Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Клетки сетчатки пигментного эпителия могут служить клетки заместительная терапия для передовые формы сухие возраста макулярной дегенерации. Этот протокол описывает генерации большой eyed модель географической атрофии и субретинальное трансплантация человеческих эмбриональных стволовых клеток пигмента сетчатки эпителиальных клеток в этой модели болезни.

Abstract

Географической атрофии (GA), поздней стадии сухие возраста макулярной дегенерации характеризуется потерей сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) слоя, который приводит к последующим дегенерации жизненно сетчатки структур (например, фоторецепторов) вызывает тяжелые зрением. Аналогичным образом ПЭС потери и снижением остроты рассматривается в долгосрочной последующей вверх больных с передовых влажные возраста макулярной дегенерации (AMD) лечении интравитреальные анти Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Таким образом с одной стороны, это основополагающее значение для эффективного получения НПП клетки от неограниченный источник, который мог бы служить в качестве заместительной терапии. С другой стороны важно оценить поведение и интеграции производных ячеек в модели болезни, влекущие за собой хирургические и тепловизионные методы как можно ближе к те, которые применяются в организме человека. Здесь, мы предоставляем подробный протокол, основанный на наших предыдущих публикаций, описывающий поколения доклинических модели GA с использованием белых кролика глаза, для оценки человеческих эмбриональных стволовых клеток получены клетки сетчатки пигментного эпителия (Госкомсанэпиднадзором ПЭС) в клинически значимых параметр. Дифференцированные Госкомсанэпиднадзором НПП пересаживают в наивные глаза или глаза с NaIO3-индуцированной GA-как дегенерация сетчатки, используя технику plana Парс transvitreal 25 G. Оценку выродились и пересаженные областей осуществляется смешанных с высоким разрешением неинвазивные в реальном времени изображений.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает поколения большой eyed доклинических модель географической атрофии (GA), которая позволяет оценить интеграции трансплантированных Госкомсанэпиднадзором-НПП в пространстве субретинальное. Здесь подробно описаны методы были использованы в 3 последних публикаций, которые демонстрируют производства обогащенного, чистый и функциональный населения НПП клеток с Госкомсанэпиднадзором1, а также создание внешнего повреждения сетчатки и фенотип GA-как индуцированных субретинальное инъекции физиологического солевых растворов (т.е., BSS и PBS) или3 NaIO в кролика глаза2,3. Далее мы продемонстрировали югу сетчатки подвеска трансплантации Госкомсанэпиднадзором-НПП образуют обширные функциональные монослои с фоторецепторных спасательных мощность2.

Несколько преимуществ сопровождать использование глаз кролика для поколения модели GA заболеваний. Во-первых размер кролика глаза, которая составляет 70% объема взрослого человеческого глаза, позволяет клинически значимого трансплантации используя плотность клеток, что намного ниже, чем обычно используется в небольших грызунов глаза (1000 клеток/мкл против 50 000 клеток/мкл)4 , 5. Во-вторых, хирургии в грызунов является обычно транссклеральная через хориоидея, который подрывает сетчатки барьер и потенциально вызывает воспалительной реакции и возможного отказа6. Оба этих фактора вместе может привести к multilayering и слипания пересаженные клетки и в целом плохой интеграции пересаженные клетки в нарушена родной ткани сетчатки. Однако большой eyed кролик модель позволяет выполнять хирургической техники с инструментированием идентичны в клинических условиях. В-третьих большими глазами модель также позволяет с высоким разрешением в vivo визуализации и мониторинга пересаженные клетки и вышележащих сетчатки через время1,2,3. Таким образом мы описываем клинически соответствующим и экономически эффективных доклинических модель, которая должна быть привлекательной альтернативой грызунов для тех, кто с интересом в исследованиях нормальных и больной сетчатки и югу сетчатки пространства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Следующий протокол следует правилам ухода за животными Karolinska Instituet. Все эксперименты на животных с использованием Новой Зеландии альбинос кроликов (Таблица материалов) были утверждены Комитетом по региональным животных этики (Stockholms Норра Djurförsöksetiska Nämnd) (разрешение: dnr 56/15). Использование Госкомсанэпиднадзором (dnr 2011/745-31/3) и передачи и манипуляции Госкомсанэпиднадзором-НПП (dnr 2013/813-31/2) также является шведское законодательство и правилам Каролинского института и был одобрен региональной человеческой этики (Комитет Regionala Etikprövningsnämnden я Стокгольм).

1. субретинальное инъекции иодат натрия (NaIO3) в животной модели с большими глазами

  1. Анестезировать животных внутримышечное введение администрацией в бедро с сочетанием кетамин 35 мг/кг и 5 мг/кг Ксилазина в солевой с помощью шприца 30 G, и расширяются учеников с актуальным глазные капли, используя сочетание cyclopentolate и 2,5% фенилэфрина 0,75%. Надлежащего анестезии подтверждается если животное не реагирует на жесткий щепотку ее задней ноги.
  2. Место кролика под хирургический микроскоп с головы перед хирургом (рис. 1A). Использование крышки втягивающего устройства для удаления веки и nictitans мембраны стерильной тканью для сведения к минимуму риска заражения. Использование сбалансированного солевого раствора (BSS) для предотвращения сухости под наркозом в обоих глазах.
  3. Для микрохирургии, использования 2-порт (или дополнительный 3-порт) 25 G transvitreal Парс plana технику с-клапанная trocars для вставки микрохирургических инструментов (рис. 1B). Многофункциональные Витрэктомия машина имеет порты для подключения настой канюля, endoillumination, vitrector и Эндовенозное. Для субретинальное инъекции только endoillumination является обязательным, что делает 2-портовый set-up достаточно. Вставьте endoillumation через верхний левый троакара и использовать верхний правый троакар для канюля субретинальное инъекций.
    1. Для настройки 3-порт используйте нижней височной троакар для канюля инфузии BSS. Если дополнительные документы (например, vitrector), используется, вставить их через верхний правый троакар.
    2. Вставьте верхний 2 trocars 1-2 мм от лимба, используя когтистые щипцы захватить и вытеснять конъюнктивы, обволакивающие вставки сайте.
    3. Убедитесь, trocars вставленной transsclerally под углом 30-45° лимба параллельно и перейти к середине кончик троакар. Затем поверните троакара 90° и заранее в глаза, направленный на заднего полюса глаза. Эта процедура будет избежать послеоперационных утечки из sclerotomies, а также уменьшить риск эндофтальмита (т.е., бактериальной инфекции в глаз). Смотрите также Рисунок 2B троакара должности.
    4. Положите одного плоского контактные линзы на роговице визуализировать сетчатки, с синтетическими слезы как контакт гель между глаз и контактных линз (рис. 1A).
    5. Нарисуйте 500 мкл NaIO3 в 1 мл шприц, подключенных к Расширение трубки (управляемый помощник) и 38 G polytip канюли (управляется хирург).
    6. Вставьте endoillumination зонд через верхний левый троакара и канюли инъекции через верхний правый троакара и продвигать катетер через пространство стекловидного тела к сетчатке, направленных для области чуть ниже головы зрительного нерва.
    7. Разрешить кончик канюля медленно трогать сетчатки, пока фокуса отбеливание является видимым. Инъекции, сам будет проникать сетчатки, позволяя субретинальное доставки. Не позволяйте канюля проникают сетчатки, так как это может вызвать кровотечение.
    8. Придать 50 мкл NaIO3 subretinally течение 5 s. Поскольку существует естественный расщепления плоскость между сетчатки и основной сосудистое, ясно видны полупрозрачная пузырь следует постепенно формируют во время инъекции.
    9. Во время инъекции медленно втягивать иглы, но убедитесь, что кончик сохраняется в течение пузырь, чтобы свести к минимуму рефлюкса.
    10. После удаления endoillumation и инъекции канюли, удалить с помощью когтистые щипцами trocars и применить легкое давление для 30 s самоуплотняющийся швов менее sclerotomies, используя кончик или тупым концом щипцы.
  4. POST-surgically дать 10 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание. Не дают послеоперационные актуальные стероиды или антибиотики. Для Аналгетики дают 0,5 мл бупренорфина 0,3 мг/мл подкожно после хирургии, а также день после операции.
  5. После использования вымойте все инструменты, погрузив их на пару секунд сначала в 70% этиловом спирте, во-вторых в 45% этаноле и наконец в дистиллированной воде. Правильно высушите бумажным полотенцем.
  6. Посещают животных до тех пор, пока они вновь обрести достаточную сознания и разместить их все в одном encaged. При необходимости (например, для иммуногистохимии целей), усыпить животных путем внутривенных инъекций Пентобарбитал 100 мг/кг (см. Таблицу материалы).
  7. Ждать 7 дней, чтобы приступить к трансплантации клеток Госкомсанэпиднадзором НПП.

2. субретинальное трансплантации клеток Госкомсанэпиднадзором НПП в лечение животных

  1. Управлять 2 мг (100 мкл) исхода триамцинолона интравитреальные наркотизированных животных, с использованием инъекционной иглой 30 g, вставлены 1-2 мм от лимба в нижней височной квадранте 1 неделю до трансплантации Госкомсанэпиднадзором-НПП и повторно применять его каждые 3 месяца. Убедитесь, что точку кончик к заднего полюса глаза, чтобы избежать сенсорный линзы.
  2. Культура Госкомсанэпиднадзором НПП монослоя, как описано выше1.
  3. Извлеките носитель дифференциация клеток (см. Таблицу материалы) 24-ну вырожденная Госкомсанэпиднадзором НПП монослоя и мыть каждый хорошо с 500 мкл PBS без Ca2 + и Mg2 +. Повторите это действие еще раз, для в общей сложности 2 стирок.
  4. Отменить супернатанта, 500 мкл трипсина в колодец и инкубировать в течение 12 минут при 37 ° C.
  5. Наклона пластины и тщательно удалить трипсина (клетки должна оставаться прикрепленной к пластине). Соберите клетки в 800 мкл свежие 37 ° C подогретую дифференциация СМИ нежный закупорить, или даже соскоб, если необходимо, чтобы получить одну ячейку подвеска.
    Примечание: Используйте стрейнер клетки 40 мкм, если наблюдаются скопления клеток.
  6. Подсчет ячеек в камере Горяева, используя 0,2% Трипановый синий, согласно инструкциям производителя.
  7. Добавьте 5 мл дифференциации СМИ и центрифуги клеток при комнатной температуре, 300 x g за 5 мин.
  8. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в свежей стерилизовать фильтр PBS (прошло через фильтр шприц 25 мм) до конечной концентрации 1000 клеток/мкл.
  9. Алиготе предыдущих суспензию клеток в 600 мкл аликвоты и держать на льду до и во время операции.
  10. Анестезировать животных администрацией внутримышечно в бедро с сочетанием кетамина и 5 мг/кг Ксилазина 35 мг/кг в солевой с помощью шприца 30 G. Разбавить учеников с актуальным глазные капли, используя amix cyclopentolate и 2,5% фенилэфрина 0,75%. Надлежащего анестезии подтверждается если животное не реагирует щепотку жесткий в своей задней ноги.
  11. Место кролика с головой, сталкивается с хирургом. Использование крышки втягивающего устройства для удаления веки и nictitans мембраны стерильной тканью для сведения к минимуму риска заражения. Используйте BSS для предотвращения сухости под наркозом в обоих глазах.
  12. Для микрохирургии, использования 2-порт (или дополнительный 3-порт) 25 G transvitreal Парс plana технику с trocars размещены в той же позиции, как описано в шаге 1.3 и Рисунок 2. Если предыдущий sclerotomies являются видимыми, выполните троакара вставки просто рядом, но не через них, чтобы свести к минимуму риск послеоперационных утечки.
    1. Положите одного плоского контактные линзы на роговице визуализировать сетчатки, с синтетическими слезы как контакт гель между глаз и контактных линз (рис. 1A).
    2. После надлежащего кончик позиционирования (см. шаги 1.3.5 и 1.3.6) инъекционные 50 мкл нежно смешанные Госкомсанэпиднадзором НПП подвеска (50 000 клеток) subretinally. Цель центра области3 предварительно обработанных NaIO отличают характерный «металлик» Эндо освещение рефлекс. Нейросенсорные сетчатки следует отделить легко создание четко видны пузырь. Иглы стерильные H2O между ними кроликов и после использовать, чтобы избежать иглы, засорение вследствие ячейки флеш сгустки. Заметил изменение иглы при засорения.
    3. Во время инъекции медленно втягивать иглы, но убедитесь, что кончик сохраняется в течение пузырь, чтобы свести к минимуму рефлюкса.
    4. После удаления endoillumation и инъекции канюли, удалить с помощью когтистые щипцами trocars и применить легкое давление для 30 s самоуплотняющийся швов менее sclerotomies, используя кончик или тупым концом щипцы.
  13. POST-surgically дать 10 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание. Не дают послеоперационные актуальные стероиды или антибиотики. Для Аналгетики дают 0,5 мл бупренорфина 0,3 мг/мл подкожно после хирургии, а также день после операции.
  14. После использования вымойте все инструменты, погрузив их на пару секунд, прежде всего в 70% этиловом спирте, во-вторых в 45% этаноле и наконец в дистиллированной воде. Правильно высушите бумажным полотенцем.
  15. Посещают животных до тех пор, пока они вновь обрести достаточную сознания и разместить их все в одном encaged. При необходимости (например для иммуногистохимии целей), усыпить животных путем внутривенных инъекций Пентобарбитал 100 мг/кг.

3. в естественных условиях сетчатки и субретинальное изображений

  1. Используйте устройство спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) с сопровождающим программным обеспечением (см. таблицу материалы), для получения поперечных б сканов обработанных животных, согласно инструкциям производителя. Чтобы избежать размытие изображения, убедитесь, что держать влажной роговицы, перемещая с актуальным физиологического раствора каждые 30-60 сек.
    1. Место наркотизированных и ученик расширены животных (см. шаги 1.1 и 2.10) в поворотного кронштейна получить беспрепятственный путь из документа источника света на сетчатку кролика.
    2. Получите по крайней мере 3 октября сканирования с одновременным ИК конфокальная сканирования лазерного офтальмоскопия (IR-cSLO) отражения ссылки изображения представляющих верхней, Центральной и нижней части вводят области.
    3. Получать изображения глазного дна ан лица с cSLO синий, зеленый, инфракрасный и многоцветной лазерного отражения (например, нескольких одновременных лазерных цветов), соответственно.
    4. Захват изображения синий свет аутофлюоресценция (BAF) с использованием голубой свет лазера возможности устройства SD-Октябрь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Представитель в vivo изображения BAF, ИК cSLO и SD-Окт нормальной альбинос кролик сетчатки показаны на рисунке 2. Обратите внимание на различных слоях сетчатки с уровнями их отличительные захвачен SD-Окт инструмент отражения света.

В фигуры 1A и 1B рисунок, установки для создания югу сетчатки шелесту проиллюстрирован: крышка втягивающее устройство позиционируется, подвергая веки, чтобы разрешить вставку 3 trocars (рис. 1B) 1-2 мм от лимба, чтобы избежать объектив сенсорных и под углом 30-45 ˚ лимба параллельно. Trocars даст возможность введения факультативного настой канюля, помимо света и инъекционной иглы через склеры. Ученица расширены вместе с плоской контактной линзы облегчит представление глаз глазного дна и югу сетчатки пространства в то время как хирургическая процедура выполняется.

После инъекции 50 мкл 1 мм NaIO3 решения пузырь создается в субретинальное пространство, которое будет разрешать и постепенно вырождается внешней сетчатки, как показано в изображении SD-Октябрь на рисунке 3A через три месяца после инъекции. Ценим истончение внешней neuroretinal слоев в SD-OCT и гипо BAF областях, соответствующей потери ПЭС, повторно создавая фенотип GA-как. После определения области повреждения 50000 Госкомсанэпиднадзором НПП в объеме 50 мкл повторно вводят для трансплантации, создание второй пузырь, который решает, как показано в BAF и многоцветные изображения (MC) на рисунке 3B. Признать легкой до умеренной гипер BAF районы с фокуса увеличение гипер BAF книзу на границе области повреждения, свидетельствует о хронического стресса родной НПП, показано в SD-Окт сканирует наряду с отсутствием пигментированной областей в изображении MC. Пузырь, соответствующий инъекций 50 мкл Госкомсанэпиднадзором НПП (50 000 клеток) в глаза не подвергают предварительной показаны участки пигментные клетки в изображения (MC) и хорошо сохранившийся сетчатки структур в SD-Окт сканирования отображается для сравнения (рис. 3 c).

Коллективно эта процедура и методология позволяют исследования интеграции пересадке субретинальное подвеска Госкомсанэпиднадзором-НПП в соответствующей модели для GA.

Figure 1
Рисунок 1: инъекции установить вверх (A) фотографии, изображающие Хирургические установки для югу сетчатки инъекции. Хирург проводит endoillumination зонд вставляется через левый троакар в левой руке, животное находится под хирургический микроскоп (слева) и интравитреальные хирургический инструмент (например субретинальное инъекции канюли) вставить через левый троакар в правой руке (в середине). Плоский контактные линзы на роговице позволяет увеличенный вид глазного дна во время хирургического вмешательства (справа). (B) закрыть схема альбинос кролика глаза с крышкой втягивающего устройства на месте и сосок от trocars, добавить 1-2 мм, глубине от лимба и параллельных углом 30-45 °, вместе с trocars, которые облегчают внедрение необязательный настой канюля, свет и игла для инъекций. Плоский контактные линзы, расположенный на вершине ученик поможет получить более четкое представление о глазном дне глаза во время хирургической процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Нормальный альбинос кролик сетчатки в vivo томографии. В естественных условиях BAF, ИК cSLO и SD-Окт изображения, представляющие нормальной альбинос кролик сетчатки. Удар вверх SD-OCT с соответствующей маркировки различных слоев сетчатки рассматривается в изображении SD-Октябрь: GCL (слоя клеток ганглия), IPL (внутренний сплетениевидный слой), инл (внутренний ядерный слой), ОБН (внешний сплетениевидный слой), ONL (наружный слой ядерных), OLM (наружная пограничная мембрана), EZ (эллипсоид зона) и ОС (внешние слои), НПП (пигментный эпителий сетчатки), БМ (мембрана Бруха). Масштаб баров = 1 мм (BAF и ИК cSLO изображения), 200 мкм (SD-Окт изображения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: субретинальное подвеска инъекции в модели большими глазами кролик. (A) BAF, MC и SD-Окт образы субретинальное инъекции 1 мм NaIO3 3 месяца после повреждения индукции. Обратите внимание, гипо BAF, окруженный гипер BAF области, соответствующие пузырь и вырожено neuroretina в SD-Октябрь (B) BAF, MC, и SD-Окт изображения глаз предварительно обработанных с 1 мм NaIO3 за 1 неделю, следуют субретинальное трансплантации 50000 Госкомсанэпиднадзором НПП в подвеска и проанализированы через 3 месяца после пересадки. Обратите внимание, гипер BAF областей в изображении BAF, отсутствие комплексной пигментные клетки в MC и атрофических neuroretina в MC SD-Октябрь (C) и SD-Окт изображения, соответствующий не подвергают предварительной наивные глаза через 3 месяца после пересадки субретинальное Госкомсанэпиднадзором НПП в суспензии. Обратите внимание, что пигментированные области на изображении MC и структуры сохранились neuroretinal на SD-Октябрь SD-Окт проверки плоскости отмечены (зеленая стрелка). Белые стрелки Марк границы раковины в ванной лицо и изображения SD-Октябрь. Масштаб баров = 1 мм (BAF и MC изображения), 200 мкм (SD-Окт изображения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом протоколе описан поколения большой eyed модель GA и ее доклинических использования для оценки Госкомсанэпиднадзором НПП интеграции в естественных условиях .

Для перевода регенеративной терапии для GA и связанных с ними заболеваний в клинике7важно развивать и оптимизировать методы, которые добросовестно захватить клинические методы для трансплантации и изображений. Кролик — в этом аспекте привлекательным: он имеет сравнительно большой глаз, что позволяет внутриглазных хирургии и использования стандартных изображений, и это дешево и легко размещены по сравнению с другими большими глазами животных.

Мы описывают использование стандартных transvitreal 25-калибруйте Парс plana Витрэктомия технику для создания югу сетчатки шелесту побудить югу сетчатки повреждения или пересадка Госкомсанэпиднадзором НПП. Первоначально мы использовали 3-портовый настройки, как показано на рисунке 1B, с намерением используя порт инфузии (троакара), в случае, если Витрэктомия была исполнена во время процедуры. Однако поскольку мы не нашли Витрэктомия необходимы для применения югу сетчатки инъекции, настой порта было опущено. Тем не менее третий вариант порта должен оставаться если процедура дальнейшую адаптацию и Витрэктомия выполняется.

Большие глаза кролика является устоявшейся глазной модель с накопленных данных по анатомии и физиологии в последние8веков. Кроме того кролики легко ручка и породы, экономически привлекательной (например, покупки жилья и держать), и легко доступны по сравнению с другими моделями большими глазами млекопитающих. Основным преимуществом большой eyed модели является, что она позволяет использовать с высоким разрешением клинические методы обработки изображений, которые в свою очередь позволяют для отслеживания пересаженных Госкомсанэпиднадзором НПП клеток в субретинальное пространства с течением времени. Однако несмотря на зайцеобразных филогенетически ближе к людям, чем грызунов, необходимо заявил, что они обладают merangiotic сетчатки и визуального полоска, по сравнению с holangiotic сетчатки и фовеа в приматов9. Merangiotic сетчатки означает, что большая часть крови снабжения внутреннего сетчатки является производным от Хориокапилляров, разницей, что необходимо рассмотреть, поскольку он может увеличить риск поражения и кровоизлияния. Один экспериментальный преимуществом является, что она позволяет для моделирования более ранних этапах после субретинальное шелесту физиологического решений только, как это было ранее продемонстрировали1,3га. Эти исследования показывают, что субретинальное пузырь, вызывая височной сетчатки гипоксии в merangiotic обстановке может быть достаточно, чтобы вызвать смерть фоторецепторных; Однако в этом контексте НПП потери было показано наиболее вероятно быть порождена югу сетчатки потока, вызванные использованием шприц 1 мл и 50 мкл пузырь тома, случайное явление, которое в свою очередь потенцирует нейро ретиналь атрофии. Таким образом объем пузырь может иметь прямое влияние на сетчатки стрейч причиненный ущерб, это означает, что чем больше объем используется (например, 100 мкл, как была использована в других исследованиях10), тем более пагубно это может стать.

Важным шагом для обеспечения интеграции вводили клетки, чтобы избежать рефлюкс клеток в стекловидное тело во время инъекций и позиционирование иглы в субретинальное пространстве. Если позиционирован слишком глубоко, внешняя сетчатки барьер/сосудистое будет проникли и иммунные клетки могут вторгнуться югу сетчатки пространства, вызывая иммунной неприятие несмотря на использование иммуносупрессия. Еще одним важным аспектом для трансплантации успех это состояние стекловидного тела. В нынешней модели Витрэктомия не выполняется для того, чтобы свести к минимуму рефлюкс и хирургической травмы. Однако было замечено, что в глазах некоторых это трудно получить надлежащего кончик позицию на сетчатке, как кончик застревает в предварительно сетчатки стекловидного тела интерфазе, ведущих к образованию небольших или даже не шелесту. Хотя это относительно редкое событие, указывают, что изменчивость стекловидного тела кролика необходимо принимать во внимание во время операции и послеоперационный анализа.

Кроме того надлежащего введения Триамцинолон важно избежать заслоняя глазного дна, белый стероидных кристаллов, которые затем будут препятствовать хирургии и хирургической глазного дна визуализации SD-Окт. Для минимизации этой проблемы, инъекции Триамцинолон должно быть сделано в нижней височной квадранте. Аналогично trocars следует уделять 1-2 мм от лимба избежать стекловидного тела кровотечения из Цилиарное тело и трогательно оказывающиеся большой кролик объектив с иглой. Прикосновение объектив вызовет катаракты, которая в свою очередь будет препятствовать правильной визуализации югу сетчатки пространства при послеоперационном изображений.

Стероидов, включая триамцинолон, сами вызывают катаракты с течением времени. Мы не наблюдали это после триамцинолона администрации на срок до 8 месяцев. Однако вполне вероятно, что стероид индуцированной катаракты будет развиваться, если управляющей триамцинолона более длительные периоды времени.

Описаны методы могут использоваться как для хирургического обучения, так и для анализа клеток интеграции и функции, как описано здесь и в наших предыдущих публикациях. Этот метод также имеет большое значение для отправления югу сетчатки вирусных векторов теперь в клинических испытаниях для нескольких наследственной дистрофий сетчатки. Будущие изменения могут включать трансплантации более сложных материалов, таких как лист перевозчиков и biogels. Как возникают новые клинические методы обработки изображений, они будут легко адаптированы для кролика глаза, возможно без изменений.

In Conclusion модель большого глазами кролика показали соответствующих доклинических модель, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с грызун модели для i) изложив различные этапы GA, ii) применения пациент соответствующие методы хирургического и изображений и iii ) оценке интеграции доноров клеток, чтобы использоваться в качестве замены клеточной терапии для GA и расстройств, связанных с.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантов из Каролинского института, кронпринцесса Margareta фонд для слепых, Эдвин иорданской для офтальмологических исследований, Шведский фонд глаз, Фонд короля Густава V, ARMEC Линдеберг фонд и Фонд Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214, (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130, (1), 65-75 (2012).
Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter