פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.
בעת ההפעלה, תאים לשנות במהירות את התוכניות הפונקציונלית שלהם, וכך, פרופיל ביטוי גנטי. מסיבית שינויים בביטוי הגנים להתרחש, לדוגמה, במהלך התמיינות מורפוגנזה, גירוי פונקציונלי (כגון הפעלה של תאים חיסוניים), או לאחר חשיפה תרופות וגורמים אחרים מן הסביבה המקומית. בהתאם לסוג הגירוי ותא, שינויים אלו מתרחשים במהירות, בכל רמה אפשרית של הכונה. הצגת כל התהליכים מולקולרית של תא מגיבה לסוג מסוים של גירוי/סמים היא אחת המשימות הקשה ביותר בביולוגיה מולקולרית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח בו זמנית של שכבות מרובות של הכונה. אנו משווים, בפרט, גורם שעתוק מחייב (כרומטין-immunoprecipitation-רצף (צ’יפ-seq)), דה נובו שעתוק (4-thiouridine-רצף (4sU-seq)), עיבוד mRNA, ו מחזור, וכן תרגום (ריבוזום יצירת פרופיל). על ידי שילוב שיטות אלה, זה אפשרי להציג קורס מפורט של הגנום כולו של פעולה.
קביעת רצף הרנ א לאחרונה משועתקים מומלצת במיוחד בעת ניתוח במהירות התאמה או שינוי מערכות, מאז זה מתאר את הפעילות תעתיק של כל הגנים בזמן החשיפה 4sU (ללא קשר אם הם למעלה – או downregulated). השימוש קומבינטורית RNA הכולל-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בנוסף מאפשר חישוב המחירים מחזור ותרגום RNA. ניתוח Bioinformatic של תפוקה גבוהה רצף תוצאות מאפשר אמצעים רבים עבור ניתוח ופרשנות של הנתונים. הנתונים המופקים גם מאפשר מעקב אחר co-transcriptional ואלטרנטיבית שחבור, רק כדי להזכיר כמה תוצאות אפשריות.
הגישה המשולבת המתוארים כאן יכול להיות מיושם עבור אורגניזמים מודל שונה או סוגי תאים, כולל ראשי תאים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור כל שיטת שימוש, כולל פקדים איכות, ולדון בבעיות פוטנציאליות ואת החסרונות.
בשנים האחרונות, RNA-רצף (RNA-seq) הפכה להיות הכלי סטנדרטי כדי לנתח כל ביטוי RNAs בתוך תא או של האורגניזם1. עם זאת, כדי להבין את כל התהליך של תאים בהתאמת בתגובה לגירוי/תרופה ספציפית, יש צורך לקבוע באופן מלא כל התהליכים שבבסיס, החל mRNA שעתוק עיבוד, תחלופה של תרגום. שינויים לטווח קצר שעתוק RNA בקושי נמדד על ידי הכולל RNAseq, מאז שינויים של RNA הכולל תלויים גורמים למשל RNA מחצית החיים ופעילות תעתיק, אשר הם תבנית המסכן עבור המשקף את העיבוד של תאים השפעות סביבתיות2,3. ואכן, מגוון רחב של טכניקות רצף חדשות פותחו לאפשר ניתוח של שלבים שונים בתהליך ג’ין תקנה4 בשילוב בצורה נכונה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב כמה טכניקות רצף די בקלות החלים המאפשרים מעקב אחר ברגולציה של שכבות חיוני של mRNA באופן השוואתי. ניתוח פעילות גנים ברמת השעתוק, מגוון שיטות תוארו, כגון כובע-אנליזה של ג’ין ביטוי (קייג ‘)5, התארכות יליד התעתיק רצף (NET-seq)6ו ברמת הגנום הגרעיני שלא נגמרות (GRO-seq)7 , 8, bromouridine-רצף (ברו-seq) וכן 4-thiouridine-רצף (4sU-seq), אשר השתמש מטבוליטים זה משולבים החדש עיבד RNA9,10, רק כדי להזכיר כמה. בעוד כלוב מזהה האתר התחלה שעתוק מדויק, נטו-seq, GRO-seq לספק מידע מדויק יותר על קריאת ההוראות ו- 4sU-seq (שהיא השיטה המתוארת כאן) מזהה רק לאחרונה עיבד RNA. עם זאת, 4sU-seq היא רגישה מאוד, יכול להיות מיושם במסגרות זמן שונות כדי למדוד כמותית פעילות גנים ברמת השעתוק שינוי אקטיבי תאים, כמו גם שינויים כמותיים עיבוד mRNA (וזה קורה בתוך דקות)9, 11,12. יתר על כן, 4sU-seq אידיאלי לשלב עם ה-RNA-seq לחישוב RNA מחזור המחירים עבור גנים9. שעתוק של ה-mRNA מתבצעת על ידי RNA פולימראז II (RNAPII), אשר בתורו מושפע על ידי מספר רב של גורמים, כגון גורמי שעתוק, שינויים היסטון, מפעילים/repressors כללי זה יכול גם להיות חלק תעתיק מורכבות. כדי לבדוק כמה גנים/יזם/משפר אזורים מאוגדים על ידי גורם אחד, צ’יפ-seq פותחה, אשר נקרא כיום השיטה הרגילה למטרה זו, עקב נוגדנים זמינים מסחרית רבים13. עם זאת, למרות ChIPseq נותן מידע ברור על איפה ויסות גורמים bind, זה לא משקף אם זה אכן מוביל לשינויים שעתוק14. לכן, ביצוע שבב-seq עם 4sU-seq הוא השילוב האידיאלי לשאלות כאלה ביולוגי. בקרת גנים יכול להתרחש גם בשלב מאוחר יותר, מאז ה-mRNA ורמות החלבון לא בהכרח מתאימות15,16, המציין תקנה משמעותי פוטנציאלי translational או post-translational רמת, בהתאם להקשר. בשנת 2011, ריבוזום פרופיל היו כבר קודם בשילוב עם ה-RNA-seq והוא עכשיו השיטה של בחירה כדי לכמת את השינויים המתרחשים במהירות חלבון, שכן עדיין יש כמה מגבלות רגישות עם ספקטרומטר מסה17. אכן, תעריפי התרגום המתקבל שיטות כאלה הוכחו לספק הערכה טובה יחסית של שינויים ברמות החלבון (נמדד לפחות ליצירת שינוי ארוך טווח) ולאפשר מבט מפורט אפילו יותר על התהליך של תרגום, למשל הנחישות של תרגום בצד התחלה ואלטרנטיבית מסגרות17. השימוש קומבינטורית בכל ארבעת השיטות ניתן להשתמש במצב יציב, בין סוגי תאים שונים, או בסדרתי זמן הניסוי התא המשתנה במהירות11. שימוש זה מספק סקירה ברמת הגנום של שינויים באיגוד פקטור שעתוק המשפיעים על שעתוק RNA, עיבוד, תרגום.
ניתוח התהליך כולו של הכונה יש צורך להבין עיבודים הסלולר בתגובה גירוי ספציפי או טיפול. שילוב של RNA הכולל-seq, 4sU-seq ריבוזום פרופיל, צ’יפ-seq בנקודות זמן שונות מוביל ניתוח מקיף של התהליכים העיקריים של הכונה לאורך זמן. הבנה עמוקה של תהליכים ביולוגיים נדרש להגדיר את הגדרת הניסוי, כמו גם נקודות זמן אופטימלי.
מאז שיטות ללמוד הכונה לשפר במהירות, פרוטוקולים אלה ניתן להתאים לשינויים מהירים. למרות זאת, הם מספקים את השיטות הכי חשוב ללמוד ג’ין בסיסי מנגנוני רגולציה בכל סוג של תא. כאן, אנו נדון כמה מלכודות ו עובדות צריך לשקול בעת שימוש בשיטות אלה.
תאים: התאים חייבים להיות מאוד מעשית, אם משתמש ראשי תאים מבודדים, הטוהר של אוכלוסיות תאים יש להבטיח (למשל, FACS ןועברל העיקרי T תאים). התאים ואפילו מעט לחוץ יכול להשפיע על התוצאות של שיטות אלה רצף רגיש מאוד להפחית את כמות לאחרונה משועתקים או מתורגמת RNA ו להוביל המפרט לא רצויים של תגובת המתח בתוצאות רצף. מהירות צנטריפוגה המוזכרים בפרוטוקול זה כדי הצניפה תאים ממוטב העיקרי בתאי T. לפיכך, להתאים את המהירות בהתאם לסוג התא.
4 סו השפעות על פיזיולוגיה של התא: בנוסף האפשרויות הנ עבור אימות של ההפרעות מינימלי כדי פיסיולוגיה תאית על תוספת 4sU, ניתוח נוסף ו/או נוספים ניתן לבצע, במיוחד כאשר מספרי הטלפון הנייד מוגבלים. השפעות על התפשטות תאים יכולים להיבדק על-ידי אימות זמן הכפלה של תאים על-ידי רק לספור תאים עם תוויות ללא תווית. אינדוקציה nucleolar מתח יכול להיבדק גם על ידי ניתוח תא מורפולוגיה ויה immunofluorescence מכתים של nucleolin ואת הגרעינים. כדי להמשיך ולאמת את ההשפעה של 4sU, ביטוי גנים הכללית שינו ניתן למדוד על-ידי התאמת לקרוא ספירות שכותרתו RNA הכולל ל RNA הכולל ללא תווית.
תא מספרים: עבור במבחנה שנוצר בתאי T, אנו ממליצים החל לפחות את כמות התאים המצוין בטבלה 2. לבחור נאותה מספרים לפי שיטת בהתאם לסוג של תאים. מאז תאי T יש פחות הציטופלסמה ו- RNA לעומת תאים אחרים, ככל הנראה כמויות נמוכות של תאים אחרים יהיה הולם. עבור שבב-seq, מספרי הטלפון הנייד תלויים מאד הנוגדן בשימוש ואת רמת ביטוי של החלבון עניין בתוך התאים. היסטון או שבב RNAPII, תאים fewe יכול לשמש, ואילו מספרי הטלפון הנייד צריך להיות מוגברת כאשר משתמשים גורמי שעתוק, במיוחד אם הם באים לידי ביטוי ברמות נמוכות.
4 סו-תיוג ו RNA biotinylation: בעת שימוש תאים חסיד, תיוג 4sU ויכולה להיות מכוונת כפי שתואר על ידי Rädle et al. 19 מאז תאים 4sU לשלב במהירות רבה, זה ניתן להוסיף ישירות אל המדיום של השעיה, מחסידי או תאים חסיד למחצה.
מומלץ להתחיל את biotinylation עם 60-80 µg של RNA. ובכל זאת, כמויות נמוכות של RNA יכול לשמש, למרות שאנחנו לא האם בדק עבור פחות מ-30 µg. מוסיפים את coprecipitant של (למשל, GlycoBlue) כאשר מאיצים RNA אם בגדר קשה לראות. דאפי. et al. הראו גם את ביוטין מופעל methylthiosulfonate (MTS-ביוטין) בצורה יעילה יותר מגיב עם התווית על-ידי 4sU RNA מאשר HPDP-ביוטין31. לפיכך, ייתכן שווה לשקול מעבר MTS-ביוטין, במיוחד, עבור ההתאוששות של RNAs קטן, אשר נוטים להיות פחות משקעים uridine (עיין פרוטוקול biotinylation שהוזכרו על ידי דאפי ואח; ראה טיהור של התווית על-ידי 4sU RNA, נהלים ניסויית).
עבור ההתאוששות של RNA לאחרונה משועתקים, זה אפשרי להשתמש פאראמגנטיים חרוזים או RNA ניקוי חרוזים על פי בחירתך. תמיד לקחת בחשבון ערכות אלה עשויה או לא עשויה לטהר עבור RNAs ספציפיים. לדוגמה, אם אתה מעוניין miRNAs, שקול להשתמש ערכות ספציפי עבור לכידת miRNA ורצף.
כימות של RNA משועתקים החדש: לכמת במדויק RNA לאחרונה משועתקים, מדידה צריכה להתבצע על ידי fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). בתוך h 1 של חשיפה 4sU, שזה עתה משועתקים RNA מייצג כ- 1-4% של RNA הכולל. RNA משועתקים החדש של h 1 שכותרתו, תאי T מופעל מורכב ~ 90-94% של rRNA11.
ריבוזום פרופיל: בעת יצירת השיטה, קבענו כי באמצעות 1.5 x כמות נוקלאז מאשר הציע בפרוטוקול המקורי מבטיח ולעיכול תקין. כמו כן, ללא תופעות לוואי שדווחו עבור כמויות מוגברות של נוקלאז. מאז. זה די קשה כדי overdigest את RPFs בזמן שהם חלק הרנ א מחוייב ribosomal חלבונים, באפשרותך להגדיל עדיין מעט את הסכום titrate עיכול נוקלאז אופטימלית.
אם פחות מ-500 ng של RPF RNA התגלו ב שלב 4.4.2, חזור על דלדול rRNA ובריכת מטוהר RPFs עם עמודות ה-RNA נקיים & רכז-5. לחילופין, טען שני מדגמים זהים אחד לשני על הג’ל (שלב 4.5.3), פרוסות ג’ל בריכת במהלך RNA • תנאי של הג’ל (שלב 4.5.6).
מומלץ לחתוך את RPFs על ג’ל חזק ככל האפשר לחברי הלהקות nt 28, 30. פעולה זו מסייעת בהפחתת שברי לא רצויים rRNAs ו tRNAs, אשר מאוחר יותר להיות חלק מהספריה, להפחית את רצף קריאות עבור RPFs שלך.
מומלץ גם להימנע אור במהלך ג’ל טיהור UV. דבר זה יכול ליצור ניקס מקטעי רנ א, כמו גם הדימרים פירימידין, כי בסופו של דבר יכול להשפיע באופן חמור את ספריית והכנה רצף תוצאות.
ספריית הכנה ורצף של נתונים: ריבוזום פרופיל הפרוטוקול מאפשר ליצור ספריית cDNA מתאים רצף. דגימות שנוצרו על-ידי תיוג 4sU ניתן להשתמש ישירות להכנה ספריה עם כל ערכת רצפי RNA המתאים. מאז RNA לאחרונה משועתקים, במיוחד בעת שימוש קצר תיוג פעמים, עשויים שלא להיות polyadenylated, אין בחירה poly-A יש לבצעו. במקום זאת, אנו ממליצים rRNA דלדול למניעת הפחתת עומק רצף עבור המדגם בפועל. שימוש בתאי T, התחיל עם 400 ננוגרם של RNA לאחרונה משועתקים, סה כ (בהתאם הערכה, ראה חומרים), שבוצעה rRNA דלדול ואנו מופחתת מחזורי עבור הגברה PCR למזער את הטיית ה-PCR. הכנת ספריה יכולה להתבצע עם פחות חומר המוצא. עבור ספריית המורכבות מספר מחזורים PCR צריך להיות מוטבת.
עבור שבב-seq יש גם הרבה ערכות זמינים עבור ספריית הכנה. בספריה הידיים הכנה עבד טוב מתחיל עם 2 ng של ChIP הדנ א (ראה חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש). הקפד לבדוק את מדדים איזון צבע במהלך רצף. אנו ממליצים לעומק רצף של ≥40 x 10 קריאות6 , כל עבור 4sU-seq, הכולל RNA-seq, ודוגמאות שבב-seq ולאחר ≥80 x 106 קריאות עבור ריבוזום פרופיל הדגימות. העומק רצף תלוי המדגם וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם, ויש להתייחס בזהירות. כדי לנתח את קריאות intronic עבור החדרת cotranscriptional, 100 bp לזווג-קצה רצף צריך להיבחר.
רצף הטיה: רצף הפך תקן זהב בקביעת שינויים כלליים תמלול, תרגום או איגוד פקטור שעתוק. בתוך בשנים האחרונות שיטות קיימות דחפו לגבולות שלהם או טכניקות חדשות פותחו עבור קביעת רצף כמויות קטנות יותר ויותר ההתחלתי של RNA. זה דורש הגברה של cDNA, אשר מציג רעש או הטיה. לאחרונה, מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) פותחו השפעול לזהות כפילויות לראשונה על ידי ה-PCR. . לאחרונה, זה הוצגה UMIs רק במתינות לשפר כוח רצף ושיעור גילוי שווא על ביטוי גנים דיפרנציאלית32. למרות זאת, שקול להשתמש מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) עבור כל ספריות רצף לפקד עבור ספריית המורכבות, במיוחד כאשר החל כמויות נמוכות של RNA וכאשר מחזורים PCR רבים נדרשים.
מאגר ופתרונות מניות: חייבים להיות מוכנים כל מאגרים עבור 4sU-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בתנאים מחמירים נטולת RNase בעזרת נוקלאז ללא מים. מומלץ לקנות מראש ללא נוקלאז NaCl, טריס-HCl, EDTA, ציטראט נתרן ומים. כדי להבטיח נוקלאז ללא תנאים, ניתן פתרון decontaminating RNase לנקות מדי סוכר או משטחים. כל מאגרים עבור שבב-seq צריך להיות לפחות ללא DNase וניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. תמיד להוסיף מעכבי פרוטאז, וכן מעכבי פוספטאז לפני השימוש ולשמור על קרח.
ביואינפורמטיקה: ניתוח של כל הנתונים רצף (קרי, צ’יפ-seq, RNA-seq ו ribsosome פרופיל) כולל בקרת איכות (למשל, באמצעות FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), מתאם זמירה (למשלעם cutadapt20) ולאחר מכן על-ידי מיפוי הגנום הפניה לתאים שנבחנה. עבור נתונים RNA-seq (סה כ והן 4sU-seq), כמו גם ריבוזום פרופיל נתונים, ממפה נקודות spliced RNA-seq נדרש, כגון ContextMap 221. עבור שבב-seq במערכים הנתונים unspliced, באמצעות BWA-מ22 מספיקה. ניתן לחשב ביטוי גנים באמצעות מודל (קורא לכל Kilobase של אקסון לכל למפות קטעים מיליון) ‘ RPKM ‘1, לאחר קביעת לקרוא ספירות לכל הגן באמצעות של התוכנית, למשל featureCounts23. שהתקשרת שיא מנתונים שבב-seq, מספר תוכניות זמינות, למשל, מקינטוש24 או פנינה25. בהמשך ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם R26, בפרט באמצעות כלים שסופקו על-ידי project Bioconductor27.
כאן אתגר גדול בשילוב רמות ה-RNA 4sU – וסה ‘ כ ופעילות translational מן הריבוזום פרופיל זה נורמליזציה. בגישה קלאסית כדי לטפל בבעיה זו היא לנרמל את רמות של משק בית גנים. כדי להפחית את הרעש עקב תנודות אקראיות עבור גנים בודדים משק בית, מומלץ לא רק להשתמש כמה גנים משק בית אבל רמות החציוני עבור קבוצה גדולה, למשל > גנים משק בית 3,000 שגיבש אייזנברג, לבנון28 . עבור חישוב של RNA שיעורי מחזור של יחסי של 4sU-ל ש-RNA הכולל, נורמליזציה מבוסס על מחזור החציוני שיעורי (למשל, בהנחה של RNA half-life של 5 שעות)29. עם זאת, שכן ההנחה היא אין שינויים כוללים בהתאם לדרישה עבור גנים משק בית, אנו ממליצים להשתמש גישות ניתוח עצמאי של נורמליזציה, למשל, המתאם מבוסס-קיבוץ באשכולות של הזמן-סדרת סוגי הנתונים השונים כדי לזהות קבוצות של גנים עם התנהגות ברורים תמלול ותרגום במהלך ההפעלה. לקבלת תיאור מפורט על bioinformatical שילוב של סוגי הנתונים השונים, אנו מכנים הפרסום המקורי11.
ניתוח של אינטגרציה המחירים והנתונים מחזור: מאמר שפורסם לאחרונה33 השוואת מחצית החיים נקבע על-ידי פקד מרובבת ג’ין (MGC) שיטות גלובליות יכול להראות כי מחצית החיים בקורלציה הטוב ביותר עם אלו מתקבל על ידי שיטות תיוג מטבולית, לעומת שיטות אחרות (למשל, כללי עיכוב של תעתוק סמים). עם זאת, יש לציין כי ההבדלים בין מחצית חיים חישובים יכול להיווצר, היה מתואר 15,34. אנחנו מהווים רוב בעיות ההבדלים אשר הציג מאת תגובת המתח עקב חשיפה ממושכת 4sU. לכן, זה הכרחי כדי לא לכלול את תגובת המתח שהוצגו על ידי תיוג 4sU. כדי לתת תוקף נוסף מחזור המחירים, אנו ממליצים על השימוש MGCs.
בנוסף, ערכת נתונים כפי שנוצר כאן יכול לשמש גם עבור אינטגרטיבית יותר נתונים ניתוח (למשל, ויסות זמן אי קידוד RNAs)35,36.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לארס Dölken לייעוץ להקים 4sU תיוג עבור תאי T הראשי; אליזבת גראף, תומאס Schwarzmayr לעזרה קריטי ב ספריית דורות ורצף; דירק Eick, אנדרו פלטלי על מתן נוגדנים RNAPII ו תא T; (ש ע) הנרייטה Uhlenhaut, פרנציסקה Greulich לעזרה כהכנה ספריית שבב-seq; קרוליין ג פרידל נתמכה על ידי מענקים FR2938/7-1 ו- CRC 1123 (Z2) מ דויטשה פתוח (DFG); אלקה Glasmacher נתמכה על ידי המענק GL 870/1-1 פתוח דויטשה (DFG) וממרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD), מינכן זנטרום הלמהולץ.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |