino konijnen (Tabel of Materials) zijn goedgekeurd door het Comité regionale dierenethiek (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (toestaan: dnr 56/15). Het gebruik van hESC (dnr 2011/745-31/3) en de overdracht en de manipulatie van hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) is ook in overeenstemming met de Zweedse wet- en regelgeving van het Karolinska Institutet, en is goedgekeurd door de regionale menselijke ethische Commissie ( 1regional Etikprövningsnämnden ik Stockholm).

1. subretinal injectie van natrium Kaliumjodaat (NaIO3) in een grote-eyed diermodel

  1. Anesthetize van dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G en verwijden van leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken een mix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje haar rug been reageert.
  2. Plaats het konijn onder de chirurgische Microscoop met het hoofd geconfronteerd met de chirurg (figuur 1A). Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Gebruik evenwichtig zoutoplossing (BSS) om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.
  3. Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met niet-schuifkleppen trocars voor het inbrengen van microchirurgische instrumenten (figuur 1B). De multifunctionele Vitrectomie machine heeft poorten om verbinding te maken met een infusie canule, endoillumination, vitrector en endolaser. Voor subretinal injecties is alleen de endoillumination verplicht, waardoor een set-up 2-poort voldoende. Voeg de endoillumation door de bovenste linker trocar en gebruik van de bovenste rechts trocar voor de canule subretinal injectie.
    1. Voor een 3-poort set-up, gebruikt u de lagere temporele trocar voor de BSS infusie canule. Als optionele instrumenten (zoals een vitrector) zijn gebruikt, voegt u deze via de bovenste rechts trocar.
    2. De bovenste 2 trocars 1-2 mm uit de limbus klauwkikker pincet met pak en verdringen het bindvlies overliggende de invoeging site invoegen.
    3. Zorg ervoor dat de trocars zijn ingevoegde transsclerally onder een hoek van 30-45° limbus parallelle en ga naar het midden van het puntje van de trocar. Draai de trocar 90° en vooraf in het oog, die gericht zijn op de achterste paal van het oog. Deze procedure zal voorkomen na chirurgische lekkage uit de sclerotomies, en ook het verlagen van het risico op endophthalmitis (dat wil zeggen, bacteriële infectie in het oog). Zie ook figuur 2B voor trocar posities.
    4. Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).
    5. Trekken 500 µL van NaIO3 in een spuit van 1 mL aangesloten op een verlenging buis (gerund door de Office-assistent) en een 38 G polytip canule (gerund door de chirurg).
    6. De sonde van de endoillumination door de bovenste linker trocar en de injectie canule via de bovenste rechts trocar invoegen, en verder de canule via het glasvocht ruimte naar het netvlies, streven naar het gebied net onder het hoofd van de oogzenuw.
    7. Laat het uiteinde van de canule te langzaam het netvlies raken totdat een focale whitening zichtbaar is. De injectie zelf zal doordringen in het netvlies, waardoor subretinal levering. Laat niet de canule doordringen van het netvlies, aangezien dit kan bloeding veroorzaken.
    8. Injecteren 50 µL van NaIO3 subretinally een periode van 5 s. Aangezien er een natuurlijke decolleté vliegtuig tussen het netvlies en de onderliggende vaatvlies, moet een duidelijk zichtbaar semi-transparante bleb geleidelijk vormen tijdens de injectie.
    9. Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.
    10. Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.
  4. Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.
  5. Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden in de eerste plaats in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.
  6. Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeldvoor doeleinden van immunohistochemistry), euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital (Zie Tabel van materialen).
  7. 7 dagen om verder te gaan met de transplantatie van cellen van de hESC-RPE wachten.

2. subretinal transplantatie van cellen van de hESC-RPE in dieren behandeld

  1. Beheren van 2 mg (100 µL) van intravitreal Triamcinolon in narcose dieren met behulp van een naald van 30 g injectie ingevoegd van 1-2 mm van de limbus in de lagere temporele kwadrant 1 week voor transplantatie van hESC-RPE en opnieuw beheren het elke 3 maanden. Zorg ervoor dat punt van de tip naar de achterste paal van het oog om te voorkomen dat de aanraking van een lens.
  2. Cultuur een hESC-RPE enkelgelaagde zoals eerder beschreven1.
  3. Verwijderen van cel differentiatie media (Zie Tabel van materialen) van een 24-well confluente hESC-RPE enkelgelaagde en wassen elk goed met 500 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. Herhaal deze actie nogmaals, voor een totaal van 2 wasbeurten.
  4. Vloeistof wordt weggeworpen, voeg 500 µL van trypsine per putje en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 ° C.
  5. Kantelen van de plaat en verwijder voorzichtig trypsine (cellen moeten blijven gekoppeld aan de plaat). Cellen in 800 µL van vers 37 ° C voorverwarmde differentiatie media verzamelen door zachte pipetteren, of zelfs schrapen indien nodig, te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel.
    Opmerking: Gebruik een zeef 40 µm cel als cel klontjes in acht worden genomen.
  6. Cellen tellen in een hemocytometer kamer met 0,2% Trypan blauw, volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Voeg 5 mL van de media en centrifuge cellen differentiatie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in vers filter-gesteriliseerde PBS (doorgegeven door middel van een 25 mm spuit filter), om een eindconcentratie van 1000 cellen/µL.
  9. Aliquot de vorige celsuspensie in 600 µL aliquots en houd op ijs tot en tijdens de operatie.
  10. Anesthetize dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G. Verwijden leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken amix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje in zijn achterste been reageert.
  11. Plaats het konijn met het hoofd geconfronteerd met de chirurg. Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Met BSS voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.
  12. Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met trocars in dezelfde positie geplaatst, zoals beschreven in stap 1.3 en Figuur 2. Als de vorige sclerotomies zichtbaar zijn, voeren trocar inbrengen net naast, maar niet via deze, tot een minimum beperken van het risico van postoperatieve lekkage.
    1. Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als het contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).
    2. Na goede tip (zie stap 1.3.5 en 1.3.6) positionering, injecteren 50 µL van een voorzichtig-gemengde hESC-RPE schorsing (50.000 cellen) subretinally. Streven naar het midden van de NaIO3 voorbehandeld gebied onderscheidt zich door een karakteristieke "metalen" endo-verlichting-reflex. Het hormoonfuncties netvlies moet scheiden gemakkelijk maken een duidelijk zichtbare bleb. Flush de naald met steriele H2O daartussenin konijnen/na gebruik te voorkomen van naald verstoppingen als gevolg van cel samengeklonterd. Verandering de naald bij verstopping is opgemerkt.
    3. Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.
    4. Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.
  13. Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.
  14. Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden, om te beginnen in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.
  15. Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeld voor doeleinden van immunohistochemistry) euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo Retina en Subretinal Imaging

  1. Een spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) apparaat gebruiken met de meegeleverde software (zie tabel van materialen) te verkrijgen van transversale b-scans van de behandelde dieren, volgens de instructies van de fabrikant. Om te vermijden vervagen van de afbeelding, ervoor te zorgen het hoornvlies om vochtig te houden door te spoelen met actuele saline elke 30-60-s.
    1. Plaats de narcose en leerling-uitgezet dieren (zie stap 1.1 en 2.10) in een verstelbare mount te verkrijgen van een onbelemmerde pad van de lichtbron instrument aan het netvlies konijn.
    2. Het verkrijgen van ten minste 3 OCT scans met gelijktijdige infrarood-confocale scanning laser ophthalmoscopy (IR-cSLO) reflectiecoëfficiënt referentie afbeeldingen vertegenwoordigen het bovenste, Centraal en onderste gedeelte van het geïnjecteerde gebied.
    3. Verkrijgen van nl-gezicht fundus beelden met cSLO blauwe, groene, infrarood en multicolor laser reflectie (d.w.z., meerdere gelijktijdige laser kleuren), respectievelijk.
    4. Blauw licht autofluorescence (BAF) opnamen met behulp van het vermogen van de blauw-licht laser van de SD-OCT-apparaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vertegenwoordiger in vivo afbeeldingen van BAF, IR-cSLO en SD-LGO van een normale albino konijn netvlies zijn afgebeeld in Figuur 2. Opmerking de verschillende retinale lagen met hun kenmerkende licht reflectie gevangen genomen door de SD-OCT-instrument.

In de figuren 1A en figuur 1B, de setup te creëren sub retinale blebs wordt geïllustreerd: een deksel oprolmechanisme wordt geplaatst, de deksels oog zodat de invoeging van 3 trocars (figuur 1B) 1-2 mm ver van de limbus, om te voorkomen dat een lens te onderwerpen aanraken, en een 30-45 ˚ limbus parallelle hoek. Trocars kan de invoering van een optionele infusie canule, naast een licht, en de injectie naald door de sclera. Een verwijde leerling samen met een platte contactlens vergemakkelijkt een weergave van de fundus van het oog en de sub retinale ruimte terwijl de chirurgische ingreep wordt uitgevoerd.

Na de injectie van 50 µL van 1 mM NaIO3 oplossing, wordt een bleb gemaakt in de subretinal ruimte die zal oplossen en geleidelijk ontaarden het buitenste netvlies, zoals weergegeven in de afbeelding van de SD-OCT in figuur 3A drie maanden na de injectie. Waardeer het dunner worden van de ultraperifere neuroretinal lagen in de SD-OCT en de hypo-BAF gebieden, overeenkomt met RPE verlies een GA-achtige fenotype dus opnieuw te maken. Bij de identificatie van het gebied van schade is 50.000 hESC-RPE in een 50 µL volume opnieuw ingespoten voor transplantatie, het creëren van een tweede bleb die zoals wordt weergegeven in de BAF en multi (MC) de kleurenafbeeldingen in figuur 3Bis opgelost. De milde tot matige hyper-BAF gebieden met een focale verhoogde hyper-BAF ondeugdelijkheid herkennen op de grens van het gebied van schade, kenmerkend voor chronische stress van de inheemse RPE in de SD-OCT-scans samen met het ontbreken van gepigmenteerde gebieden in de MC-afbeelding weergegeven. De bleb die overeenkomt met de injectie van 50 µL van hESC-RPE (50.000 cellen) in niet-voorbehandeld ogen patches van gepigmenteerde cellen tonen in het beeld van de (MC) en goed bewaarde retinale structuren in de SD-OCT scan wordt weergegeven voor vergelijking (Figuur 3 c).

Collectief, voorziet deze procedure en de methodologie in de studie van de integratie van subretinal schorsing transplantaties van hESC-RPE in een relevante model GA.

Figure 1
Figuur 1: injectie instellen omhoog (A) foto's beeltenis van de chirurgische set-up voor sub retinale injecties. Het dier wordt geplaatst onder de chirurgische Microscoop (links) en de chirurg houdt de endoillumination sonde ingebracht via de linker trocar in de linkerhand en de intravitreal chirurgische instrument (b.v. subretinal injectie canule) ingebracht via de linker trocar in de rechterhand (midden). Een platte contact lens op het hoornvlies geplaatst kunt een vergrote weergave van de fundus tijdens de chirurgische ingreep (rechts). (B) nauwe schematische weergave van het albino konijn oog met het deksel oprolmechanisme en de tepel van de trocars 1-2 mm diep uit de limbus en ingevoegd op een parallelle hoek van 30-45 °, samen met de trocars die de invoering van een optioneel infusie canule, een licht en de naald voor injectie. Een platte contactlens gelegen op de top van de leerling zal helpen om een beter beeld van de fundus van het oog tijdens de chirurgische ingreep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Normale albino konijn netvlies in vivo imaging. In vivo BAF, IR-cSLO en SD-OCT beelden die van een normale albino konijn netvlies. Een opblazen van de SD-LGO met de overeenkomstige etikettering van de verschillende lagen van de retinale is te zien in de afbeelding van de SD-OCT: GCL (ganglion cellaag), IPL (Meervormige binnenlaag), l (nucleaire binnenlaag), OPL (Meervormige buitenlaag), ONL (nucleaire buitenlaag), OLM (buitenste beperking van het membraan), EZ (ellipsoïde zone), OS (buitenste segmenten), RPE (retinale pigment epitheel) en BM (Bruch het membraan). Schaal bars = 1 mm (BAF en IR-cSLO beelden), 200 µm (SD-OCT beelden). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Subretinal schorsing injecties in het grote-eyed konijn model. (A) BAF, MC en SD-OCT beelden van subretinal injectie van 1 mM NaIO3 3 maanden na schade inductie. Opmerking de hypo-BAF omgeven door hyper-BAF gebieden overeenkomt met de bleb en de ontaarde neuroretina in de SD-oktober (B) BAF, MC, en SD-OCT beelden van ogen voorbehandeld met 1 mM NaIO3 voor 1 week gevolgd door subretinal transplantatie van 50.000 hESC-RPE schorsing en geanalyseerde 3 maanden na de transplantatie. Opmerking de hyper-BAF-gebieden in de afbeelding van de BAF, de afwezigheid van geïntegreerde gepigmenteerde cellen in de MC en de atrofische neuroretina in de SD-oktober (C) MC en SD-OCT beelden overeenkomt met niet-voorbehandeld naïef ogen 3 maanden na de transplantatie van de subretinal van hESC-RPE in suspensie. Opmerking de gepigmenteerde gebieden in de afbeelding van de MC en de structuur van de bewaarde neuroretinal op de SD-oktober SD-OCT scan vliegtuigen zijn gemarkeerd (groene pijl). Witte pijlpunten markeren de grens van blebs in het nl-gezicht en SD-OCT beelden. Schaal bars = 1 mm (BAF en MC beelden), 200 µm (SD-OCT beelden). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol, wordt de generatie van een grote-eyed model van GA en het preklinische gebruik voor het evalueren van hESC-RPE integratie in vivo beschreven.

Vertaling van regeneratieve therapieën voor GA en de verwante ziekten in de kliniek7is het belangrijk te ontwikkelen en optimaliseren van methoden die getrouw de klinische methoden voor transplantatie en beeldbewerking vangen. Het konijn is in dit aantrekkelijke aspect: het heeft een relatief grote oog dat intraoculaire chirurgie en het gebruik van standaard beeldvorming toelaat, en is goedkoop en gemakkelijk gehuisvest in vergelijking met andere grote-eyed dieren.

We beschrijven het gebruik van standaard transvitreal 25-gauge pars plana Vitrectomie techniek voor de oprichting van sub retinale blebs sub retinale schade veroorzaken of transplantatie hESC-RPE. Aanvankelijk gebruikten we een 3-poort set-up, zoals geïllustreerd in figuur 1B, met de bedoeling met behulp van de infusie poort (trocar), in het geval dat een Vitrectomie tijdens de procedure werd uitgevoerd. Echter, aangezien we een Vitrectomie noodzakelijk voor de toepassing van sub retinale injecties niet hebben gevonden, de infusie-poort is weggelaten. Niettemin, de derde poort-optie moet blijven als de procedure verder aangepast is en een Vitrectomie wordt uitgevoerd.

Het groot-eyed konijn is een gevestigde oogbeschadigingen en/of model met verzamelde gegevens betreffende anatomie en fysiologie in de afgelopen eeuwen8. Bovendien konijnen zijn gemakkelijk te verwerken en RAS, economisch aantrekkelijk (b.v., aanschaf, huisvesting, en het houden van), en beschikbaar in vergelijking met andere grote-eyed zoogdier-modellen. Een groot voordeel van een grote eyed-model is dat het in staat stelt het gebruik van hoge resolutie klinische beeldvormingstechnieken, waardoor op zijn beurt voor het bijhouden van hESC-RPE getransplanteerde cellen in de subretinal ruimte na verloop van tijd. Echter ondanks lagomorfen worden fylogenetisch dichter bij de mens dan knaagdieren, moet worden vastgesteld dat zij een merangiotic netvlies en een visuele streak, vergeleken met een holangiotic netvlies en een fovea aanwezig in primaten9bezitten. Merangiotic netvlies betekent dat het grootste deel van het bloed toevoer van het innerlijke netvlies is afgeleid van de choriocapillaris, een verschil dat men overwegen moet omdat het het risico van letsel en bloeding verhogen kan. Een experimentele voordeel is dat het mogelijk maakt voor het modelleren van de eerdere fasen van GA na subretinal blebs van fysiologische oplossingen alleen, zoals het al eerder bewezen1,3. Deze studies voorgesteld dat een subretinal bleb veroorzaakt tijdelijke retinale hypoxie in het milieu van de merangiotic kan volstaan om te leiden tot de fotoreceptor dood; echter in dit verband heeft RPE verlies aangetoond dat waarschijnlijk worden gegenereerd door de sub retinale stroom opgewekt met behulp van een spuit van 1 mL en een 50 µL bleb volume, een willekeurige verschijnsel dat op zijn beurt potentiates neuro-Retina Atrofie. Daarom kan het volume van de bleb hebben een direct effect op het netvlies stretch schade, wat betekent dat hoe groter het volume dat wordt gebruikt (bijvoorbeeld100 µL, zoals in andere studies10is gebruikt), hoe meer schadelijk kan worden.

Een cruciale stap om integratie van de geïnjecteerde cellen te verzekeren is te vermijden terugvloeiing van cellen in het glasvocht terwijl injecteren, en de positionering van de naald in de subretinal ruimte. Als te diep geplaatst, de buitenste retinale barrière/vaatvlies zal worden doorbroken en immune cellen kunnen binnenvallen het sub retinale ruimte, waardoor immuun afwijzing ondanks het gebruik van immunosuppressiva. Een ander belangrijk aspect voor het succes van transplantatie is de stand van het glasvocht. In het huidige model, wordt Vitrectomie niet uitgevoerd om te minimaliseren van reflux en chirurgisch trauma. Het is echter geconstateerd dat in sommige ogen is het moeilijk om een goede tip positie op het netvlies krijgen als het puntje vast komt te zitten in de vooraf retinale glasvocht interfase leidt tot de vorming van kleine of zelfs geen blebs. Hoewel het een relatief zeldzame gebeurtenis, het geeft wel aan dat de variabiliteit van het glasvocht konijn moet rekening worden gehouden tijdens de operatie en na chirurgische analyse.

Bovendien, is de juiste injectie van triamcinolon cruciaal om te voorkomen dat de maagwand verduisterend door witte steroïde kristallen, die vervolgens chirurgie, en na chirurgische fundus visualisatie door SD-oktober belemmeren zal. Om dit probleem te minimaliseren, moet de injectie van triamcinolon in de lagere temporele Kwadrant gebeuren. Ook moeten trocars worden geplaatst 1-2 mm van de limbus te vermijden glasvocht bloeding uit het straalvormig lichaam en de lens unproportionally groot konijn aan te raken met de naald. Vleugjes lens zal leiden tot staar die op zijn beurt goede visualisatie van de sub retinale ruimte tijdens postoperatieve beeldvorming zal bemoeilijken.

Steroïden, met inbegrip van Triamcinolon, kunnen zichzelf staar veroorzaken na verloop van tijd. We hebben dit niet waargenomen na toediening van de Triamcinolon tot 8 maanden. Het is echter waarschijnlijk dat steroid-veroorzaakte staar als beheert Triamcinolon over langere perioden zullen ontwikkelen.

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt zowel voor chirurgische opleiding en voor analyse van cel-integratie en functie zoals beschreven hier en in onze eerdere publicaties. De methode heeft nu ook hoge relevantie voor het beheer van sub retinale virale vectoren in klinische proef voor verschillende erfelijke retinale dystrophie. Toekomstige wijzigingen eventueel transplantatie van meer complexe materialen, zoals dragers van vel en biogels. Zoals nieuwe klinische beeldvorming methoden ontstaan, zullen deze gemakkelijk aangepast voor het konijn oog, eventueel zonder wijzigingen.

In conclusion, de groot-eyed konijn model is aangetoond dat zij een relevante preklinische model dat verschillende voordelen ten opzichte van knaagdier modellen heeft voor i) Recapitulerend verschillende stadia van GA, ii) toepassing van de patiënt relevante chirurgische en imaging methoden, en iii ) evaluatie van de integratie van donor cellen worden gebruikt als vervanging van celtherapie voor GA en verwante aandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Karolinska Instituut, het kroonprinses Margareta van Stichting voor de slechtzienden, de Stichting Jordanië Edwin voor uitgevoerd oftalmologisch onderzoek, de Zweedse Eye Foundation, de koning Gustav V Foundation, de ARMEC Lindeberg Foundation, en de Cronqvist Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).

Tags

Celbiologie kwestie 131 retinale Pigment epitheliale cel menselijke embryonale stamcellen Large-eyed model geografische atrofie schorsing Subretinal transplantatie optische coherentie tomografie Transvitreal Pars Plana
Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H.,… More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter