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Biology

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

Abstract

지리적 위축 (GA), 건조 연령 관련 황 반 변성의 늦은 단계는 망막 안료 상피 (RPE) 계층, 중요 한 망막 구조 (예를 들면, 대뇌)의 후속 퇴보로 연결의 손실에 의해 특징은 발생 심한 시력 장애입니다. 마찬가지로, RPE 손실 및 시력 감소는에서 보인다 장기 따라 최대 intravitreal 항 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 치료를 받고 고급 젖은 연령 관련 황 반 변성 (AMD)과 환자의. 따라서, 한편으로, 그것은 근본적인 RPE 세포 대체 요법으로 사용할 수 있는 무제한 소스에서 효율적으로 파생. 다른 한편으로, 동작 및 질병 반하는의 모델에서 파생 된 셀의 통합 수술을 평가 하는 것이 중요 하다 고 이미징 방법으로 인 간에 적용 된 수로 닫습니다. 여기, 우리 제공 조지아의 전 임상 모델의 생성을 설명 하는 우리의 이전 간행물에 따라 상세한 프로토콜 흰둥이 토끼 눈을 사용 하 여 인간 배아 줄기 세포의 평가 파생 된 망막 색소 상피 세포 (hESC-RPE) 대에 임상 관련 설정입니다. 차별화 된 hESC RPE는 순진한 눈 또는 NaIO3눈에 이식-25 G transvitreal 동위 플 기술을 사용 하 여가 같은 망막 변성을 유도. 퇴 화와 이식 분야의 평가 복합 고해상도 비-침략 적 실시간 이미징에 의해 수행 됩니다.

Introduction

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이 프로토콜 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE의 통합의 평가 허용 하는 지리적 위축 (GA)의 큰 눈이 전 임상 모델의 생성을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 hESC1, 외부 망막 손상 및 GA 같은 표현 형의 창조에서 RPE 세포의 풍부한, 순수, 고 기능 인구 생산을 보여 주는 3 최근 출판물에 사용 된 생리 소금 솔루션 (, BSS와 PBS) 또는 토끼 눈2,3NaIO3 의 subretinal 주입에 의해 유도. 우리 hESC RPE의 하위 망막 정지 이식 포토 리셉터 구조 용량2광범위 한 기능 monolayers 형태로 입증 되었습니다.

몇 가지 장점이 동반 질병의 조지아 모델의 생성에 대 한 토끼 눈의 사용. 첫째, 크기 토끼 눈의 70%는 성인 인간의 눈의 볼륨은, 일상적으로 사용 하는 작은 설치류 눈 (1000 셀 / µ L 50, 000 셀 / µ L)4 보다 훨씬 낮은 세포 밀도 사용 하 여 임상적으로 의미 있는 이식 수 , 5. 둘째, 설치류에 수술은 일반적으로 맥락 막의, 망막 장벽을 타협 하 고 잠재적으로 염증 반응과 가능한 거부6을 통해 transscleral. 두 요소는 함께 multilayering와 이식된 세포와 방해 네이티브 망막 조직에 이식된 세포의 전반적인 가난한 통합의 응집을 발생할 수 있습니다. 그러나, 큰 눈 토끼 모델 계측 임상 설정으로 동일과 수술 기법을 수행할 수 있습니다. 셋째, 눈이 큰 모델도 고해상도 허용 vivo에서 이미징 및 이식된 세포와 시간1,2,3overlying 망막의 모니터링 합니다. 따라서, 우리는 정상 및 병에 걸리는 망막과 망막 하 공간의 연구에 관심을 가진 사람에 대 한 설치류에 매력적인 대안이 되어야 임상적으로 적절 하 고 비용 효율적인 전 임상 모델을 설명 합니다.

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Protocol

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다음 프로토콜 카롤 린스 카 Instituet의 동물 보호 지침을 따릅니다. 뉴질랜드 백 변종 토끼 (자료 테이블)를 사용 하 여 모든 동물 실험 지역 동물 윤리 위원회 (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd)에 의해 승인 되었습니다 (허용: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3)의 사용 및 전송 hESC RPE (dnr 2013/813-31/2)의 조작 또한 스웨덴 입법 및 카롤 린스 카 Institutet 규정 이며 지역 인간의 윤리 위원회 (에 의해 승인 되었습니다. Regionala Etikprövningsnämnden 나 스톡홀름).

1. subretinal 주입 나트륨 요오드 산 염 (NaIO3) 눈 큰 동물 모델

  1. 동물 마 취 제 35 mg/kg의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리와 30 G 주사기를 사용 하 여 식 염 수에 5 mg/kg xylazine anesthetize 그리고 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine 혼합 사용 안 하는 국 소 약으로 학생 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리의 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.
  2. 외과 의사 (그림 1A)를 직면 하 고 머리와 수술 현미경 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. 사용 소금 솔루션 (BSS) 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 균형.
  3. 미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 microsurgical 악기 (그림 1B)의 삽입에 대 한 비 밸브 trocars와 함께 갈 거 예요. 다기능 vitrectomy 기계는 주입 정, endoillumination, vitrector, 및 endolaser를 연결 하는 포트. Subretinal 주사만 endoillumination은 필수, 2-포트 설정을 충분 하 게 하. 상단 왼쪽된 trocar를 통해는 endoillumation를 삽입 하 고 위 오른쪽 trocar subretinal 주입 정에 대 한 사용.
    1. 3-포트 설정에 대 한 BSS 주입 정에 대 한 낮은 임시 trocar를 사용 합니다. 경우 (예: vitrector) 옵션 악기는 상단 오른쪽 trocar를 통해 그들을 삽입, 사용.
    2. Limbus를 잡아 삽입 사이트 overlying 결 치환 발톱된 집게를 사용 하 여에서 위 2 trocars 1-2 m m를 삽입 합니다.
    3. trocars는 30-45 ° 각도로 limbus 병렬, 삽입 된 transsclerally는 그리고는 trocar 끝의 중간 다는 것을 확인 하십시오. 다음 trocar 90 °를 돌아서 눈의 후부 극에 눈으로 미리. 이 절차는 sclerotomies에서 수술 후 누설을 방지 하 고 또한 endophthalmitis (즉, 눈에 세균 감염)의 위험을 감소. Trocar 위치 또한 그림 2B 참조.
    4. 눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.
    5. 확장 튜브 (도우미 운영)에 연결 된 1 mL 주사기와 38 G polytip 정 (외과 의사에 의해 운영)으로 NaIO3 의 500 µ L를 그립니다.
    6. 상단 왼쪽된 trocar 통해 endoillumination 프로브와 상단 오른쪽 trocar 통해 주입 정을 삽입 하 고 망막, 시 신경 머리 바로 아래 지역에 대 한 목표로 향해 유리 공간을 통해 정 미리.
    7. 정 초점 화이트닝 표시 될 때까지 천천히 망막을 터치의 팁을 수 있습니다. 자체 사출 subretinal 납품을 허용 하는 망막에 침투 합니다. 이 출혈 될 수 있으므로 망막, 관통 정 맥을 하지 마십시오.
    8. 5 s 동안 subretinally NaIO3 의 50 µ L를 주사. 기본 맥락 막과 망막 사이 자연 분열 비행기 때문에, 명확 하 게 보이는 반투명 bleb 주사 동안 점차적으로 형성 한다.
    9. 주입, 동안 천천히 바늘을, 철회 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.
    10. Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.
  4. Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.
  5. 사용 후, 그들 immersing 몇 초에 대 한 첫째 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.
  6. 그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예를 들어, immunohistochemistry 목적을 위해) 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사 ( 재료의 표참조).
  7. HESC RPE 세포의 이식으로 진행 7 일 기다립니다.

2. subretinal 이식 치료 동물에서 hESC RPE 세포의

  1. 삽입 1-2 m m 낮은 임시 사분면 limbus에서 hESC RPE의 이식 하기 전에 1 주 30 g 주사 바늘을 사용 하 여 마 취 동물에 intravitreal triamcinolone의 2 mg (100 µ L)를 관리 하 고 다시 3 개월 마다 그것을 관리. 렌즈 터치를 피하기 위해 눈의 후부 극으로 팁을 가리키고 있는지 확인 합니다.
  2. 앞에서 설명한1hESC RPE 단층 문화.
  3. 셀 차별화 ( 재료의 표참조)의 미디어 24 잘 confluent hESC RPE 단층을 제거 하 고 각을 세척 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS의 500 µ L로 잘. 2 세척의 총에 대 한이 작업을 한 번 더 반복 합니다.
  4. 상쾌한 삭제, 잘, 당 trypsin의 500 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 12 분 동안 품 어
  5. 접시를 기울기와 트립 신 (셀 플레이트에 연결 된 남아 있어야 한다)를 조심 스럽게 제거. 부드러운 pipetting, 또는 심지어 필요한 경우, 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 근 근이 살아가고에 의해 신선한 37 ° C prewarmed 차별화 미디어의 800 µ L에서 세포를 수집 합니다.
    참고: 셀 덩어리는 관찰 하는 경우 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 합니다.
  6. 0.2%를 사용 하 여 hemocytometer 챔버에 Count 셀 Trypan 블루, 제조업체의 지침에 따라.
  7. 실 온에서 차별화 미디어와 원심 분리기 세포, 5 분 300g x 5 mL를 추가 합니다.
  8. 상쾌한 무시 하 고 갓 필터 소독 PBS (25 m m 주사기 필터를 통해 전달) 1, 000 셀 / µ L의 최종 농도에 있는 펠 릿 resuspend.
  9. 약 수 600 µ L aliquots와 얼음까지 하 고 수술 하는 동안에 계속 이전 세포 현 탁 액.
  10. 30 G 주사기를 사용 하 여 염 분 35 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리 하 여 동물을 anesthetize. 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine amix 사용 안 하는 국 소 약으로 눈동자를 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리에 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.
  11. 외과 의사를 직면 하 고 머리와 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. BSS를 사용 하 여 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해.
  12. 미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 단계 1.3과 그림 2에 설명 된 대로 동일한 위치에 배치 하는 trocars와 함께 갈 거 예요. 이전 sclerotomies 표시 되는 경우 단지 인접 trocar 삽입을 수행 하지만 하지 이들을 통해, 수술 후 누설의 위험을 최소화 하기 위해.
    1. 눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.
    2. 적절 한 팁 (참조 단계 1.3.5 1.3.6) 위치, 후 부드럽게 혼합 hESC RPE 정지 (50000 셀)의 50 µ L를 subretinally 주사. NaIO3 청소용된 지역 특성 "금속" 엔도 조명 반사에 의해 구별의 센터에 대 한 목표. Neurosensory 망막 명확 하 게 보이는 bleb을 만들기 쉽게 구분 해야 합니다. 플러시 바늘 때문에 셀 막힘을 피하기 위해 사용 토끼/후 살 균 H2O 사이 바늘을 묶습니다. 변경 바늘 막힘 때 것으로 나타났습니다.
    3. 주입, 동안 천천히 바늘을 취소 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.
    4. Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.
  13. Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.
  14. 사용 후, 그들 immersing 몇 초, 첫째로 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.
  15. 그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예: immunohistochemistry 목적), 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사.

3. Vivo에서 망막 및 Subretinal 이미징

  1. 함께 제공 된 소프트웨어와 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 장치를 사용 하 여 (재료의 표 참조)를 제조업체의 지침에 따라 치료 동물의 횡단면 b-스캔. 이미지 흐림 방지, 매 30-60 s 국 소 염 분으로 홍 조에 의해 각 막 촉촉한을 유지 해야 합니다.
    1. 마 취 및 눈동자 크기 동물 (단계 1.1 및 2.10 참조)를 가리지 경로에서 악기 광원 토끼 망막에 조정 산에 놓습니다.
    2. 3 10 월 스캔 동시 적외선 공초점 레이저 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (IR-cSLO) 반사율 참조 이미지 삽입 된 영역의 상단, 중앙, 및 더 낮은 부분을 나타내는 얻을.
    3. CSLO 블루와 en 얼굴 저 이미지를 얻을, 녹색, 적외선, 그리고 다 색 레이저 반사율 (, 여러 개의 동시 레이저 색상), 각각.
    4. SD-10 월 장치의 블루 빛 레이저 기능을 사용 하 여 블루 라이트 autofluorescence (BAF) 이미지를 캡처하십시오.

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Representative Results

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BAF, IR-cSLO, 및 정상적인 흰둥이 토끼 망막의 SD-10 월의 대표 vivo에서 이미지 그림 2에 표시 됩니다. 빛의 반사 SD 10 월 악기에 의해 점령의 그들의 독특한 레벨 다른 망막 층 note

그림 1A , 그림 1B하위 망막 blebs 만들려면 설치 설명 된다: 쓰는 렌즈를 피하기 위하여 3 trocars (그림 1B) limbus까지 1-2 m m의 삽입을 허용 하도록 눈 뚜껑으로 뚜껑 견인 위치 터치, 그리고 30-45 ˚ limbus 병렬 각도에서. Trocars는 선택적 주입 정 빛, 및 공 막 엔 통해 주사 바늘의 도입을 수 있게 된다. 외과 절차는 수행 하는 동안 플랫 콘택트 렌즈 함께 넓혀 진된 눈동자 눈 저와 하위 망막 공간 보기를 촉진할 것 이다.

1mm NaIO3 솔루션의 50 µ L의 주입 후 주입 후 3 개월 그림 3A 에서 SD 10 월 이미지에 표시 된 대로 bleb subretinal 공간을 해결 하 고 점차적으로 외부 망막 타락 한에 생성 됩니다. 레이어의 바깥쪽 neuroretinal SD 10 월 및 hypo-BAF 영역에서 해당 RPE 손실 따라서 조지아 같은 표현 형 휴양 하 숱이 주셔서 감사 합니다. 손상의 지역의 식별, 시 50 µ L 볼륨에 50000 hESC RPE 이식, 하는 BAF와 그림 3B에서 다 색 (MC) 이미지에 표시 된 대로 두 번째 bleb을 만들기 위해 다시 주입 됩니다. Inferiorly 손상, MC 이미지에 안료 분야의 부재와 함께 SD 10 월 스캔에 표시 된 기본 RPE의 만성 스트레스의 지표의 영역의 경계선에는 초점 증가 하이퍼-BAF와 적당 한 하이퍼 BAF 지역에 가벼운을 인식 한다. 청소용 비 눈 색소 세포의 패치 (MC) 이미지와 SD 10 월 검사에서 잘 보존 된 망막 구조를 보여주는 hESC-RPE (50000 셀)의 50 µ L의 주입에 해당 하는 bleb 비교 (그림 3C) 표시 됩니다.

공동으로,이 절차와 방법론 허용 hESC RPE의 subretinal 정지 이식의 통합 연구 관련 모델에 조지아

Figure 1
그림 1: 주입 설정 최대 (A) 사진 수술 설정 하위 망막 주사에 대 한 묘사. 동물 (왼쪽) 수술 현미경 아래에 배치 됩니다 및 외과 의사 endoillumination 프로브를 통해 왼쪽 손에, 왼쪽된 trocar 삽입을 보유 하 고 intravitreal 수술 악기 (예: subretinal 주입 정 맥)을 통해 삽입 오른쪽 (가운데)에서 왼쪽된 trocar. 플랫 콘택트 렌즈는 각 막에 수 수는 저의 확대 보기는 수술 중 (오른쪽). (B) 회로도 뷰 옵션의 도입을 용이 하 게 trocars와 함께 30-45 ° 병렬 각도에 장소 1-2 m m는 limbus에서 깊은 삽입 trocars에서 젖꼭지에 뚜껑 견인 흰둥이 토끼 눈의 닫기 정 맥 주입, 빛, 그리고 주입 바늘 눈동자 위에 위치한 평면 콘택트 렌즈는 수술 동안 눈 저의 더 나은 시야를 얻을 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 일반 알 비 노 토끼 망막 vivo에서 화상 진 찰. Vivo에서 BAF, IR-cSLO, 및 SD 10 월 이미지는 일반 알 비 노 토끼 망막을 나타내는. SD-10 월 이미지에서 볼 수 다른 망막 층의 해당 라벨로 SD-10 월의 최대 타격: INL (안 핵 층), ONL (외부 핵 층), 옴 (외부, GCL (신경 절 세포 층), IPL (내부 plexiform 레이어), OPL (외부 plexiform 레이어) 막 제한), EZ (둥글지 영역), OS (외부 세그먼트), RPE (망막 안료 상피), 및 BM (Bruch의 막). 바 스케일 1mm (BAF와 IR cSLO 이미지) = 200 µ m (SD 10 월 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 큰 눈 토끼 모델에서 Subretinal 정지 주사. (A) BAF, MC, 그리고 SD 10 월 이미지 손상 유도 후 1 m m NaIO3 3 개월의 subretinal 주입. Hypo-BAF는 bleb 및 퇴 화 한 neuroretina는 SD-10 월 (B) BAF, MC에 해당 하는 하이퍼 BAF 지역에 의해 포위 하 고 눈의 SD 10 월 이미지 청소용 1 m m NaIO3 1 주 뒤에 50, 000의 subretinal 이식에 대 한 서 스 펜 션 및 이식 후 분석된 3 개월 hESC RPE. BAF 이미지, MC에 통합된 색소 세포와 SD-10 월 (C) 엠씨와 SD 10 월 이미지에 해당 하는 청소용된 비 순진한 눈의 subretinal 이식 후 3 개월에 위축 하 게 neuroretina의 부재에서에서 하이퍼 BAF 영역 note 서 스 펜 션에서 hESC RPE입니다. 참고 MC 이미지에 안료 분야 및 보존 된 neuroretinal 구조 SD 10 월 SD-10 월에 스캔 비행기 (녹색 화살표)으로 표시 됩니다. 흰색 화살표 blebs en 얼굴 SD 10 월 이미지에 테두리를 표시합니다. 바 스케일 1mm (BAF와 MC 이미지) = 200 µ m (SD 10 월 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜에서 hESC RPE 통합에서 vivo에서 평가 대 한 조지아와 그것의 임상 사용의 눈이 큰 모델의 생성을 설명 합니다.

번역에 대 한 재생 치료의 조지아 및 관련된 질병에 대 한 클리닉7에, 그것은 개발 하 고 충실 하 게 이식 및 이미징에 대 한 임상 메서드를 캡처하는 방법을 최적화 하는 것이 중요. 매력적인이 측면에서 토끼가: 비교적 큰 눈 안 구내 수술 및 표준 이미징의 사용을 허용 하 고 저렴 하 고 쉽게 지 내게 다른 눈이 큰 동물에 비해입니다.

우리는 하위 망막 blebs 하위 망막 손상을 유발 하거나 이식 hESC RPE의 창조에 대 한 표준 transvitreal 25 게이지 동위 플 vitrectomy 기술의 사용을 설명 합니다. 그림 1B에 나와 있는 경우는 vitrectomy 절차 동안 수행한 주입 포트 (trocar)를 사용 하 여 의도로 처음, 우리 3-포트 설정 사용. 그러나, 하위 망막 주사를 적용 해야 하는 vitrectomy 발견 하지 이후 주입 포트 생략 되었습니다 했다. 그럼에도 불구 하 고, 세 번째 포트 옵션 절차 더 적응 하 고는 vitrectomy 수행 하는 경우 유지 됩니다.

큰 눈이 토끼는 해부학과 생리학에 축적 된 데이터와 잘 설립 눈 모델 지난 세기8. 또한, 토끼는 쉽게 핸들을 품종, 경제적으로 매력적(, 구매, 주택, 및 유지),그리고 다른 눈 큰 포유 동물 모델에 비해 쉽게 사용할 수 있습니다. 큰 눈이 모델의 주요 장점은 고해상도 임상 이미징 기술, 시간이 지남에 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE 세포의 추적에 대 한 허용 차례로 사용 하면은. 그러나, 토끼목 phylogenetically 설치류 보다 인 간에 게 가까이 되 고에 불구 하 고 그것은 진술 되어야 한다 그들은 소유 merangiotic 망막 그리고 holangiotic 망막와 fovea에 영장류9에 비해 시각적인 조 흔. Merangiotic 망막 의미 내부 망막의 혈액의 대부분을 공급 하는 choriocapillaris, 한 병 변 및 출혈의 위험을 증가 시킬 수 있습니다 그것 때문 이라고 생각 하는 차이에서 파생 됩니다. 한 실험 장점은 모델링 조지아로 이전 시연된1,3왔다 혼자, 생리 솔루션의 subretinal blebs 다음의 초기 단계에 대 한 수 있습니다. 이러한 연구 제안 merangiotic 환경에서 시간적 망막 저 산소 증을 일으키는 subretinal bleb 포토 리셉터 죽음;을 일으킬 정도 있을 수 있습니다. 그러나, 이런이 맥락에서 RPE 손실 대부분 50 µ L bleb 볼륨, 차례 차례로 potentiates 신경 망막 위축 무작위 현상 1 mL 주사기를 사용 하 여 유도 된 망막 하위 흐름에 의해 생성 될 표시 되었습니다. 따라서, bleb 볼륨 더 해로운가 될 수 있다 망막 스트레치 피해 발생, 큰 볼륨 사용 (예를 들어, 100 µ L, 다른 연구10에 사용 되었습니다), 의미에 직접적인 영향을 가질 수 있습니다.

삽입 된 셀의 통합을 보장 하기 위해 중요 한 단계 주입, 그리고 subretinal 공간에서 바늘의 위치는 동안 유리 체로 셀의 역류를 방지 하는 것입니다. 너무 깊이 위치, 외부 망막 장벽을/맥락 막 관통 될 것 이다 하 고 면역 세포 면역 억제의 사용에도 불구 하 고 면역 거부를 일으키는 하위 망막 공간을 침범 될 수 있습니다. 이식 성공 위한 또 다른 중요 한 측면 유리 체의 상태입니다. 현재 모델에서 vitrectomy 역류와 수술 외상을 최소화 하기 위해 수행 되지 않습니다. 그러나, 그것은 몇 가지 눈에 어렵다는 것 팁 작은 또는 심지어 아무 blebs의 형성으로 이어지는 전 망막 유리 체 interphase에 걸리면 망막에 적절 한 팁 위치를 발견 되었습니다. 그것은 상대적으로 드문 이벤트는 유리 토끼의 가변성 고려해 수술과 수술 후 분석 하는 동안 필요를 나타내는.

또한, triamcinolon의 적절 한 주입은 수술, 그리고 수술 후 저 시각화 SD-10 월에 의해 방해 다음 합니다 흰색 스테로이드 결정에 의해는 저 왜곡을 피하기 위해 중요 합니다. 이 문제를 최소화 하기 위해 triamcinolon의 주입은 낮은 임시 사분면에서 행해져야 한다. 마찬가지로, 속눈썹 몸과 바늘 콘텐트의 큰 토끼 렌즈를 만지기에서 유리 체 출혈을 피하기 위해 limbus에서 1-2 m m trocars에 배치 되어야 합니다. 렌즈 터치 백 내장 수술 후 이미징 중 망막 하 공간의 적절 한 시각화를 방해 차례로 것입니다 발생 합니다.

스테로이드, triamcinolone를 포함 하 여 스스로 시간이 지남에 따라 백 내장을 일으킬 수 있습니다. 우리 하지 최대 8 개월까지 triamcinolone 관리 다음 이것을 관찰 했습니다. 그러나, 그것은 가능성이 스테로이드 유발 백 내장 triamcinolone 시간의 광대 한 기간 동안 관리 하는 경우 개발할 것입니다.

외과 훈련 및 셀 통합 분석 기능으로 여기 우리의 이전 출판물에서 설명 설명된 메서드를 사용할 수 있습니다. 메서드를 사용 하면은 또한 여러 가지 유전 망막 dystrophies에 대 한 임상 시험에서 지금에 하위 망막 바이러스 성 벡터의 관리에 대 한 높은 관련성을 있다. 향후 수정 시트와 biogels와 같은 더 복잡 한 재료의 이식을 등이 있습니다. 새로운 임상 이미징 방법 등장,이 수정 없이 가능 하 게 토끼 눈에 쉽게 적응 될 것입니다.

In conclusion, 토끼 눈이 큰 모델 i) 조지아의 다른 단계 업과, ii) 적용 환자 관련 수술 및 이미징 방법, 및 iii에 대 한 설치류 모델에 비해 몇 가지 장점이 관련 전 임상 모델 시연 )가 및 관련된 질환에 대 한 세포 대체 요법으로 사용 될 기증자 세포의 통합 평가.

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Disclosures

작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

Acknowledgments

이 연구는 시각 장애, 안과 연구, 스웨덴 눈 재단, 임금 Gustav V 재단, ARMEC는 에드윈 요르단 재단 재단법인 크라운 공주 Margareta 카롤 린스 카 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다 Lindeberg 재단, 그리고 Cronqvist 재단입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

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References

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  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
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지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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