Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Abstract

Coğrafi Atrofi (GA), Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu geç aşamasında kaybı hayati retina yapıları (örneğin, photoreceptors) sonraki dejenerasyonu uzaklaşan retina pigment epitel (RPE) katmanın, karakterize neden şiddetli bozukluğu. Benzer şekilde, RPE kaybı ve görme keskinliği azalma görülür uzun süreli takip kadar intravitreal Anti-vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) tedavi gören hastaların gelişmiş ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile. Bu nedenle, bir yandan, bu verimli bir şekilde RPE hücrelerinin replasman tedavisi hizmet verebilir bir sınırsız kaynak türetmek için esastır. Öte yandan, davranış ve entegrasyon-in hastalık gerektiren bir modeli türetilmiş hücrelerde cerrahi değerlendirmek önemlidir ve görüntüleme yöntemleri olarak bu insanlarda uygulanan mümkün olduğunca yakın. İnsan embriyonik kök hücre değerlendirilmesi retina pigment epitel hücreleri (hESC-RPE) türetilmiş için burada, GA preklinik bir model nesil açıklayan önceki yayınlarımızı dayalı ayrıntılı bir protokol albino tavşan göz kullanarak içinde sağlamak bir Klinik ayarı. Farklılaşmış hESC-RPE nakledilen saf gözler veya gözleri NaIO3-GA gibi retina dejenerasyonu 25 G transvitreal pars plana tekniği kullanarak indüklenen. Değerlendirme dejenere ve Transplante bölgelerinden multimodal yüksek çözünürlüklü non-invaziv gerçek zamanlı görüntüleme tarafından gerçekleştirilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu iletişim kuralı bir transplante hESC-RPE subretinal uzayda entegrasyonunu değerlendirilmesi sağlar coğrafi Atrofi (GA) büyük gözlü preklinik model nesil açıklar. HESC1, yanı sıra dış retina hasar ve GA benzeri fenotip RPE hücrelerinin zenginleştirilmiş, saf ve fonksiyonel bir nüfusun üretim göstermek 3 son yayınlarda ayrıntılı olarak açıklanan yöntemleri kullanılmıştır fizyolojik tuzlu Çözümleri (Yani, BSS ve PBS) veya tavşan göz2,3NaIO3 subretinal enjeksiyonla indüklenen. Biz daha fazla alt retinal süspansiyon nakli hESC-RPE, kapsamlı işlevsel monolayers photoreceptor kurtarma kapasitesi2formu gösterdi.

Çeşitli yararları GA manken hastalığı nesil tavşan göz kullanımına eşlik. İlk olarak, boyutu tavşan göz hangi yetişkin bir insan gözü hacmi % 70 's, klinik olarak anlamlı nakli rutin olarak küçük kemirgen gözler (1000 hücre/µL vs 50.000 hücre/µL)4 ' te kullanılan çok daha bir hücre yoğunluğu kullanarak verir , 5. ikinci olarak, kemirgenler genellikle transscleral retina bariyeri ödün vermez ve potansiyel bir enflamatuar yanıt ve mümkün ret6tetikler koroid aracılığıyla ameliyatta. İki faktör birlikte multilayering ve Transplante hücrelerinin ve kesintiye yerli retina mendil transplante hücrelerde genel zayıf bir entegrasyon topaklanma neden olabilir. Ancak, büyük gözlü tavşan modeli bir cerrahi teknik klinik bir ayarı için aynı araçları ile performans sağlar. Üçüncü olarak, büyük gözlü manken de görüntüleme ve Transplante hücrelerin ve üstteki retina ile zaman1,2,3izleme yüksek çözünürlüklü vivo içinde verir. Böylece, kemirgenler normal ve hastalıklı retina ve alt retinal uzay araştırma ilgi olan herkes için cazip bir alternatif olması gereken bir klinik olarak ilgili ve maliyet-etkin preklinik modeli açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki iletişim kuralı Karolinska Instituet hayvan bakımı kuralları izler. Yeni Zelanda albino tavşan (Tablo reçetesi) kullanarak tüm hayvan deneyleri bölgesel hayvan Etik Komitesi (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) tarafından onaylanmış olan (izin: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3) kullanımı ve transfer ve hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) manipülasyon da İsveçli mevzuat ve Karolinska Institutet düzenlemelere uygun şekilde ve bölgesel insan Etik Komitesi (tarafından onaylandı Regionala Etikprövningsnämnden ben Stockholm).

1. sodyum iyodat (NaIO3) subretinal enjeksiyon büyük gözlü hayvan modeli içine

  1. 35 mg/kg ketamin karışımı ile uyluk kas içi yönetiminde ve tuz 30 G şırınga kullanarak 5 mg/kg xylazine hayvanları anestezi ve öğrenciler topikal göz damlası % 0.75 cyclopentolate ve % 2.5 phenylephrine bir karışımını kullanarak genişletmek. Uygun anesthetization doğruladı Eğer hayvan arka bacağını zor bir tutam tepki vermez.
  2. Cerrahi mikroskop altında tavşan ile baş cerrah (şekil 1A) karşı karşıya koyun. Bir kapak Retraktörü göz kapakları ve nictitans membran bulaşma riskini en aza indirmek için bir steril bezle kaldırmak için kullanın. Kullanımı dengeli tuz solüsyonu (BSS) altında anestezi sırasında her iki gözde kuruluk önlemek için.
  3. Mikrocerrahi, 2 bağlantı noktasını kullan (veya isteğe bağlı 3-bağlantı noktası) için 25 G transvitreal pars plana tekniği ile mikrocerrahi aletleri (şekil 1B) ekleme için Vanalı sigara trocars. Çok işlevli vitrektomi makine bir infüzyon kanül, endoillumination, vitrector ve endolaser bağlanmak için bağlantı noktası yok. Subretinal enjeksiyonlar için sadece endoillumination 2-liman set-up yeterli kılan, zorunludur. Endoillumation üst sol trokar yerleştirebilir ve üst sağ trokar subretinal enjeksiyon kanül için kullanabilirsiniz.
    1. 3-port kurulum için daha düşük zamansal trokar BSS infüzyon kanül için kullanın. (Örneğin vitrector) isteğe bağlı aygıtlar olup olmadığını kullanılan, bunları üst sağ trokar ekleyin.
    2. Üst 2 trocars 1-2 mm kapmak ve ekleme sitesi örten konjonktiva yerinden pençeli forseps kullanarak limbus ekleyin.
    3. Trocars eklenen transsclerally 30-45 ° limbus paralel açı ve trokar ucunu ortasına kadar devam emin olun. Sonra 90 ° trokar dönüp gözün arka kutbunda amaçlayan göz içine ilerlemek. Bu yordam sclerotomies üzerinden ameliyat sonrası kaçağı önlemek ve aynı zamanda endoftalmi (Yani, bakteriyel enfeksiyon göz) riskini azaltmak. Ayrıca şekil 2B trokar pozisyonlar için bkz.
    4. Tek kişi kullanımlı düz kontak lens kornea göz ve Kontakt lens (şekil 1A) arasında iletişim jel olarak sentetik gözyaşları ile retina görselleştirmek için koymak.
    5. Bir uzatma tüpü (yardımcı tarafından işletilen) bağlı bir 1 mL şırınga ve bir 38 G polytip kanül (cerrah tarafından işletilen) içine NaIO3 500 µL çizin.
    6. Endoillumination sonda aracılığıyla üst sol trokar ve enjeksiyon kanül aracılığıyla üst sağ trokar yerleştirin ve optik sinir başı altındaki alanda yönelik retina doğru vitreus uzayda kanül ilerlemek.
    7. Odak bir beyazlatma görünene kadar yavaş yavaş retina dokunmak kanül ucu izin. Enjeksiyon kendisi subretinal teslimat için izin retina, nüfuz. Bu kanama neden olabilir beri retina, nüfuz kanül izin vermeyin.
    8. 50 µL NaIO3 subretinally 5 s dönemde enjekte et. Doğal göğüs arası uçak retina ve alttaki koroid arasında olduğundan, açıkça görülebilen bir yarı saydam bleb enjeksiyon sırasında yavaş yavaş oluşturmalıdır.
    9. Enjeksiyon sırasında yavaş yavaş iğne geri çek, ama belgili tanımlık uç reflü en aza indirmek için bleb içinde korunur emin olun.
    10. Sonra endoillumation ve enjeksiyon kanül kaldırılması, pençeli forseps kullanarak trocars kaldırın ve 30 için hafif basınç uygulamak için belgili tanımlık uç veya künt sonuna forseps kullanarak kendinden contalı dikiş daha az sclerotomies s.
  4. Post-surgically 10 mL subkutan su kaybı önlemek için tuz verin. Ameliyat sonrası topikal steroid veya antibiyotik vermek değil. Ağrı kesici için ameliyattan sonra 0.5 mL buprenorfin 0.3 mg/ml subkutan sonra cerrahi, hem de gün ver.
  5. Onları birkaç saniye için öncelikle % 70 etanol, ikincisi % 45 etanol içinde çeker tarafından tüm aletleri kullanımdan sonra yıkama ve son olarak içinde distile su. Onları düzgün bir kağıt havlu ile kurulayın.
  6. Onlar yeterli kendine gelmek ve onları tek tek encaged yere kadar hayvan katılmak. (Örneğin, immünhistokimya amaçlar için) gerekirse, hayvanlar 100 mg/kg Fentobarbital intravenöz enjeksiyon tarafından ötenazi ( Tablo malzemelerigörmek).
  7. HESC-RPE hücrelerinin nakli ile devam etmek için 7 gün bekleyin.

2. subretinal nakli hayvanlarda tedavi hESC-RPE hücrelerinin

  1. 1-2 mm den daha düşük zamansal kadranda limbus hESC-RPE nakli önce 1 hafta eklenen 30 g enjeksiyon iğne kullanarak imzalat hayvanlarda intravitreal triamsinolon, 2 mg (100 µL) yönetmek ve 3 ayda yeniden yönetmek. İpucu bir objektif dokunmatik önlemek için göz arka direğe doğru işaret etmek emin olun.
  2. 1daha önce açıklandığı gibi bir hESC-RPE monolayer kültür.
  3. 24-şey Konfluent hESC-RPE monolayer hücre farklılaşması medya (bkz. Tablo reçetesi) kaldırın ve her yıkama PBS 500 µL Ca2 + ve Mg2 +olmadan ile iyi. Bir kez daha, bu eylem 2 yıkama toplam için yineleyin.
  4. Süpernatant atmak, tripsin iyi başına 500 µL eklemek ve 37 ° C'de 12 dk için kuluçkaya
  5. Plaka eğilme ve tripsin (hücreleri plakasına bağlı kalmalıdır) dikkatli bir şekilde çıkarın. Taze 37 ° C prewarmed farklılaşma medya 800 µL hücrelerde nazik pipetting veya hatta bir tek hücre süspansiyon elde etmek için gerekirse, kazıma toplamak.
    Not: Hücre kümeleri gözlenen bir 40 µm hücre süzgeç kullanın.
  6. % 0,2 kullanarak hemasitometre odasında hücreleri hesaplama Trypan mavi, üreticinin yönergelerine göre.
  7. Farklılaşma medya ve santrifüj hücreleri, oda sıcaklığında, 300 x g 5 min için 5 mL ekleyin.
  8. Süpernatant atın ve Pelet taze filtre sterilize PBS 1000 hücre/µL son bir konsantrasyon (bir 25 mm şırınga filtreden geçirilen) içinde resuspend.
  9. Aliquot önceki hücre süspansiyon 600 µL aliquots ve buz kadar ve ameliyat sırasında üzerinde tutun.
  10. Tuz 30 G şırınga kullanarak 35 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine karışımı ile uyluk kas içi yönetim tarafından hayvanların anestezi. Öğrenciler topikal göz damlası % 0.75 cyclopentolate ve % 2.5 phenylephrine amix kullanarak genişletmek. Uygun anesthetization doğruladı Eğer hayvan arka bacağını zor bir tutam tepki vermez.
  11. Tavşan ile baş cerrah bakacak şekilde yerleştirin. Bir kapak Retraktörü göz kapakları ve nictitans membran bulaşma riskini en aza indirmek için bir steril bezle kaldırmak için kullanın. BSS kuruluk anestezi sırasında her iki gözde altında engellemek için kullanın.
  12. Mikrocerrahi, 2 bağlantı noktasını kullan (veya isteğe bağlı 3-bağlantı noktası) için 25 G transvitreal pars plana tekniği ile trocars adım 1.3 ve Şekil 2' de açıklandığı gibi aynı pozisyonda yerleştirilir. Önceki sclerotomies görünür durumdaysa, trokar ekleme sadece bitişik gerçekleştirmek ancak ameliyat sonrası kaçak riskini en aza indirmek için bunlar aracılığıyla.
    1. Tek kişi kullanımlı düz kontak lens kornea göz ve Kontakt lens (şekil 1A) arasında iletişim jel olarak sentetik gözyaşları ile retina görselleştirmek için koymak.
    2. (Bkz: adım 1.3.5 ve 1.3.6) konumlandırma uygun ucu sonra hafifçe karışık hESC-RPE süspansiyon (50.000 hücreleri), 50 µL subretinally enjekte. Karakteristik "metal" endo-aydınlatma refleks tarafından seçkin NaIO ön işleme3 alanının için amaç. Neurosensory retina kolayca açıkça görünür bleb oluşturma ayrı olmalıdır. Tavşan/sonra steril H2O arada iğneyle kullanın iğne nedeniyle hücre tıkanmasını önlemek için floş kümeler. Değişikliği ne zaman tıkanma iğneyi fark ettim.
    3. Enjeksiyon sırasında yavaş iğne geri çek ama ucu reflü en aza indirmek için bleb içinde korunur emin olun.
    4. Sonra endoillumation ve enjeksiyon kanül kaldırılması, pençeli forseps kullanarak trocars kaldırın ve 30 için hafif basınç uygulamak için belgili tanımlık uç veya künt sonuna forseps kullanarak kendinden contalı dikiş daha az sclerotomies s.
  13. Post-surgically 10 mL subkutan su kaybı önlemek için tuz verin. Ameliyat sonrası topikal steroid veya antibiyotik vermek değil. Ağrı kesici için ameliyattan sonra 0.5 mL buprenorfin 0.3 mg/ml subkutan sonra cerrahi, hem de gün ver.
  14. Onları birkaç saniye, öncelikle % 70 etanol, ikincisi % 45 etanol içinde çeker tarafından tüm aletleri kullanımdan sonra yıkama ve son olarak içinde distile su. Onları düzgün bir kağıt havlu ile kurulayın.
  15. Onlar yeterli kendine gelmek ve onları tek tek encaged yere kadar hayvan katılmak. (Örneğin immünhistokimya amaçlar için), gerekirse 100 mg/kg Fentobarbital intravenöz enjeksiyon tarafından hayvanlara ötenazi.

3. in Vivo retina ve Subretinal görüntüleme

  1. Spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) aygıt ile birlikte verilen yazılımı kullanın (kesitsel b-taranmasını üreticinin yönergelerine uygun tedavi hayvanlar elde etmek için malzemeler tablo bkz:). Görüntü bulanık önlemek için her 30-60 s topikal serum temizlenerek kornea nemli tutmak emin olun.
    1. Engelsiz bir yol enstrüman ışık kaynağından tavşan retina elde etmek için ayarlanabilir bir Mount (bkz. Adım 1.1 ve 2.10) imzalat ve öğrenci büyümüş hayvanlar koyun.
    2. En az 3 OCT taramaları ile eşzamanlı kızılötesi confocal tarama lazer ophthalmoscopy enjekte alanının üst, orta ve alt kısmını temsil eden (IR-cSLO) yansıma referans görüntü elde.
    3. Tr-yüz cSLO mavi, yeşil, kızılötesi ve çok renkli yansıma (Yani, birden çok eşzamanlı lazer renk), sırasıyla lazer ile fundus görüntü elde.
    4. Mavi ışık autofluorescence (BAF) SD-Ekim cihazın mavi ışık lazer özelliği kullanarak çekim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BAF, IR-cSLO ve SD-Ekim normal albino tavşan retinanın temsilcisi vivo içinde görüntülerini Şekil 2' de gösterilmiştir. SD-Ekim enstrüman tarafından yakalanan ışık yansıması farklı düzeylerinin farklı retina katmanlarla unutmayın.

Şekil 1A ve şekil 1Balt retinal blebs oluşturmak için kurulum resimli: 3 trocars (şekil 1B) 1-2 mm limbus, uzak ekleme bir lens önlemek için izin için göz kapaklarının tabi bir kapak Retraktörü konumlandırılmış dokunma ve bir 30-45 ˚ limbus paralel açıyla. Trocars bir ışık ve enjeksiyon iğne sklera ile yanı sıra bir isteğe bağlı infüzyon kanül getirilmesi sağlayacaktır. Cerrahi müdahalede ederken dilate pupil düz bir kontakt lens ile birlikte bir görünümü alt retina alanı ve göz fundus kolaylaştıracaktır.

1 mm NaIO3 çözüm 50 µL enjeksiyon sonra üç ay sonra enjeksiyon şekil 3A SD-Ekim görüntüde gösterildiği gibi çözümlemek ve giderek dış retina dejenere subretinal boşluğa bir bleb oluşturulur. Böylece GA benzeri fenotip Re-Creating RPE kaybı için karşılık gelen dıştaki neuroretinal Katmanlar SD-Ekim ve hipo-BAF alanlarda inceltme için teşekkür ederiz. Hasar alan, 50.000 hESC-RPE 50 µL birimindeki nakli, BAF ve çok renkli (MC) imge şekil 3Biçinde gösterildiği gibi çözümler ikinci bir bleb oluşturmak için yeniden enjekte tanımlamasıdır. Hafif Orta hiper BAF alanlarına bir odak artan hiper-BAF ile kasılır hasar, SD-Ekim taramaları MC görüntü Pigmente alanlarda yokluğu ile birlikte gösterilen yerli RPE kronik stres göstergesidir alan sınır üzerinde tanımak. HESC-RPE (50.000 hücreleri) Pigmentli hücreleri yamalari (MC) görüntü ve SD-Ekim tarama iyi korunmuş retina yapıları gösteren ön-işleme gözlerinde 50 µL enjeksiyon karşılık gelen bleb (şekil 3 c) karşılaştırma için gösterilir.

Toplu olarak, bu yordam ve metodoloji Tümleştirme subretinal süspansiyon nakli hESC-RPE, çalışmanın ilgili bir modelinde GA için izin

Figure 1
Şekil 1: enjeksiyon ayarla yukarıya Cerrahi kurulum alt retinal enjeksiyonlar için tasvir eden(a)resimler. Hayvan (solda) cerrahi mikroskop altında yer alıyor ve cerrah sol el sol trokar aracılığıyla eklenen endoillumination sonda tutar ve intravitreal cerrahi alet (örneğin subretinal enjeksiyon kanül) aracılığıyla eklenen sol trokar (orta) sağ elinde. Düz kontak lens kornea üzerinde yerleştirilen büyütülmüş görünümü fundus, cerrahi işlem sırasında (sağda) sağlar. (B) albino tavşan göz kapağı Retraktörü yerde ve meme 1-2 mm derin limbus ve eklenen trocars gelen bir isteğe bağlı giriş kolaylaştırmak trocars birlikte bir 30-45 ° paralel açıyla ile şematik Görünümü Kapat infüzyon kanül, bir ışık ve iğneyi enjeksiyon için. Öğrenci üst kısmında yer alan düz kontak lens cerrahi işlem sırasında göz fundus daha iyi bir görünümünü elde etmek için yardımcı olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Normal albino tavşan retina vivo görüntüleme. Vivo BAF, IR-cSLO ve SD-Ekim görüntüleri normal albino tavşan retina temsil eden. Kadar bir darbe, karşılık gelen farklı retina katmanları etiketleme ile SD-Ekim SD-Ekim resimde görüldüğü: un (ganglion hücre Katmanı), IPL (iç Pleksiform tabaka), INL (iç nükleer tabaka), OPL (dış Pleksiform tabaka), yalnız (dış nükleer tabaka), OLM (dış «««sınırlama) membran, EZ (elips bölgesi), işletim sistemi (dış segmentleri), RPE (retina pigment epiteli) ve BM (Bruch'ın membran). Ölçek çubukları = 1 mm (BAF ve IR-cSLO görüntüleri), 200 µm (SD-Ekim görüntüler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Subretinal süspansiyon enjeksiyonları büyük gözlü tavşan modelindeki. (A)BAF, MC ve SD-Ekim görüntüleri 1 mM NaIO3 3 ay subretinal enjeksiyon hasar indüksiyon sonra. Hiper-BAF alanları karşılık gelen bleb ve SD-Ekim (B) BAF, MC, yozlaşmış neuroretina çevrili hipo-BAF Not ve SD-Ekim resimleri göz ile 1 mM NaIO3 1 hafta 50.000 subretinal nakli tarafından takip ön işleme hESC-RPE süspansiyon ve analiz 3 ay sonra nakli. BAF görüntüdeki MC entegre Pigmentli hücreleri ve ön işleme olmayan saf gözler için 3 ay subretinal nakli sonra karşılık gelen SD-Ekim (C) MC ve SD-Ekim görüntüleri atrofik neuroretina yokluğunda hiper-BAF alanlara dikkat edin hESC-RPE süspansiyon. MC görüntü Pigmente alanları ve korunmuş neuroretinal yapısı SD-Ekim SD-Ekim uçakları tarama Not (Yeşil ok) işaretlenir. Beyaz ok uçları blebs tr-yüz ve SD-Ekim görüntüleri kenarlığını işaretleyin. Ölçek çubukları = 1 mm (BAF ve MC görüntüleri), 200 µm (SD-Ekim görüntüler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol için hESC-RPE Tümleştirme vivo içinde değerlendirmek için büyük gözlü manken GA ve preklinik kullanımı nesil açıklanmıştır.

Rejeneratif terapileri için çeviri GA ve ilgili hastalıklar için klinik7içine, geliştirmek ve sadakatle nakli ve görüntüleme için klinik yöntemleri yakalama yöntemleri optimize etmek önemlidir. Tavşan bu açıdan çekici olduğunu: göz içi cerrahi ve kullanımını standart görüntüleme izni nispeten büyük bir göz vardır ve diğer büyük gözlü hayvanlar için ucuz ve kolay ev karşılaştırılır.

Biz standart transvitreal 25-gauge pars plana vitrektomi tekniği alt retinal blebs alt retinal hasar ikna etmek için veya hESC-RPE nakli için oluşturmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Başlangıçta, biz 3-port kurulumu, şekil 1Badımında,-dibi takdirde bir vitrektomi işlem sırasında gerçekleştirildi (trokar), infüzyon bağlantı noktasını kullanarak niyeti ile gösterildiği gibi kullanılır. Bu yana alt retinal enjeksiyonları uygulamak için gerekli olmak bir vitrektomi bulunamadı, ancak, infüzyon bağlantı noktası ihmal edilmiştir. Yine de, üçüncü bağlantı noktası seçeneği yordamı daha da uyarlanmış ve bir vitrektomi gerçekleştirilir kalmalıdır.

Büyük gözlü tavşan bir iyi kurulmuş oküler anatomi ve Fizyoloji birikmiş veri son modeldir yüzyıl8. Ayrıca, tavşan kolay kolu ve doğurmak, ekonomik açıdan çekici (örneğin, satınalma, konut ve tutmak), ve hazır diğer memeli büyük gözlü modellerle karşılaştırıldığında. Büyük gözlü-manken önemli bir avantajı için zaman içinde transplante hESC-RPE hücrelerinin subretinal alanı izleme sağlar yüksek çözünürlüklü klinik görüntüleme teknikleri kullanımı sağlar olduğunu. Ancak, kemirgenler insanlara filogenetik yakın olmak lagomorphs rağmen bu onlar merangiotic retina ve görsel bir çizgi, bir holangiotic retina ve primatlar9' hediye fovea karşılaştırıldığında sahip belirtilmelidir. Kanın çoğu, iç retina tedarik Merangiotic retina anlamına gelir choriocapillaris bir lezyon ve kanama riskini artırabilir bu yana dikkate almak gerekir bir fark elde edilir. Bir deneysel avantajı bu daha önce gösterdiği1,3olduğu gibi fizyolojik çözümleri yalnız, subretinal blebs takip GA daha önceki aşamalarında modelleme için sağlanmıştır. Bu çalışmalar bir subretinal bleb zamansal retina hipoksi merangiotic ortamda neden yeterli photoreceptor ölümüne neden olabilir önerdi; Ancak, bu bağlamda, RPE kaybı büyük olasılıkla 1 mL şırınga ve bir 50 µL bleb birim, sırayla nöro-retinal Atrofi potentiates rasgele bir fenomen kullanarak bağlı alt retinal akışı tarafından oluşturulan olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bleb birim daha zararlı olabilir kullanılan büyük birim (örneğin, diğer çalışmalar10dakika sonra kullanılan 100 µL), anlamını, retina streç zarar nedeniyle üzerinde doğrudan bir etkisi olabilir.

Enjekte hücreleri entegrasyonunu sağlamak için önemli bir adım reflü hücre Vitre enjekte ve iğne subretinal uzayda konumlandırma kaçınmaktır. Çok derine konumlandırdıysanız, dış retina bariyeri/koroid nüfuz ve bağışıklık hücreleri bağışıklık reddi immünosupresyon kullanımı rağmen neden alt retina alanı istila. Transplantasyonu başarı için bir başka önemli yönü Vitre durumudur. Mevcut modelde, vitrektomi reflü ve cerrahi travma en aza indirmek için gerçekleştirilir. Ancak, bu bazı gözünde ucu küçük veya bile yok blebs oluşumu için önde gelen önceden retina vitreus Interphase takılıyor gibi retina uygun uç konumuna almak zor olduğunu fark edilmiştir. Bu nispeten nadir bir olay olmasına rağmen değişkenlik vitreus tavşan ameliyatı ve ameliyat sonrası analizi sırasında dikkate alınması gerekir anlamına gelmez.

Ayrıca, triamcinolon uygun enjeksiyon sonra ameliyat ve ameliyat sonrası fundus görselleştirme SD-Ekim tarafından engel olacaktır beyaz steroid kristaller tarafından fundus engellemeyecek önlemek çok önemlidir. Bu sorunu en aza indirmek için daha düşük zamansal çeyreğinde triamcinolon enjeksiyon yapılmalıdır. Benzer şekilde, trocars 1-2 mm silier vücut ve unproportionally büyük tavşan objektif iğneyle dokunmadan vitreus kanaması önlemek için limbus arasında yer almalıdır. Objektif dokunmatik sırayla alt retina alanı doğru görselleştirme ameliyat sonrası görüntüleme sırasında engel bir katarakt neden olur.

Steroidler triamsinolon, dahil olmak üzere, kendilerini zamanla katarakt neden olabilir. Biz bu triamsinolon yönetim 8 aya kadar takip gözlemledim değil. Ancak, steroide bağlı katarakt triamsinolon geniş bir süre yönetiliyorsa geliştirmek olasıdır.

Açıklanan yöntemleri cerrahi eğitim için ve hücre-entegrasyon ve burada ve önceki yayınlarımızı anlatılan işlev analizi için kullanılabilir. Yöntem de alt retinal viral vektörler yönetimi için yüksek alaka şimdi klinik birkaç kalıtsal retina dystrophies için vardır. Gelecekteki değişiklikler nakli sayfası taşıyıcıları ve biogels gibi daha karmaşık malzeme içerebilir. Yeni klinik görüntüleme yöntemleri çıktıkça, bunlar muhtemelen değişiklik yapmadan tavşan göz kolayca adapte olacaktır.

İn Conclusion, büyük gözlü tavşan modeli i) recapitulating GA farklı aşamalarında, II) hasta ilgili cerrahi ve görüntüleme yöntemleri ve III uygulamak için kemirgen modelleri karşılaştırıldığında birçok avantajı vardır ilgili bir önceden klinik modellik yapmak gösterdi ) tümleştirme donör hücrelerinin hücre replasman tedavisi GA ve ilgili bozukluklar için kullanılmak üzere değerlendirilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarları ya da çakışan ilgi alanları yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada hibe Karolinska Enstitüsü, görme engelliler, Edwin Jordan Vakfı Oftamolojik araştırma, İsveçli göz Vakfı, Kral Gustav V Foundation, ARMEC için Crown Princess Margareta'nın Vakfı tarafından desteklenmiştir Lindeberg Vakfı ve Cronqvist Vakfı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214, (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130, (1), 65-75 (2012).
Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter