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Biology

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Abstract

Atrofia geografica (GA), la fine della fase di degenerazione maculare senile secca è caratterizzata da perdita dello strato del pigmento retinico epiteliale (RPE), che conduce a degenerazione successiva delle strutture retiniche vitali (ad es., fotorecettori) causando gravi problemi visivi. Allo stesso modo, perdita di RPE e diminuzione dell'acuità visiva è visto in seguito a lungo termine di pazienti con avanzato wet età degenerazione maculare senile (AMD) trattati intravitreale anti-vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF). Pertanto, da un lato, è fondamentale in modo efficiente derivare cellule RPE da una fonte illimitata che potrebbe servire come terapia sostitutiva. D'altra parte, è importante valutare il comportamento e l'integrazione delle cellule derivate in un modello della malattia che comportano chirurgica e metodi di imaging come vicino possibile a quelle applicate negli esseri umani. Qui, forniamo un dettagliato protocollo basato su nostre pubblicazioni precedenti che descrive la generazione di un modello preclinico di GA utilizzando l'occhio di coniglio albino, per valutazione della cellula staminale embrionale umana derivate cellule epiteliali del pigmento retinico (hESC-RPE) in un impostazione clinicamente rilevante. Differenziato hESC-RPE sono trapiantate in occhi ingenui o con NaIO3-indotto GA-come degenerazione retinica utilizzando una tecnica di 25 G transvitreal pars plana. Valutazione delle zone degenerate e trapiantati viene effettuata da multimodale ad alta risoluzione imaging non-invasivo in tempo reale.

Introduction

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Questo protocollo descrive la generazione di un modello preclinico dagli occhi grandi di atrofia geografica (GA) che permette la valutazione dell'integrazione dei trapiantati hESC-RPE nello spazio subretinal. I metodi descritti in dettaglio qui sono stati utilizzati in 3 pubblicazioni recenti che illustrano la produzione di una popolazione arricchita, pura e funzionale di cellule RPE da hESC1, come pure la creazione di danno retinico esterno e un fenotipo simile a GA indotto tramite l'iniezione subretinal di soluzioni saline fisiologiche (cioè, BSS e PBS) o NaIO3 , occhio del coniglio2,3. Abbiamo ulteriormente dimostrato che trapianti di sospensione sub-retinico di hESC-RPE formano monostrati vasti funzionali con fotorecettore soccorso capacità2.

Diversi vantaggi accompagnano l'uso dell'occhio di coniglio per la generazione di un modello di GA di malattia. In primo luogo, la dimensione dell'occhio di coniglio, che è del 70% il volume di un occhio umano adulto, consente il trapianto clinicamente significativo usando una densità di cella che è molto inferiore di quanto abitualmente utilizzati per occhi piccoli roditori (1.000 cellule / µ l vs 50.000 cellule / µ l)4 , 5. in secondo luogo, chirurgia nei roditori è di solito transscleral attraverso la coroide, che compromette la barriera della retina e potenzialmente attiva una risposta infiammatoria e un eventuale rifiuto6. Entrambi fattori insieme possono portare a multilayering e aggregazione delle cellule trapiantate e un'integrazione nel complesso scadente delle cellule trapiantate in un tessuto retinico nativo perturbato. Tuttavia, il modello di coniglio dagli occhi grandi consente di effettuare una tecnica chirurgica con strumentazione identica a una regolazione clinica. In terzo luogo, un modello di grandi dimensioni-eyed consente anche ad alta risoluzione in vivo imaging e monitoraggio delle cellule trapiantate e la retina sovrastante attraverso tempo1,2,3. Così, descriviamo un modello preclinico clinicamente rilevante e costo-efficiente che dovrebbe essere un'alternativa attraente ai roditori per chiunque con un interesse nella ricerca della retina normale e malata e lo spazio sub-retinico.

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Protocol

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Il seguente protocollo segue le indicazioni di cura degli animali di Karolinska Instituet. Tutti gli esperimenti su animali utilizzando Nuova Zelanda conigli albini (Tabella materiali) sono stati approvati dal comitato di etica animale regionale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permesso: dnr 56/15). L'uso di hESC (dnr 2011/745-31/3) e il trasferimento e la manipolazione di hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) è anche secondo la legislazione svedese e i regolamenti del Karolinska Institutet ed è stato approvato dalla (Comitato regionale etica umana Regionala Etikprövningsnämnden ho Stoccolma).

1. subretinal iniezione di iodato di sodio (NaIO3) in un modello animale di gran-eyed

  1. Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina in Salina usando una siringa da 30 G, e dilatare le pupille con colliri topici utilizzando un mix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro della zampa posteriore.
  2. Posizionare il coniglio sotto il microscopio chirurgico con la testa rivolta verso il chirurgo (Figura 1A). Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Uso equilibrato di soluzione salina (BSS) per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.
  3. Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar non valvolato per l'inserimento di microsurgical strumenti (Figura 1B). La macchina multifunzione vitrectomia ha porte per collegare una cannula infusione endoilluminazione, vitrector ed endolaser. Per preparazioni iniettabili subretinal, solo l'endoilluminazione è obbligatoria, che rende un set-up 2 porte sufficiente. Inserire il endoillumation attraverso il trocar sinistro superiore e utilizzare il trequarti destro superiore per la cannula iniezione subretinal.
    1. Per un set-up di 3-porta, utilizzare il trocar temporale inferiore per la cannula di infusione di BSS. Se gli strumenti opzionali (ad esempio un vitrector) sono utilizzati, inserirli attraverso il trocar di destro superiore.
    2. Inserire il 2 trocar superiore 1-2 mm dal limbus utilizzando artigliate pinze per afferrare e spostare la congiuntiva che ricopre il sito di inserimento.
    3. Assicurarsi che il trocar sono inseriti transsclerally ad un angolo di 30-45° limbus parallela e procedere verso il centro della punta del trocar. Poi girare il trocar 90° e avanzare nell'occhio, che mira al polo posteriore dell'occhio. Questa procedura sarà evitare perdite post-chirurgica dalla sclerotomies e anche diminuire il rischio di endoftalmite (cioè, infezione batterica nell'occhio). Vedi anche Figura 2B per le posizioni di trocar.
    4. Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).
    5. Disegnare 500 µ l di NaIO3 in una siringa da 1 mL, collegato ad un tubo di prolunga (operato dall'assistente) e una cannula di polytip 38 G (operati dal chirurgo).
    6. Inserire la sonda endoilluminazione attraverso il trocar di sinistra superiore e la cannula di iniezione attraverso il trocar di destra superiore e fare avanzare la cannula attraverso lo spazio vitreo verso la retina, con l'obiettivo per la zona appena sotto la testa del nervo ottico.
    7. Permettere che la punta della cannula lentamente toccare la retina fino a quando uno sbiancamento focale è visibile. L'iniezione stessa penetrerà la retina, permettendo per consegna subretinal. Non lasciare che la cannula penetrare la retina, poiché ciò potrebbe causare l'emorragia.
    8. Iniettare 50 µ l di NaIO3 subretinally su un periodo di 5 s. Poiché c'è un aereo di fenditura naturale fra la retina e della coroide sottostante, una vescichetta semitrasparente chiaramente visibile dovrebbe formare gradualmente durante l'iniezione.
    9. Durante l'iniezione, lentamente, ritirare l'ago, ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.
    10. Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.
  4. Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.
  5. Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.
  6. Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio, per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital (Vedi Tabella materiali).
  7. Attendere 7 giorni per procedere con il trapianto di cellule hESC-RPE.

2. subretinal trapianto di cellule hESC-RPE in animali trattati

  1. Somministrare 2 mg (100 µ l) di triamcinolone intravitreal in animali anestetizzati utilizzando un ago per iniezione 30g inserito 1-2 mm dal limbus nel quadrante temporale inferiore 1 settimana prima del trapianto di CSE-RPE e ri-amministrarlo ogni 3 mesi. Assicurarsi di puntare la punta verso il polo posteriore dell'occhio per evitare un tocco di lente.
  2. Un monostrato hESC-RPE come descritto in precedenza1della coltura.
  3. Media di differenziazione delle cellule (Vedi Tabella materiali), di un monostrato confluente 24 pozzetti hESC-RPE di rimuovere e lavare ogni bene con 500 µ l di PBS senza Ca2 + e Mg2 +. Ripetere questa azione ancora una volta, per un totale di 2 lavaggi.
  4. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 µ l di tripsina ogni pozzetto e incubare per 12 min a 37 ° C.
  5. Inclinare il piatto e rimuovere con cautela la tripsina (celle devono rimanere agganciate alla piastra). Raccogliere le cellule in 800 µ l di fresco 37 ° C preriscaldati differenziazione media pipettando delicato, o raschiare anche se necessario, per ottenere una sospensione di singola cellula.
    Nota: Utilizzare un colino di cella di 40 µm se si osservano cellule ciuffi.
  6. Numero di celle in una camera di un emocitometro usando 0.2% Trypan Blue, secondo le istruzioni del produttore.
  7. Aggiungere 5 mL di differenziazione le cellule di media e centrifuga a temperatura ambiente, 300 x g per 5 min.
  8. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS appena sterilizzati con filtro (passato attraverso un filtro per siringa 25 mm) a una concentrazione finale di 1.000 cellule / µ l.
  9. Aliquotare la precedente sospensione cellulare in 600 µ l aliquote e tenere il ghiaccio fino a e durante la chirurgia.
  10. Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina salina utilizzando una siringa di 30 G. Dilatare le pupille con i eyedrops d'attualità usando amix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro nella sua gamba posteriore.
  11. Posto il coniglio con la testa rivolta verso il chirurgo. Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Utilizzare BSS per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.
  12. Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar posizionato nella stessa posizione come descritto al punto 1.3 e Figura 2. Se il sclerotomies precedente sono visibili, eseguire inserimento trocar appena adiacente, ma non attraverso questi, per ridurre al minimo il rischio di perdita postoperatoria.
    1. Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come il gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).
    2. Dopo Punta corretto posizionamento (Vedi i passaggi 1.3.5 e 1.3.6), iniettare 50 µ l di una sospensione delicatamente miscelato hESC-RPE (50.000 cellule) subretinally. Obiettivo per il centro della zona di3 pretrattati NaIO distinto da un riflesso di caratteristici "metallico" endo-illuminazione. La retina neurosensoriale dovrebbe separare facilmente creando una vescichetta chiaramente visibile. Filo dell'ago con sterile di H2O tra conigli/dopo utilizzare per evitare ago intasamento grazie alla cella ciuffi. Cambia l'ago quando intasamento è notato.
    3. Durante l'iniezione, lentamente di ritrarre l'ago ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.
    4. Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.
  13. Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.
  14. Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi, in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.
  15. Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo della retina e Subretinal Imaging

  1. Utilizzare un dispositivo di (SD-OCT) la tomografia ottica di coerenza dominio spettrale con il software in dotazione (Vedi tabella materiali) per ottenere a sezione trasversale b-scansioni degli animali trattati, secondo le istruzioni del produttore. Per evitare la sfocatura dell'immagine, assicurarsi di mantenere umida la cornea irrigando con soluzione fisiologica topico ogni 30-60 s.
    1. Sistemare gli animali anestetizzati e pupilla dilatata (vedere i passaggi 1.1 e 2.10) in un supporto regolabile per ottenere un percorso senza ostacoli dalla sorgente di luce strumento alla retina di coniglio.
    2. Ottenere almeno 3 OCT scansioni con oftalmoscopia laser infrarosso-confocale simultanea scansione immagini di riferimento di riflettanza (IR-cSLO) che rappresenta la parte superiore, centrale e inferiore del sito di inoculo.
    3. Ottenere immagini del fondo it-viso con cSLO blu, verde, infrarossi e multicolor laser riflettanza (cioè, più colori laser simultanea), rispettivamente.
    4. Catturare immagini di autofluorescence luce blu (BAF) utilizzando la funzionalità blu-luce laser del dispositivo SD-OCT.

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Representative Results

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Rappresentante in vivo immagini di BAF, IR-cSLO e SD-OCT di una retina di coniglio albino normale sono indicate nella Figura 2. Notare i diversi strati della retina con i loro caratteristici livelli di riflessione della luce catturata dallo strumento SD-OCT.

Nelle figure 1A e 1B di figura, è illustrato il programma di installazione per creare le vescichette Sub-retinici: viene posizionato un divaricatore di coperchio, sottoponendo le palpebre per consentire l'inserimento di 3 trocar (Figura 1B) 1-2 mm dal limbus, al fine di evitare una lente Toccare e ad un angolo di 30-45 ˚ limbus parallelo. Trocar consentirà l'introduzione di una cannula infusione opzionale, oltre a una luce e l'ago per iniezione attraverso la sclera. Una pupilla dilatata con una lente a contatto piatta faciliterà una vista del fondo dell'occhio e lo spazio sub-retinico, mentre viene eseguita la procedura chirurgica.

Dopo l'iniezione di 50 µ l di 1 mM NaIO3 soluzione, una vescichetta viene creata nello spazio subretinal che si risolverà e degenerare progressivamente la retina esterna, come illustrato nell'immagine SD-OCT in Figura 3A tre mesi dopo l'iniezione. Apprezzare l'assottigliamento degli strati più esterno di neuroretinal in SD-OCT e le zone di IPO-BAF, corrispondente alla perdita di RPE ri-creando così un GA-come il fenotipo. Al momento l'identificazione della zona di danno, 50.000 hESC-RPE in un 50 µ l di volume viene re-iniettato per trapianto, creando una vescichetta di seconda che risolve come mostrato nel BAF multi-immagini e colori (MC) nella Figura 3B. Riconoscere il delicato per aree di moderata iper-BAF con una focale maggiore iper-BAF inferiorly al limite dell'area di danno, indicativo di stress cronico del RPE nativo mostrato nelle scansioni SD-OCT insieme all'assenza di aree pigmentate nell'immagine MC. La vescichetta corrispondente per l'iniezione di 50 µ l di hESC-RPE (50.000 cellule) non pretrattati occhi mostrando le patch delle cellule pigmentate a immagine (MC) e ben conservate strutture retiniche nella scansione SD-OCT è indicata per il confronto (Figura 3).

Collettivamente, questa procedura e metodologia consentono lo studio dell'integrazione dei trapianti subretinal sospensione dell'hESC-RPE in un modello rilevante per GA.

Figure 1
Figura 1: iniezione impostato up. (A) immagini che ritraggono il set-up chirurgici per iniezioni Sub-retiniche. L'animale è posto sotto il microscopio operatorio (a sinistra) e il chirurgo tiene la sonda endoilluminazione inserita attraverso il trocar sinistro nella mano sinistra, e lo strumento chirurgico intravitreale (ad es. cannula per iniezione subretinal) inserito attraverso il trocar sinistro nella mano destra (al centro). Una lente a contatto piatta collocata sulla cornea permette una vista ingrandita del fondo durante la procedura chirurgica (a destra). (B) Chiudi visualizzazione schematica dell'occhio coniglio albino con riavvolgitore coperchio in posto e il capezzolo da trocar inserito 1-2 mm dal limbus profondo e ad un angolo di 30-45 ° parallelo, insieme con il trocar che facilitano l'introduzione di un optional cannula infusione, una luce e l'ago per iniezione. Una lente a contatto piatta situata sopra la pupilla vi aiuterà a ottenere una vista migliore del fondo dell'occhio durante l'intervento chirurgico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Albino normale coniglio retina in vivo imaging. In vivo BAF, IR-cSLO e SD-OCT immagini con una retina di coniglio albino normale. Un colpo di SD-OCT con la corrispondente etichettatura dei diversi strati della retina è visto nell'immagine SD-OCT: IPL (strato plessiforme interno), GCL (strato delle cellule del ganglio), OLM (esterno, INL (strato nucleare interno), OPL (strato plexiform esterno), ONL (strato nucleare esterno) membrana di limitazione), EZ (zona dell'elissoide), OS (segmenti esterni), EPR (epitelio pigmentato retinico) e BM (membrana di Bruch). Scala bar = 1 mm (immagini BAF e IR-cSLO), 200 µm (immagini SD-OCT). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: iniezioni di Subretinal sospensione nel modello grande-eyed coniglio. (A) BAF, MC e SD-OCT immagini di iniezione subretinal di 1mm NaIO3 3 mesi dopo induzione di danno. Si noti il hypo-BAF circondato da aree di iper-BAF corrispondenti la vescichetta e la neuroretina degenerato in SD-Oct (B), BAF, MC, e immagini di SD-OCT di occhi pretrattati con 1 mM NaIO3 per 1 settimana seguita da trapianto di subretinal di 50.000 hESC-RPE in sospensione e analizzati 3 mesi dopo trapianto. Notare le aree iper-BAF nell'immagine BAF, l'assenza di cellule pigmentate integrate in MC e la neuroretina atrofica nelle immagini SD-Oct (C) MC e SD-OCT corrispondente agli occhi ingenui non pretrattati 3 mesi dopo il trapianto subretinal di hESC-RPE in sospensione. Nota le aree pigmentate sull'immagine MC e la struttura di neuroretinal conservato su SD-Oct. SD-OCT scansione aerei sono contrassegnati (freccia verde). Frecce bianche segnano il confine delle vescichette in it-faccia e immagini SD-OCT. Scala bar = 1 mm (immagini BAF e MC), 200 µm (immagini SD-OCT). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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In questo protocollo, la generazione di un modello di grandi occhi di GA e suo uso preclinico per valutare hESC-RPE integrazione in vivo è descritto.

Per la traduzione di terapie rigenerative per GA e malattie correlate nella clinica7, è importante sviluppare e ottimizzare metodi che acquisire fedelmente i metodi clinici per trapianto e di imaging. Il coniglio è in questo aspetto attraente: ha un occhio relativamente grande che permette l'ambulatorio intraoculare e l'uso di formazione immagine standard, ed è a buon mercato e facilmente alloggiati rispetto agli altri animali dagli occhi grandi.

Descriviamo l'uso di standard transvitreal calibro 25 pars plana vitrectomy tecnica per la creazione di Sub-retinici vescichette a indurre danni sub-retinico o a trapianto di CSE-RPE. Inizialmente, abbiamo usato un set-up di 3-porta, come illustrato in Figura 1B, con l'intenzione di utilizzare la porta di infusione (trocar), nel caso in cui un vitrectomy è stato effettuato durante la procedura. Tuttavia, dal momento che non abbiamo trovato un vitrectomy per essere necessario per l'applicazione di iniezioni Sub-retiniche, la porta di infusione è stato omesso. Tuttavia, la terza opzione di porta dovrebbe rimanere se la procedura è ulteriormente adattata e viene eseguita una vitrectomia.

Il coniglio dagli occhi grandi è una modella ben affermata oculare con dati accumulati sull'anatomia e fisiologia nel corso degli ultimi secoli8. Inoltre, i conigli sono facili da maneggiare e razza, economicamente interessante (ad es., acquisto, stabulazione e nel governo), e prontamente disponibili rispetto ad altri modelli di mammifero dagli occhi grandi. Dei principali vantaggi di un grande modello di eyed è che permette l'uso di tecniche di imaging clinici ad alta risoluzione, che a sua volta consentire per il rilevamento delle cellule trapiantate hESC-RPE nello spazio subretinal nel corso del tempo. Tuttavia, nonostante lagomorfi essendo filogeneticamente più vicino agli esseri umani di roditori, si deve constatare che essi possiedono una retina di merangiotic e una striscia visiva, rispetto ad una retina di holangiotic e una fovea presente in primati9. Merangiotic retina significa che forniscono la maggior parte del sangue della retina interna è derivato da choriocapillaris, una differenza che uno deve prendere in considerazione perché può aumentare il rischio di lesione e di emorragia. Un vantaggio sperimentale è che permette per la modellazione di fasi precedenti di GA seguito subretinal vescichette di soluzioni fisiologiche da solo, come è stato precedentemente dimostrato1,3. Questi studi hanno suggerito che una vescichetta subretinal causando ipossia retinica temporale nel milieu merangiotic può essere sufficiente a causare la morte dei fotorecettori; Tuttavia, in questo contesto, perdita di RPE ha dimostrato di più probabile essere generato dal flusso sub-retinico indotto utilizzando una siringa da 1 mL e un 50 µ l di vescichetta, un fenomeno casuale che a sua volta rafforza il neuro-retinici atrofia. Di conseguenza, il volume di vescichetta può avere un effetto diretto sul danno retinico elasticizzato causato, vale a dire che maggiore è il volume utilizzato (ad esempio, 100 µ l, come è stato utilizzato in altri studi10), può diventare più dannosa.

Un passaggio fondamentale per garantire l'integrazione delle cellule iniettate è quello di evitare reflusso delle cellule nel corpo vitreo durante l'iniezione e il posizionamento dell'ago nello spazio subretinal. Se posizionato troppo in profondità, la barriera/coroide retinica esterna sarà penetrata e cellule del sistema immunitario possono invadere lo spazio sub-retinico, causando il rigetto immunitario, nonostante l'uso di immunosoppressione. Un altro aspetto importante per il successo del trapianto è lo stato del vitreo. Nel presente modello, vitrectomia non viene eseguita al fine di ridurre al minimo il trauma chirurgico e reflusso. Tuttavia, è stato notato che in alcuni occhi è difficile ottenere una posizione di punta adeguata sulla retina, come la punta si blocca nel interphase vitroso pre-retinico che porta alla formazione di piccole o addirittura nessuna vescichette. Anche se è un evento relativamente raro, indicano che variabilità del coniglio vitroso ha bisogno di essere presi in considerazione durante la chirurgia e l'analisi post-chirurgica.

Inoltre, la corretta iniezione di Triamcinolone è fondamentale per evitare di oscurare il fundus di cristalli bianchi di steroidi, che ostacolano quindi la chirurgia e la visualizzazione del fondo post-chirurgica di SD-OCT. Per ridurre al minimo questo problema, l'iniezione di Triamcinolone dovrebbe essere fatto nel quadrante temporale inferiore. Allo stesso modo, trocar va posizionati a 1-2 mm dal limbus per evitare l'emorragia vitrosa dal corpo ciliare e toccare la lente di separarle grande coniglio con l'ago. Un tocco di lente causerà una cataratta che a sua volta impediranno la corretta visualizzazione dello spazio sub-retinico durante la formazione immagine postoperatoria.

Steroidi, compreso il triamcinolone, essi stessi possono causare le cataratte nel tempo. Non abbiamo osservato questo dopo la somministrazione di triamcinolone per fino a 8 mesi. Tuttavia, è probabile che le cataratte steroide-indotto si svilupperanno se amministra triamcinolone nel corso di lunghi periodi di tempo.

I metodi descritti possono essere utilizzati sia per addestramento chirurgico per analisi di cella-integrazione e funzione come descritto qui e nelle nostre pubblicazioni precedenti. Il metodo è inoltre alta rilevanza per l'amministrazione di vettori virali Sub-retinici ora in sperimentazione clinica per diverse distrofie retiniche ereditarie. Future modifiche possono includere trapianto dei materiali più complessi, quali vettori di foglio e biogels. Emergere di nuovi metodi di imaging clinici, questi saranno facilmente adattati all'occhio di coniglio, possibilmente senza modifiche.

In conclusione, il modello di coniglio grande-eyed è dimostrato di essere un modello pre-clinico rilevante che ha diversi vantaggi rispetto ai modelli del roditore per i) ricapitolare fasi differenti di GA, ii) applicando metodi di formazione immagini e chirurgici paziente rilevanti e iii ) valutazione di integrazione di cellule del donatore per essere utilizzato come terapia sostitutiva delle cellule per GA e disturbi correlati.

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Disclosures

Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Karolinska Institute, Fondazione della Crown Princess Margareta per i non vedenti, la Fondazione di Jordan Edwin per ricerca oftalmologica, la Fondazione svedese di occhio, il re Gustav V Foundation, la ARMEC Fondazione di Lindeberg e la Fondazione di Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

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References

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Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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