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Biology

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Abstract

Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO3-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.

Introduction

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Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs1, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO3 en el conejo ojo2,3. Hemos demostrado además que trasplantes de sub-retinal de la suspensión de células RPE forman monocapas funcionales extensa con fotorreceptor rescate capacidad2.

Varias ventajas acompañarán el uso del ojo del conejo para la generación de un modelo de GA de la enfermedad. En primer lugar, el tamaño del ojo del conejo, que es el 70% del volumen de un ojo humano adulto, permite trasplante clínicamente significativo con una densidad celular que es mucho más baja que utiliza habitualmente en ojos pequeños roedores (1.000 células/μl frente a 50.000 células/μl)4 , 5. en segundo lugar, la cirugía en roedores suele transscleral a través de la coroides, que compromete la barrera retiniana y potencialmente desencadena una respuesta inflamatoria y un posible rechazo6. Ambos factores juntos pueden conducir a multilayering y aglutinación de las células trasplantadas y una integración general deficiente de las células trasplantadas en un tejido retiniano nativa interrumpido. Sin embargo, el modelo de conejo grande-eyed permite la realización de una técnica quirúrgica con instrumentación idéntica a un ajuste clínico. En tercer lugar, un modelo de grandes ojos también permite alta resolución en vivo la proyección de imagen y control de las células trasplantadas y la retina suprayacente al tiempo1,2,3. Así, describimos un modelo preclínico clínico relevante y rentable que debe ser una alternativa atractiva a los roedores para cualquier persona con un interés en la investigación de la retina normal y enferma y el espacio sub-retinal.

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Protocol

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El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Karolinska Instituet. Los experimentos en animales utilizando conejos albinos de Nueva Zelanda (Tabla de materiales) han sido aprobados por el Comité de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permiso: dnr 56/15). El uso de hESCs (dnr 2011/745-31/3) y la transferencia y manipulación de células-RPE (dnr 2013/813-31/2) es también conforme a la legislación sueca y las regulaciones del Karolinska Institutet y ha sido aprobado por el (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).

1. subretinal inyección de cloruro de sodio (NaIO3) en un modelo Animal grande-eyed

  1. Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y xilacina de 5 mg/kg en solución salina utilizando una jeringa de 30 G, y dilatar las pupilas con gotas tópico usando una mezcla de 0,75% ciclopentolato y 2.5% fenilefrina. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura de su pata trasera.
  2. Coloque el conejo en el microscopio quirúrgico con la cabeza hacia al cirujano (figura 1A). Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilización equilibrada solución de sal (BSS) para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.
  3. Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares sin válvula para la inserción de instrumentos de microcirugía (figura 1B). La máquina de múltiples funciones de la vitrectomía tiene puertos para conectar una cánula de infusión, endoillumination, vitrector y endolaser. Para inyección subretinal, sólo el endoillumination es obligatorio, que hace un montaje de 2 puertos suficientes. Inserte el endoillumation a través del trocar izquierdo superior y el uso del trocar derecho superior de la cánula de inyección subretinal.
    1. Para una configuración de 3 puertos, use el trocar temporal inferior de la cánula de infusión BSS. Si son instrumentos opcionales (tales como un vitrector) usado, insertar a través del trocar derecho superior.
    2. Colocar los 2 trocares superiores 1-2 mm de Limbo con unas pinzas con garras para agarrar y desplazar la conjuntiva que cubre el sitio de inserción.
    3. Asegúrese de que los trocares son transsclerally insertado en un ángulo paralelo del limbus de 30-45° y proceden a la mitad de la punta del trocar. Girar el trócar 90 º y avanzar en el ojo, con el objetivo en el polo posterior del ojo. Este procedimiento evitar fugas post-quirúrgicas de las sclerotomies y también disminuir el riesgo de endoftalmitis (es decir, una infección bacteriana en el ojo). Vea también figura 2B para posiciones de trocar.
    4. Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).
    5. Drenaje 500 μl de NaIO3 en una jeringa de 1 mL conectada a un tubo de extensión (funcionado por el asistente) y una cánula de polytip 38 G (operado por el cirujano).
    6. Inserte la sonda de endoillumination a través del trocar izquierdo superior y la cánula de inyección a través del trocar derecho superior y avanzar la cánula a través del espacio vítreo hacia la retina, con el objetivo de la zona justo debajo de la cabeza del nervio óptico.
    7. Permitir que la punta de la cánula a tocar poco a poco la retina hasta un blanqueamiento focal es visible. La inyección se penetrará a la retina, lo que permite entrega subretinal. No deje la cánula penetra la retina, ya que esto puede causar hemorragia.
    8. Inyectar 50 μl de NaIO3 subretinally durante un período de s 5. Ya que existe un plano de la hendidura natural entre la retina y la coroides subyacente, una ampolla visible semitransparente forman gradualmente durante la inyección.
    9. Lentamente durante la inyección, retraer la aguja, pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.
    10. Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.
  4. Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.
  5. Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.
  6. Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg (véase Tabla de materiales).
  7. Espere 7 días para proceder con el trasplante de las células hESCs RPE.

2. subretinal trasplante de las células hESCs RPE en animales tratados con

  1. Administrar 2 mg (100 μL) de la triamcinolona de intravitreal en animales anestesiados con una aguja 30 g insertada 1-2 mm del limbo en el cuadrante temporal inferior 1 semana antes del trasplante de células RPE y volver a administrar cada 3 meses. Asegúrese de apuntar la punta hacia el polo posterior del ojo para evitar que un toque de lente.
  2. La cultura una monocapa de células RPE como se describió anteriormente1.
  3. Eliminar medios de la diferenciación de la célula (véase Tabla de materiales) de una monocapa confluente de 24 pocillos hESC-RPE y lave cada uno con 500 μl de PBS sin Ca2 + y Mg2 +. Repetir esta acción una vez más, para un total de 2 lavados.
  4. Deseche el sobrenadante, agregar 500 μl de tripsina por bien e incube durante 12 min a 37 ° C.
  5. Inclinación de la placa y retire con cuidado la tripsina (células deberían permanecer pegadas a la placa). Recoger células en 800 μl de fresco 37 º C precalentado diferenciación medios mediante pipeteo suave, o incluso raspado si fuera necesario, para obtener una suspensión unicelular.
    Nota: Utilice un tamiz de 40 μm células si se observan grupos de células.
  6. Recuento de células en una cámara del hemocitómetro con 0.2% Trypan azul, según las instrucciones del fabricante.
  7. Añadir 5 mL de diferenciación células medios y centrifugar a temperatura ambiente, 300 x g durante 5 minutos.
  8. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en recién esterilizado por filtro de PBS (pasado a través de un filtro de jeringa de 25 mm) a una concentración final de 1.000 células/μl.
  9. Parte alícuota de la suspensión anterior en 600 alícuotas μl y mantenga en hielo hasta y durante la cirugía.
  10. Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina en salina utilizando una jeringa de 30 G. Dilatar a las pupilas con colirio tópico usando amix de fenilefrina cyclopentolate y 2.5% 0,75%. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura en su pata trasera.
  11. Colocar el conejo con la cabeza hacia al cirujano. Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilizar BSS para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.
  12. Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares colocados en la misma posición como se describe en el paso 1.3 y figura 2. Si el sclerotomies anteriores son visibles, realizar inserción de trocar a adyacentes, pero no a través de estos, para minimizar el riesgo de fugas postoperatorias.
    1. Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como el gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).
    2. Después de punta adecuado posicionamiento (ver pasos 1.3.5 y 1.3.6), inyectar 50 μl de una suspensión de RPE de hESCs mezclado suavemente (50.000 células) subretinally. Objetivo para el centro de la zona de NaIO3 pretratados distinguido por un reflejo característico "metálico" endo-iluminación. La retina neurosensorial debe separar fácilmente creando una ampolla visible. Ras la aguja estéril de H2O entre conejos y después utilizar para evitar obstrucción debido a la célula la aguja produce. Cambiar la aguja cuando la obstrucción se nota.
    3. Durante la inyección lentamente retraer la aguja pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.
    4. Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.
  13. Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.
  14. Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos, en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.
  15. Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg.

3. retina en Vivo y proyección de imagen Subretinal

  1. Utilice un dispositivo de (SD-OCT) la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral con el software que lo acompaña (véase tabla de materiales) para obtener la sección transversal b-Scan de los animales tratados, según las instrucciones del fabricante. Para evitar el desenfoque de la imagen, asegúrese de mantener la córnea húmeda mediante lavado con solución salina tópica cada 30-60 s.
    1. Colocar los animales anestesiados y dilata la pupila (véase los pasos 1.1 y 2.10) en una montura ajustable para obtener una trayectoria sin obstáculo de la fuente de luz del instrumento a la retina de conejo.
    2. Obtener al menos 3 OCT exploraciones con oftalmoscopia de láser escaneado confocal infrarroja simultánea imágenes de referencia de reflectancia (IR-cSLO) que representa la parte superior, central e inferior de la zona inyectada.
    3. Obtener imágenes de fondo en cara con cSLO azul, verde, infrarrojo y multicolor láser reflectancia (es decir, múltiples colores láser simultánea), respectivamente.
    4. Capturar imágenes de Autofluorescencia de luz azul (BAF) utilizando la capacidad del láser de luz azul del dispositivo SD-OCT.

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Representative Results

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Representante en vivo imágenes de BAF, cSLO IR y SD-OCT de una retina de conejo albino normal se muestran en la figura 2. Tenga en cuenta las diferentes capas retinianas con sus distintivos niveles de reflexión de la luz capturada por el instrumento de la SD-OCT.

En las figuras 1A y 1B de la figura, se ilustra la configuración para crear sub-retinales ampollas: se coloca un retractor de la tapa, sujetando las tapas del ojo para permitir la inserción de 3 trocares (figura 1B) 1-2 mm lejos del limbo, con el fin de evitar una lente toque y en un ángulo de 30-45 ˚ Limbo paralelo. Trocares, permitirá la introducción de una cánula de infusión opcional, además de una luz y la aguja de inyección a través de la esclera. Una pupila dilatada junto con una lente de contacto plana facilitará una visión de fondo de ojo y el espacio sub-retinal mientras se realiza el procedimiento quirúrgico.

Después de la inyección de 50 μl de solución de NaIO3 de 1 mM, una ampolla se crea en el espacio subretinal que resolver y degenerar progresivamente la retina externa, como se muestra en la imagen de la SD-OCT en la 3A figura tres meses después de la inyección. Apreciar el adelgazamiento de las capas exteriores del neuroretinal en el SD-OCT y las áreas de hipo-BAF, correspondiente a la pérdida RPE así recrear un GA-como fenotipo. A identificación de la zona de daños, 50.000 hESC-RPE en un volumen μl 50 es volver a inyectar para el trasplante, creando una segunda ampolla que resuelve como se muestra en el BAF e imágenes de múltiples colores (MC) en la figura 3B. Reconocer el suave a las áreas de moderada hiper-BAF con una focal mayor hiper-BAF inferiorly en la frontera de la zona de daños, indicativo de estrés crónico del RPE nativo se muestra en el análisis de la SD-OCT junto con la ausencia de áreas pigmentadas en la imagen de MC. La ampolla correspondiente a la inyección de 50 μl de células RPE (50.000 células) en ojos no pretratados con parches de células pigmentadas en la imagen (MC) y bien conservadas estructuras retinianas en la exploración de la SD-OCT se muestra para la comparación (figura 3).

Colectivamente, este procedimiento y metodología permiten el estudio de la integración de los trasplantes de suspensión subretinal de células RPE en un modelo relevante para GA

Figure 1
Figura 1: sistema de inyección de arriba (A) imágenes que representan la configuración quirúrgica para inyecciones sub-retinales. El animal se coloca bajo el microscopio quirúrgico (izquierdo) y el cirujano la endoillumination sonda insertada a través del trocar izquierdo en la mano izquierda, y el instrumento quirúrgico intravitreal (p. ej. cánula de inyección subretinal) se inserta a través de el izquierda trocar en la mano derecha (medio). Una lente de contacto plana colocada sobre la córnea permite una vista magnificada del fondo durante el procedimiento quirúrgico (derecha). (B) vista esquemática cercana del ojo del conejo albino con el retractor de la tapa y la boquilla de los trocares insertados 1-2 mm profundidad del limbus y en un ángulo paralelo de 30-45 °, junto con los trocares que facilitan la introducción de un cánula de infusión, una luz y la aguja para la inyección. Una lente de contacto plana situada en la parte superior el alumno le ayudará a obtener una mejor visión del fondo de ojo durante el procedimiento quirúrgico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Normal albino conejo retina en vivo la proyección de imagen. En vivo SD-OCT, BAF y cSLO IR imágenes representando una retina de conejo albino normal. Un golpe encima de el SD-OCT con el correspondiente etiquetado de las distintas capas de la retinales se ve en la imagen de la SD-OCT: GCL (capa de células ganglionares), IPL (capa plexiforme interna), INL (capa nuclear interna), OPL (capa plexiforme externa), ONL (capa nuclear externa), OLM (exterior limitación de membrana), EZ (zona elipsoide), OS (segmentos exteriores), EPR (epitelio pigmentario) y BM (membrana de Bruch). Barras de escala = 1 mm (BAF y cSLO IR imágenes), 200 μm (imágenes de la SD-OCT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: inyecciones de suspensión Subretinal en el modelo de conejo grandes ojos. Imágenes (A) BAF, MC y SD-OCT de inyección subretinal de 1 mM NaIO3 3 meses después de la inducción de daño. Tenga en cuenta la hypo-BAF rodeado de zonas de hiper-BAF correspondiendo a la ampolla y el neuroretina degenerado en el SD-octubre (B) BAF, MC, e imágenes de SD OCT de ojos pretratados con 1 mM NaIO3 por 1 semana seguida de transplante subretinal de 50.000 RPE de células en suspensión y analizadas 3 meses después del trasplante. Tenga en cuenta las áreas hyper-BAF en la imagen de la BAF, la ausencia de células pigmentadas integradas en el MC y el neuroretina atrófica en el SD-octubre (C) MC y SD-OCT imágenes de ojos de ingenuo no pretratados 3 meses después del transplante subretinal de hESC-RPE en suspensión. Nota las áreas pigmentadas en la imagen de MC y la estructura del neuroretinal conservados en octubre SD SD-OCT escanear planos están marcados (flecha verde). Puntas de flecha blancas marcan la frontera de las ampollas en la cara en e imágenes de SD-OCT. Barras de escala = 1 mm (imágenes BAF y MC), 200 μm (imágenes de la SD-OCT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .

Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica7, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente grande que permite la cirugía intraocular y el uso de la proyección de imagen estándar, y es fácilmente ubicado y barato comparado con otros animales de ojos grandes.

Describimos el uso de la técnica de transvitreal estándar calibre 25 pars plana vitrectomy para la creación de ampollas sub-retinales para inducir daños sub-retinal o trasplantar células RPE. Inicialmente, se utilizó una configuración de 3 puertos, como se ilustra en la figura 1B, con la intención de utilizar el puerto de infusión (trocar), en el caso de un vitrectomy fue realizado durante el procedimiento. Sin embargo, puesto que no hemos encontrado una vitrectomía para que sea necesario para la aplicación de inyecciones sub-retinales, el puerto de infusión se ha omitido. Sin embargo, la tercera opción de puerto debe permanecer si el procedimiento se adapta más y se realiza una vitrectomía.

El conejo grande-eyed es un modelo bien establecido de ocular con datos acumulados en la anatomía y fisiología en los últimos siglos8. Por otra parte, los conejos son fáciles de manejar y raza, económicamente atractivo (por ejemplo, compra, vivienda y mantener) y disponible en comparación con otros modelos de mamífero de grandes ojos. Una ventaja importante de un modelo de ojos grandes es que permite el uso de técnicas de imagen clínicas alta resolución, que a su vez para el seguimiento de las células de RPE de células trasplantadas en el espacio subretinal en el tiempo. Sin embargo, a pesar de los lagomorfos está filogenéticamente más cerca de los seres humanos que los roedores, se debe afirmar que poseen un merangiotic de retina y una racha visual, comparado con un holangiotic de retina y una fóvea presente en primates9. Medios de retina Merangiotic que la mayor parte de la sangre de la retina interna se derivan de los choriocapillaris, una diferencia que uno necesita ya que puede aumentar el riesgo de lesión y la hemorragia. Una de las ventajas experimental es que permite para el modelado de etapas anteriores de GA después de ampollas subretinales de soluciones fisiológicas únicamente, como ha sido previamente demostrado1,3. Estos estudios sugieren que una ampolla subretinal causando hipoxia retiniana temporal en el medio de merangiotic puede ser suficiente para causar la muerte de fotorreceptores; sin embargo, en este contexto, se ha demostrado pérdida de EPR más probable es que sea generada por el flujo sub-retiniano inducido mediante una jeringa de 1 mL y un volumen de ampolla μl 50, un fenómeno al azar que a su vez potencializa la atrofia de retina y neuro. Por lo tanto, el volumen de la ampolla puede tener un efecto directo sobre el retineano estiramiento daños, lo que significa que cuanto mayor sea el volumen utilizado (por ejemplo, 100 μl, que se ha utilizado en otros estudios10), el más perjudicial puede llegar a ser.

Un paso crítico para asegurar la integración de las células inyectadas es para evitar reflujo de células en el vítreo durante la inyección y la colocación de la aguja en el espacio subretinal. Si está situado demasiado profundamente, el exterior barrera retineano/coroides se penetró y las células inmunes pueden invadir el espacio sub-retinal, causando rechazo inmune a pesar del uso de la inmunosupresión. Otro aspecto importante para el éxito del trasplante es el estado del vítreo. En el presente modelo, no se realiza vitrectomía para reducir al mínimo el reflujo y trauma quirúrgico. Sin embargo, se ha notado que en algunos ojos es difícil conseguir una posición correcta de la punta en la retina como la punta se queda en la interfase vítrea retiniana previa conduce a la formación de pequeños o incluso no las ampollas. Aunque es un acontecimiento relativamente raro, indican que variabilidad del conejo vítrea debe tenerse en cuenta durante la cirugía y el análisis post-surgical.

Además, la inyección adecuada de triamcinolon es crucial para evitar el oscurecimiento de cristales blancos de esteroides, que luego se dificultan la cirugía y post-quirúrgico fundus visualización por SD-OCT de fondo. Para minimizar este problema, la inyección de triamcinolon debe realizarse en el cuadrante temporal inferior. Del mismo modo, trocares se deben colocar 1-2 mm desde el limbo para evitar hemorragia vítrea del cuerpo ciliar y tocar la lente proporcional grande conejo con la aguja. Un toque de lente causará una catarata que a su vez impiden la adecuada visualización del espacio sub-retinal durante proyección de imagen postoperatoria.

Esteroides, incluyendo la triamcinolona, se ocasionar cataratas con el tiempo. No hemos observado esto después de la administración de triamcinolona por hasta 8 meses. Sin embargo, es probable que desarrollen cataratas esteroide-inducida si administrando triamcinolona durante extensos períodos de tiempo.

Los métodos descritos pueden ser utilizados para entrenamiento quirúrgico y para el análisis de la integración de la célula y función como se describe aquí y en nuestras publicaciones anteriores. El método también tiene gran importancia para la administración de vectores virales sub-retinales ahora en ensayo clínico de varias distrofias retinianas hereditarias. Modificaciones futuras pueden incluir trasplante de materiales más complejos, como portadores de la hoja y biogels. Medida que surjan nuevos métodos de proyección de imagen clínicos, serán fácilmente adaptados al ojo del conejo, posiblemente sin modificaciones.

In conclusion, el modelo de conejo grande-eyed se demuestra para ser un modelo pre-clínico relevante que tiene varias ventajas en comparación con modelos de roedores para i) recapitula etapas diferentes de GA, ii) aplicación de métodos quirúrgicos y proyección de imagen paciente pertinentes y iii ) evaluar la integración de células de un donante para ser utilizado como terapia de reemplazo celular para GA y trastornos relacionados.

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Disclosures

Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por becas del Instituto Karolinska, Fundación del Crown Princess Margareta para invidentes, la Fundación de investigación oftalmológica, el rey Gustav V Foundation, la Fundación sueca de ojo, el ARMEC Edwin Jordan Fundación de Lindeberg y la Fundación Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
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Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

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