Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Abstract

Na activatie, cellen snel veranderen hun functionele programma's en daarmee hun genexpressie profiel. Massieve veranderingen in genexpressie optreden, bijvoorbeeld tijdens celdifferentiatie, genuitdrukking en functionele stimulatie (zoals activering van immune cellen), of na blootstelling aan drugs en andere factoren van de lokale omgeving. Afhankelijk van de stimulus en cel type, deze wijzigingen worden snel en op elk mogelijk niveau van de genexpressie. Weergave van alle moleculaire processen van een reagerende cel naar een bepaald soort prikkel/drugs is een van de moeilijkste taken in moleculaire biologie. Hier beschrijven we een protocol waarmee de gelijktijdige analyse van meerdere lagen van genexpressie. Wij vergelijken, in het bijzonder transcriptiefactor bindende (chromatine-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), DOVO transcriptie (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA de verwerking, en omzet, alsmede vertaling (ribosoom profilering). Door de combinatie van deze methoden, is het mogelijk om een gedetailleerde en genoom-brede cursus van actie weer te geven.

Nieuw getranscribeerde RNA sequencing wordt vooral aanbevolen bij het analyseren van de snel aan te passen of veranderende systemen, omdat dit de transcriptionele activiteit van alle genen in de tijd van blootstelling van de 4sU toont (ongeacht of ze up- of werden). De combinatorische gebruik van totale RNA-seq en ribosoom profiling kan bovendien de berekening van de omzet en vertaling tarieven RNA. Bioinformatic analyse van high-throughput rangschikkend resultaten zorgt voor vele instrumenten voor analyse en interpretatie van de gegevens. De gegenereerde gegevens kunt ook bijhouden van co-transcriptional en alternatieve splicing, gewoon om te noemen een paar mogelijke uitkomsten.

De gecombineerde aanpak hier beschreven kan worden toegepast voor verschillende modelorganismen of celtypen, met inbegrip van primaire cellen. Bovendien, wij bieden gedetailleerde protocollen voor elke methode gebruikt, met inbegrip van kwaliteitscontroles, en bespreken van potentiële problemen en valkuilen.

Introduction

In de afgelopen jaren is de RNA-sequencing (RNA-seq) de standaard tool voor het analyseren van alle geuite RNAs binnen een cel of een organisme1geworden. Om te begrijpen het hele proces van cellen aan te passen in reactie op een bepaalde prikkel/drug, is het echter nodig om volledig alle onderliggende processen, variërend van de transcriptie van mRNA tot verwerking, omzet en vertaling. Op korte termijn wijzigingen in RNA transcriptie kunnen nauwelijks worden gemeten door de totale RNAseq, aangezien veranderingen van totale RNA is afhankelijk van factoren zoals RNA halfwaardetijd en transcriptionele activiteit, die een slechte sjabloon voor als gevolg van de aanpassing van de cellen om te zijn milieu-effecten2,3. Inderdaad, een verscheidenheid van nieuwe sequencing technieken zijn ontwikkeld waarmee een analyse van de verschillende stappen in het proces van gen voorschrift4 wanneer op de juiste wijze worden gecombineerd. Dit protocol wordt beschreven hoe sommige nogal gemakkelijk toepasbare sequencing technieken waarmee het bijhouden van de regulering van de essentiële lagen van mRNA in een vergelijkende wijze combineren. Voor het analyseren van transcriptionele activiteit, een verscheidenheid van methoden zijn beschreven, zoals Cap-analyse van gen expressie (kooi)5, inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)6en genoom-brede nucleaire looppas (GRO-seq)7 , 8, evenals bromouridine-sequentie (Bru-seq) en 4-thiouridine-sequencing (4sU-seq), die gebruik maken van metabolieten die zijn opgenomen in nieuw Getranscribeerd RNA9,10, gewoon om er een paar noemen. Terwijl kooi de exacte transcriptie start site identificeert, NET-seq en GRO-seq meer accurate informatie leveren over het lezen van de richtingen en 4sU-seq (dat is de hier beschreven methode) alleen nieuw detecteert Getranscribeerd RNA. 4sU-seq is echter uiterst gevoelige en kan worden toegepast in verschillende time frames voor het meten van kwantitatieve transcriptionele activiteit in actief veranderende cellen, alsook kwantitatieve veranderingen in mRNA-verwerking (die gebeurt binnen minuten)9, 11,12. 4sU-seq is bovendien ideaal om te combineren met RNA-seq voor het berekenen van RNA omzet tarieven voor genen9. De transcriptie van mRNA wordt uitgevoerd door RNA Polymerase II (RNAPII), die op zijn beurt wordt beïnvloed door een veelheid van factoren, zoals transcriptiefactoren, histone modificaties en algemene activators/repressors dat kan zelfs deel uitmaken van de transcriptionele complex. Om te testen hoeveel gen/promotor/versterker-regio's zijn gebonden aan één factor, heeft ChIP-seq ontwikkeld, die is nu de standaardmethode voor dit doel, als gevolg van de vele verkrijgbare antilichamen13. Echter, hoewel ChIPseq duidelijke informatie geeft over waar regulering bind factoren, het weerspiegelt niet als het inderdaad tot veranderingen in de transcriptie14 leidt. ChIP-seq uitvoeren met 4sU-seq is daarom de ideale combinatie voor een dergelijke biologische vragen. Regulering van de expressie van genen kan ook optreden in een later stadium, aangezien15,16, met vermelding van potentieel belangrijke verordening betreffende de translationeel of posttranslationele doen niet noodzakelijkerwijs correleren van mRNA en proteïne niveaus niveau, afhankelijk van de context. In het jaar 2011, ribosoom profilering had zijn eerste gecombineerd met RNA-seq en is nu de methode van keuze te kwantificeren van wijzigingen die snel in eiwit, optreden aangezien er nog enkele gevoeligheid grenzen met massaspectrometrie17. Inderdaad, vertaaltarieven verkregen van dergelijke methoden is gebleken te leveren een relatief goede schatting van veranderingen in eiwitniveaus (ten minste gemeten voor veranderingen op lange termijn) en een nog meer gedetailleerde kijk op het proces van het vertalen, bijvoorbeeld de bepaling van begin-kant en alternatieve vertaling frames17. De combinatorische gebruik van alle vier methoden kunnen worden gebruikt in stabiele toestand, tussen verschillende celtypes, of in een tijd-serial experimenteren van een snel veranderende cel11. Dit gebruik is een genoom-brede overzicht van wijzigingen in transcription factor binding beïnvloeden RNA transcriptie, verwerking en vertaling.

Protocol

Alle methoden zijn overeenkomstig en naleving van de Helmholtz Zentrum München institutionele, provinciale en federale richtsnoeren.

1. voorbereiding

  1. Maken van een gedetailleerd plan van de experimentele opstelling met inbegrip van een tijdschema, wanneer het toevoegen van 4sU aan het kweekmedium cel en wanneer om te oogsten van de cellen voor elke methode. Afhankelijk van de biologische vraag, zorgvuldig overwegen tijdstippen voor monster tekenen, 4sU-labeling tijd en concentratie (tabel 1).
    Opmerking: Controleer of de impact van 4sU op de levensvatbaarheid van de cellen en benadrukken reactie vooraf (zie "Verifiëren optimale 4sU-labeling omstandigheden" in de resultaten van de vertegenwoordiger en Figuur 1). Het is raadzaam voor het uitvoeren van een oriënterende proef van elke methode met ten minste één monster. Controleer of als de kwaliteit en de hoeveelheid RNA/DNA volstaat voor diepe rangschikken (Zie gewijd gedeelten van het protocol), en praktijk snel maar zachte behandeling van de cellen tijdens het experiment.
  2. Bereken het aantal cellen die nodig zijn voor elk punt van de tijd van elke methode (Zie tabel 2 voor een ruwe schatting bij het gebruik van primaire T-cellen). Bedenk ook sequencing minder monsters van totale RNA dan enkel dat van 4sU RNA (bijvoorbeeldalleen voor punt vertaling tijdloon of RNA omzet moet worden berekend). Om te bevestigen en controleren of de betekenis van de resultaten (aanbevolen), maakt u ten minste één biologische repliceren.
    Opmerking: Nog belangrijker is, voor alle methoden en opeenvolgende tijdstippen, monsters moeten afkomstig zijn uit dezelfde startende groep cellen. Ten minste één speciale onderzoeker voor elke methode wordt aanbevolen.
  3. Alles wat nodig is van tevoren (bijvoorbeeld, aliquoted 4sU, cycloheximide, zoogdieren Lysis-buffermengsel, en 1% formaldehyde) voor te bereiden. Vermijd blootstelling van de cellen aan fel licht, na toevoeging van 4sU, omdat dit tot crosslinking van RNA tot cellulaire eiwitten184sU-label leiden kan.
  4. Het zwembad van alle cellen van belang in een kolf net vóór de behandeling (Figuur 2). Tellen van de cellen (bijvoorbeeldmet een hemocytometer) en gebruik het normbedrag voor de onbehandeld controlegewas van elke methode (Vergeet niet om ook het label van de onbehandeld controlegewas voor 4sU-seq met 4sU). Behandelen van de resterende cellen en onmiddellijk het splitsen van het vereiste aantal cellen voor elk tijdstip en elke methode. Omgaan met cellen zo spoedig mogelijk tot een minimum beperken van stress als gevolg van veranderingen in temperatuur of CO2 niveaus.
    Opmerking: bijvoorbeeld, monsters worden genomen van 1U, 2U, 3 uur na de behandeling, dan een kwart van de cellen wordt gebruikt voor onbehandeld controlegewas en driekwart worden gebruikt voor de behandelde controle.

2. 4sU-Labeling

Opmerking: Dit protocol is gewijzigd van Rädle, et al.. 19 verwijzen naar hun protocol voor verdere informatie met betrekking tot metabole labelen met 4sU. Voor alle methoden en opeenvolgende tijdstippen, moeten monsters afkomstig zijn uit dezelfde startende groep cellen.

  1. Start van Labeling
    1. Ontdooi aliquoted 4sU vlak voor gebruik. 4sU toevoegen op elke tijdstip direct naar het medium met cellen van belang (Zie tabel 2 voor aanbevolen T cel aantallen, ten minste 60 µg RNA per tijdstip), meng zachtjes, en plaats terug in de incubator. Gooi resterende 4sU (niet refreeze).
    2. Verzamelen aan het einde van labeling, cellen (bijvoorbeeld, cel schraper) en centrifugeer bij 330 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in polypropyleen tubes (die hoge g krachten weerstaan). Gecombineerd middellange en voeg reagens voor RNA isolatie (≥1 mL per 3 x 106 cellen, zie materialen voor aanbeveling welke te gebruiken) aan elke buis. Volledig resuspendeer de pellet (≥1 mL per 3 x 106 cellen), Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en bevriezen van de monsters bij-20 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 1 maand.
      Let op: De reagentia gebruikt om RNA te isoleren zijn uiterst gevaarlijke wanneer krijgen bij aanraking met de huid of ogen. Deze met zorg te behandelen en te overwegen de veiligheidsinstructies.
  2. Gebruik van de voorbereiding van de RNA gewijzigd protocol van de isolatie van de RNA
    1. Toevoegen van 0,2 mL chloroform per 1 mL reagens voor RNA isolatie, en meng door schudden voor de 15 s. doorgaan zoals vermeld in het metabole labeling protocol (stap 1-12, 2. Gebruik van de voorbereiding van de RNA gewijzigd trizol protocol) van Rädle et al. 19
    2. Meten van RNA concentratie (Zie Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik deze RNA voor totale RNA-seq zo goed (zie stap 3. Total RNA-seq) of opslaan bij-80 ° C gedurende ten minste 1 maand.
  3. Thiol-specifieke Biotinylation van nieuw getranscribeerde RNA
    1. Begin met 30-80 µg totale cellulaire RNA. 60 µg RNA moeten voldoende hoeveelheden van nieuwe getranscribeerde RNA opleveren.
    2. Labeling reactie voor te bereiden. Pipetteer in de volgende volgorde (per µg RNA): 1 µL 10 x Biotinylation Buffer, 7 µL RNA (met 1 µg RNA verdund in nuclease-vrije H2O), en 2 µL Biotine-HPDP (1 mg/mL). Biotine-HPDP laatst toevoegen en onmiddellijk meng door pipetteren. Wikkel buizen met aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling aan fel licht. Zie het onderwerp naar een alternatief voor Biotine-HPDP. Incubeer bij RT gedurende 1,5 h met rotatie.
    3. Centrifuge passende 2 mL buizen (Zie Tabel van materialen) bij 15.000 x g gedurende 2 min. Pipetteer al de biotinyleerd RNA in de tube pre gesponnen 2 mL, voeg een gelijk volume chloroform, en meng krachtig. Incubeer gedurende 2-3 min totdat de fasen beginnen te scheiden en belletjes beginnen te verdwijnen.
    4. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng zorgvuldig de bovenste waterfase in een nieuwe buis.
    5. Herhaal stap 2.3.3. en 2.3.4. een keer. 10% van de hoeveelheid NaCl (5 M) en een gelijke hoeveelheid isopropanol toevoegen aan de waterige fase. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen.
    6. Voeg dat een gelijk volume vers bereid ethanol 75%. Centrifugeer bij 20.000 x g. negeren het supernatant, kort draaien en verwijderen van de resterende ethanol. Volledig resuspendeer in 30-100 µL H2O (gebruik 1 µL H2O per 1 µg input RNA vanaf stap 2.3.1) door het mengen van de pipet.
    7. RNA integriteit controleren door elektroforetische analyse, of neem een aliquoot gedeelte en controleer of later.
  4. Scheiding van nieuw getranscribeerd (met het label) en het kader van onderzoekopleiding (labelloze) RNA
    1. Verwijder paramagnetisch kralen (Zie Tabel van materialen) van 4 ° C-opslag en laat het staan voor ten minste 30 min om hen te brengen tot kamertemperatuur. Warmte 4sU wassen buffer (3 mL per monster) tot 65 ° C.
    2. Bereid 100 mM dithiothreitol (DTT) oplossing. DTT wegen op een ultra-fijne schaal en voeg de benodigde hoeveelheid water nuclease-vrij. Altijd vers bereid. Gebruik 200 µL per monster.
    3. Warmte biotinyleerd RNA monsters (1 µg/µL) tot 65 ° C gedurende 10 minuten te denatureren en onmiddellijk plaats op ijs. Voeg 100 µL daar kralen aan biotinyleerd RNA en Incubeer bij RT gedurende 15 min met rotatie.
    4. Een juiste kolom (Zie Tabel van materialen voor aanbevelingen) voor elk monster in de magnetische stand, en vooraf equilibreer elke kolom met 1 mL kamertemperatuur 4sU wassen buffer.
      Let op: Dit duurt ongeveer 5-10 min. Als een of meer kolommen niet na 5 min aftappen starten doen, drukt u op zachtjes op de top van de kolom met een gehandschoende vinger.
    5. Een RNA/kralen mix van toepassing op het midden van elke kolom. Gooi de doorstroom, tenzij labelloze RNA moet worden hersteld. Zo ja, verzamelen de doorstroming en ten minste de eerste wasbeurt. Uitvoeren van het herstel van RNA, zoals beschreven door Rädle et al. (stap 1-7, 7. Herstel van labelloze, niet-afhankelijke RNA)19.
    6. Spoel driemaal met 0,9 mL 4sU wassen buffer (voorverwarmd tot 65 ° C uit stap 2.4.2.) en 0,9 mL RT 4sU wassen buffer, respectievelijk.
    7. Gebruik paramagnetisch kralen nieuw herstellen Getranscribeerd RNA. Pipetteer 400 µL van goed verspreide RT paramagnetisch parels in een tube per monster en plaats onder elke kolom. Elueer nieuw getranscribeerde RNA met 100 µL 100 mM DTT. 3 min wachten en het uitvoeren van een tweede elutie met 100 µL 100 mM DTT. (Optioneel: elutie en herstel uit te voeren zoals beschreven door Rädle et al.) 19
    8. Mix nieuw Getranscribeerd RNA/kralen grondig door Pipetteer 10 keer mengen en ga te werk volgens de fabrikant richtsnoer. Elueer RNA in 11 µL nuclease-vrije H2O.Quantify RNA met behulp van een geschikte Fluorimeter (Zie Tabel van materialen). RNA kan worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende ten minste 1 maand.
      Opmerking: Nieuw Getranscribeerd RNA kan worden gebruikt voor het bereiden van cDNA bibliotheken voor het rangschikken van de volgende generatie (Zie Tabel van materialen voor een suggestie over welke kit te gebruiken) of verder stroomafwaarts analyses. 100 - 500 ng RNA zijn voldoende voor de meeste bibliotheek voorbereiding kits (zie discussie).

3. totaal RNA-Seq

  1. Neem direct RNA van 4sU het label van RNA na RNA voorbereiding met behulp van de gewijzigde reagens voor RNA isolatie protocol voor totale RNA-seq (zie stap 2.2.2.)
  2. Voorbereiding van de bibliotheek, Verdun een RNA aliquoot deel aan een eindconcentratie van 50-100 ng / µL. gebruik dezelfde kit wat betreft de voorbereiding van de bibliotheek van nieuw getranscribeerde RNA. 100 - 500 ng RNA zijn voldoende voor de meeste bibliotheek voorbereiding kits.

4. ribosoom profilering

Opmerking: Voor alle methoden en opeenvolgende tijdstippen, monsters moeten afkomstig zijn uit dezelfde startende groep cellen. Voor aanbevelingen over welke kit te gebruiken, verwijzen naar de Tabel van materialen.

  1. Voorbereiding en isolatie van ribosoom beschermd fragmenten (RPFs):
    1. Gebruiken van passende hoeveelheden cellen voor elk punt van de tijd (Zie tabel 2 voor aanbevolen T cel aantallen). Adherente cellen met cycloheximide behandelen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
      Let op: Cycloheximide is zeer giftig en mutaties kan veroorzaken. Vermijd contact met de huid en inhalatie.
    2. Verzamelen en zwembad niet - of semi - adherent cellen uit telkens wijs in één polypropyleen buis en aanpassen van de uiteindelijke concentratie aan 1 x 106 cellen per mL van cel-specifieke medium (b.v., aangevuld RPMI voor T-cellen). Toevoegen van cycloheximide met een eindconcentratie van 0,1 mg/mL, Meng door het omkeren van de polypropyleen buis en incubeer gedurende 1 min. Centrifuge cellen gedurende 5 minuten bij 330 x g bij 4 ° C. Medium gecombineerd en wassen van cellen met ten minste 10 mL PBS aangevuld met cycloheximide (eindconcentratie van 0,1 mg/mL).
    3. Centrifuge cellen gedurende 5 minuten bij 330 x g bij 4 ° C. Gecombineerd middellange en voeg 100 µL zoogdiercellen lysis-buffermengsel per 10 x 106 cellen. Meng door pipetteren en verdrijven door een steriele naald voor 22 25-gauge Lyse de cellen volledig.
    4. De cel lysate overbrengen in een precooled 1,5 mL-buis. Incubeer gedurende 10 min op ijs met periodieke inversies. Centrifugeer gedurende 10 min bij 20.000 x g bij 4 ° C tot verduidelijking van de lysate. Het supernatant overbrengen in een precooled 1,5 mL-buis.
    5. Bereiden van een 1:10 verdunning van de lysate met nuclease-gratis water en record een260lezing met een spectrofotometer. Nuclease-gratis water gebruiken als een blanco en een 1:10 verdunning van zoogdiercellen lysis buffer als de standaard. De A-260/mL concentratie van de lysate volgens de volgende vergelijking berekenen:
      (Een260 cel lysate - een260 zoogdieren Lysis-buffermengsel) x 10 verdunningsfactor = een260/mL
    6. Maak 200 µL aliquots van het lysate op ijs en doorgaan met de behandeling van de nuclease.
      Opmerking: Optioneel, een aliquoot 100 µL voorbereiden totaal RNA, voeg 10 µL van 10% SDS en meng. Bewaren bij 4 ° C en ga verder met 4.3.2. Met behulp van totaal RNA van 4sU-label RNA wordt aanbevolen (zie stap 3. Totaal RNA-seq).
  2. Ribosoom footprinting
    1. Nuclease behandeling onmiddellijk zonder bevriezing de lysate presteren. 7,5 eenheden voor nuclease (inbegrepen in de aanbevolen kit) toevoegen voor elke A260 van lysate. Bijvoorbeeld: 80 A260/mL lysate x 0,2 mL lysate x 7.5 U/A260nuclease = 120 U nuclease.
      Opmerking: Optioneel, Titreer de nuclease voor de spijsvertering, zoals beschreven door de fabrikant.
    2. Incubeer de nuclease reactie voor 45 min op RT met zacht mengen. Bevriezen 200 µL aliquots van het lysate met vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C, of stop de nuclease reactie door toevoeging van 15 µL RNase remmer aan elke 200 µL aliquoot, en ga verder met stap 4.3.2.
  3. Zuivering van RPFs
    1. Een monster van de nuclease verteerd RPFs ontdooien en voeg 15 µL RNase Inhibitor van de omwenteling. Houd de monsters op ijs.
    2. Zuiveren van de RPFs volgens de fabrikant protocol (kolom zuivering wordt aanbevolen) en RNA concentratie op een spectrofotometer meten.
  4. rRNA uitputting
    1. Gebruik 5 µg gezuiverde RPFs voor rRNA uitputting.
    2. Volg de fabrikant protocol (stap 1-2, primaire rRNA uitputting) voor rRNA uitputting. Maatregel RNA concentratie van rRNA verarmd RPFs op een spectrofotometer.
  5. PAGINA zuivering van RPFs
    1. Gebruik 500 ng van rRNA verarmd RPFs voor de zuivering van de pagina.
    2. RNA controle, voorbeelden en ladder voorbereiden door pagina zuivering. Meng 5 µL RNA controle en 5 µL denaturering gel laden kleurstof in een tube van 0,5 mL microcentrifuge. Mix 10 µL van elke RPF met 10 µL van de denaturering gel laden, respectievelijk. Bereiden van een ladder aliquoot (4 µL 20/100 ladder 1 µL nuclease-gratis water en 5 µL denaturering gel laden kleurstof). Laden tussen elk monster en controle om te voorkomen dat kruiscontaminatie.
    3. Denatureren van monsters en ladder door broeden bij 95 ° C gedurende 5 min en onmiddellijk plaats op ijs. Laden van 20 µL van elk monster (optioneel, belasting 10 µL en bevriezing resterende monsters bij 20 ° C) gescheiden door 10 µL van bereid ladder op een 12% of 15% ureum-polyacrylamide-gel. 10 µL van RNA besturingselement laden. De gel draaien totdat de blauwe bromophenol-band de onderkant van de gel (180 V, ~ 70 min tot) (Figuur 3).
    4. Vlek de gel volgens de fabrikant protocol bij 4 ° C. Gebruik een donker-veld transilluminator dat blauw licht te visualiseren het RNA uitzendt. Accijnzen gel segmenten voor elk monster die overeenstemt met ~ 28 en 30 nt in lengte. Overnemen van het RNA als referentie en de accijnzen het.
      Opmerking: RPFs zijn nauwelijks zichtbaar. Accijnzen segmenten op de grootte die is aangegeven door het besturingselement van de RNA - bevattende twee oligos van 28 en 30 nt in lengte - zelfs als monsters niet zichtbaar zijn.
    5. Een gat in de bodem van 0.5 mL microcentrifuge tubes doorprikken met een steriele naald van 20-gauge. Pipetteer elk segment gel in een aparte buis en plaats afgetopt buizen in een tube van 1,5 mL. Centrifugeer gedurende 2 min van 12.000 x g. Repeat centrifugeren als gel segmenten niet volledig in de 1,5 mL-buis versnipperen zijn.
    6. Elueer RNA van verstoorde gel segmenten met 400 µL nuclease-gratis water, 40 µL ammoniumacetaat (5 M) en 2 µL SDS (10%) elke overnachting bij 4 ° C.
    7. De gier aan 1,5 mL filter buizen (voorzien van de aanbevolen kit) met een 1 mL pipet tip (wide-boring tip of zelf-gemaakte 1 mL tip met gesneden einde) overdragen. Centrifugeer gedurende 3 min op 2.000 x g te scheiden geëlueerd RNA van gel segmenten. Pipetteer zachtjes waterige oplossing in een 1,5 mL-buis. Voeg 2 µL glycogeen (voorzien van de aanbevolen kit) en 700 µL 100% isopropanol en winkel bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    8. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten op 13.000 x g. Discard supernatant. De pellet met vooraf gekoeld versbereide 80% ethanol bij 4 ° C gedurende 10 minuten op 13.000 x g. Discard supernatant wassen en drogen. Resuspendeer elk monster in 20 µL en het besturingselement RNA in 8 µL nuclease-gratis water. Bewaren bij-20 ° C indien nodig.
  6. Fragmentatie, einde reparatie, 3' adapter afbinding, omgekeerde transcriptie
    1. Voer de procedure zoals beschreven door de fabrikant protocol (fragmentatie en einde reparatie, 3' adapter afbinding en omgekeerde transcriptie).
  7. PAGINA zuivering van cDNA
    1. Monsters, RNA controle en ladder voorbereiden door pagina zuivering: Mix 10 µL van elk monster en RNA controle met 10 µL denaturering gel laden kleurstof, respectievelijk. Bereiden van een ladder aliquoot (4 20/100 µL ladder, 1 µL nuclease-gratis water, 5 µL denaturering gel laden kleurstof). Laden tussen elk monster en controle om te voorkomen dat kruiscontaminatie.
    2. Denatureren van monsters en ladder door broeden bij 95 ° C gedurende 5 min en onmiddellijk plaats op ijs. Laden van 20 µL van elk monster (optioneel, belasting 10 µL en bevriezing resterende monsters bij 20 ° C) gescheiden door 10 µL van bereid ladder op een 10% polyacrylamide/7 - 8 M ureum/TBE gel. 10 µL van RNA besturingselement laden. De gel draaien totdat de blauwe bromophenol volledig uit de gel (180 V, ~ 60 min migreert).
    3. Vlek de gel volgens de fabrikant protocol bij 4 ° C. Gebruik een donker-veld transilluminator dat blauw licht te visualiseren van RNA en accijnzen van de gel-segmenten voor elk monster overeenkomt met ~ 70-80 nt uitzendt.
    4. Ga verder zoals beschreven in stap 4.5.5 - 4.5.8 en resuspendeer elk monster in 10 µL van de nuclease-vrij van het water.
  8. cDNA Circularization
    1. Alle reacties genoeg circularization master mix voorbereiden door een combinatie van de volgende reagentia voor elk monster op het ijs: 4.0 µL Circularization reactie Mix, 2.0 µL ATP, 2.0 µL MnCl2en 2.0 µL Ligase.
    2. 10 µL van de master mix toevoegen aan elk monster. Meng voorzichtig en kort centrifugeren. Incubeer monsters bij 60 ° C gedurende 2 h. onmiddellijk plaats monsters op ijs.
  9. PCR versterking
    1. Volg de fabrikant protocol (stap 1-3, PCR versterking) voor PCR versterking. Gebruik 4 µL van circularized cDNA voor versterking met 9 cycli van PCR voor primaire T-cellen, om beste resultaten te bereiken.
    2. Zuiveren van bibliotheken en hun verdeling naar grootte, volgens de fabrikant protocol (stap 4-8, PCR versterking) te controleren. De verwachte omvang van de versterkte bibliotheek is 140-160 bp (Zie Figuur 4).
    3. Raadpleeg de fabrikant protocol en de sequencing-faciliteit voor verdere leidraden voor sequencing bibliotheken.

5. chIP-Seq

Opmerking: Dit protocol is gewijzigd van Blecher-Gonen, et al.. 14 verwijzen naar hun protocol voor meer informatie over ChIP-seq. Voor alle methoden en opeenvolgende tijdstippen, monsters moeten afkomstig zijn uit dezelfde startende groep cellen.

  1. Crosslinking en oogsten van de cellen
    1. Dwarslijn juiste aantal cellen (Zie tabel 2 voor aanbevolen T cel aantallen) voor elk punt van de tijd met een eindconcentratie van 1% formaldehyde in een cellspecific medium (b.v., aangevuld RPMI voor T-cellen) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zachte rockende. Stop het crosslinking reactie door toevoeging van glycine aan een eindconcentratie van 0,125 M.
    2. Centrifuge cellen bij 330 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en wassen van de cellen in de ijskoude PBS. Herhaal stap 5.1.2 tweemaal en bevriezen van cel pellets bij-80 ° C. Bevroren pellets kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 6 maanden.
  2. Lysis van de cel en ultrasoonapparaat
    Opmerking: In alle cel lysis en ultrasoonapparaat stappen, monsters moeten worden bewaard op het ijs of bij 4 ° C tot het minimaliseren van de dwarslijn omkering en eiwit-afbraak.
    1. Resuspendeer cel pellets in 1 mL ijskoud cellysis-buffermengsel met vers toegevoegd proteaseinhibitors te isoleren van de kernen (phosphatase inhibitors optioneel toevoegen). Incubeer gedurende 10 min op ijs en centrifugeer bij 2.600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    2. Gecombineerd supernatant en resuspendeer kernen pellet in 1 mL ijskoud kernen lysis-buffermengsel met vers toegevoegd proteaseinhibitors (optioneel: Voeg phosphatase inhibitors). Incubeer gedurende 10 min op ijs. Bewerk de cellen om te genereren een gemiddelde DNA grootte Fractie van 0,2 - 1.0 kb ultrasone trillingen ten (Zie Figuur 5).
      Opmerking: Ultrasoonapparaat voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd volgens het celtype en verdere voorwaarden (bijvoorbeeld, celaantal, volume en buffer). Voor primaire T-cellen, wordt ultrasoonapparaat voor 20-25 cycli aanbevolen (Zie materialen voor gedetailleerde beschrijving).
    3. Neem een 20-50 µL aliquoot van de sheared chromatine en warmte gedurende 10 minuten bij 95 ° C en 1000 rpm schudden te voeren een snel omgekeerde dwarslijn en controleer of de grootte van de chromatine. Voeg 2-5 µL proteïnase K en incubeer gedurende 20 minuten op 56 ° C en 1000 rpm schudden. Warmte inactivatie uitvoeren gedurende 10 minuten bij 95 ° C en 1000 rpm schudden. Zuiveren van chromatine met een passende kit (Zie Tabel van materialen). Controleer de grootte van de chromatine op een 1% agarose gel en gebruik 100 bp Plus Marker.
    4. Centrifugeer sheared chromatine met een gemiddelde DNA breuk van de grootte van 0,2 - 1.0 kb voor 10 min op 20.000 x g- en 4 ° C om de pellet onoplosbare chromatine en puin. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en houd op ijs.
    5. 5-10% van de sonicated chromatine houden als input. Bevriezen bij-20 ° C (in stap 5.5.2 gebruikt).
  3. Paar antilichaam aan kralen
    1. Paar 10 µg antilichaam (bijvoorbeeldanti-RNA Pol II; anti-Histon H3K36me3) in 220 µL PBS (met 0,5% BSA en 0,5% Tween 20) naar 80 µL superparamagnetische kralen gekoppeld aan eiwit G (Zie Tabel van materialen) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met rotatie.
    2. Plaats de buizen op een magneet. Wacht tot alle kralen zijn gebonden aan de magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Verdere blok met 6 µL sonicated zalm sperma DNA in PBS (met 0,5% BSA en 0,5% Tween 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met rotatie.
    3. Plaats de buizen op een magneet. Wacht tot alle kralen zijn gebonden aan de magneet en de duidelijke bovendrijvende vloeistof verwijderen. Spoel kralen met ChIP IP-buffer driemaal.
  4. Chromatine Immunoprecipitation
    1. Verdun chromatine tot de totale volume 1 mL in kernen lysis-buffermengsel met vers toegevoegd proteaseinhibitors (eventueel phosphatase inhibitors). Toevoegen van ChIP IP-buffer met vers toegevoegd proteaseinhibitors (eventueel phosphatase inhibitors) tot een eindvolume van 3 mL. Houd op ijs of bij 4 ° C terwijl antilichaam is gekoppeld aan de kralen.
    2. Verdunde chromatine aan het antilichaam gekoppeld kralen uit stap 5.3.3 en incubeer over nacht bij 4 ° C met zachte rotatie toevoegen.
    3. Wassen met de volgende buffers (1 mL per stuk, Zie Tabel van materialen) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met rotatie, buizen plaats terug op de magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen: Wash Buffer ik, wassen Buffer II Buffer III wassen en 2 x TE pH 8,0 respectievelijk.
    4. Vloeistof wordt weggeworpen en drogen voor ~ 5 min.
  5. Omgekeerde crosslinking
    1. Monsters uit de magneet verwijderen. Voeg 50 µL elutie buffer en meng door pipetteren om Elueer eiwit-DNA complexen van de kralen.
    2. Omvatten input elk exemplaar van deze stap voorwaarts. Toevoegen van elutie buffer input elk exemplaar voor een eindvolume van 50 µL (te houden de buffer samenstelling vergelijkbaar met de ChIP monsters) en proces samen met de monsters van de ChIP.
    3. Mix 3 µL van elutie buffer en 2 µL van RNase (DNase gratis). 5 µL van het mengsel toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    4. Mix-2.5 µL proteïnase K 1 µL glycogeen en 1,5 µL elutie buffer per monster. 5 µL van het mengsel toevoegen aan elk monster (1 U proteïnase K en 20 µg glycogeen per monster) en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    5. Incubeer de monsters bij 65 ° C's nachts (ten minste 4 h) met schudden voor het uitvoeren van de omgekeerde crosslinking.
    6. Plaatsen van de buizen aan de magneet voor ten minste 30 s en overdracht de bovendrijvende substantie aan een nieuwe buis. Monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C voor maximaal 12 maanden.
  6. DNA zuivering
    1. 140 µL van goed verspreide paramagnetisch parels aan 60 µL van monster (2.3:1 ratio) toevoegen. Pipetteer zorgvuldig op en neer 25 keer naar meng. Zorg ervoor dat de vloeistof in elke buis homogene. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten plaats de buizen op de magneet voor 4 minuten, of totdat alle kralen zijn gebonden aan de magneet en de vloeistof wordt weggeworpen.
    2. Laat de buizen aan de magneet en voeg 200 µL van vers bereide 70% ethanol. Incubeer de buizen voor 30 s zonder verstoring van de kralen. Verwijder het supernatant en herhaalt u deze stap nogmaals. Gecombineerd ethanol volledig en laat de paramagnetisch kralen luchtdroog voor 4 min.
      Opmerking: Onvolledige ethanol verwijdering kan serieus verminderen DNA herstel en opbrengst. Droog de pellet slechts tot het droog is. Te veel drogen de pellet kan verminderen van DNA herstel en opbrengst.
    3. Verwijder de buizen uit de magneet en Voeg 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). Pipetteer zachtjes het gehele volume boven en beneden 25 keer naar meng. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen terug op de magneet voor 4 min en het supernatant overbrengen in een andere buis.
    4. Meten van de hoeveelheid DNA met een geschikt Fluorimeter (Zie Tabel van materialen).
    5. Controleer of dat de ChIP was succesvol door qPCR (verdund 1 µL in 100 µl H2O en gebruik 2-5 µL voor qPCR). Gebruik specifieke primers voor een positieve (bekende bindende site van proteïne van belang) en de negatieve controle (bijvoorbeeld, een gen dat is stil en/of niet een doelwit van de proteïne van belang).
      Opmerking: Voorbereiding van de bibliotheek kan worden uitgevoerd met 2 ng van ChIP DNA afhankelijk van de kit (Zie Tabel van materialen voor een suggestie over welke kit te gebruiken).

Representative Results

4 sU labeling: Controleer of optimale 4 sU-labeling voorwaarden (apoptosis, nucleaire stress, cytoplasmatische stress), tijd en concentratie: Hoge niveaus van 4sU kunnen remming van de productie en verwerking van rRNA en cytoplasmatische evenals nucleaire stress30veroorzaken. Daarom moeten de cellen van belang voor 4sU-geïnduceerde stress evenals apoptosis worden getest. Westelijke vlekkenanalyse wordt aanbevolen voor het visualiseren van p53 accumulatie, die aangeeft dat de nucleaire stress, verhoging van de niveaus van de phospho-EIF2a welke cytoplasmatische stress en fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse voor apoptosis worden weergegeven. Hoge en langdurige blootstelling aan 4sU of drugs zoals thapsigargin of arsenite kunnen worden gebruikt voor het opwekken van cellulaire spanning. Als u wilt het induceren van apoptose of cel dood, cellen werden behandeld met BH3I-1 (500 ng/µL) of bebroede gedurende 5 minuten bij 95 ° C (heat shock). Annexine V/7-AAD kleuring werd gebruikt om te bepalen van apoptotic (Annexine V) en doden (7-AAD) cellen. Etikettering van in vitro gegenereerd primaire Th1 cellen voor 0.5 h met 500 µM 4sU (eindconcentratie) of 1 h met 200 µM 4sU induceert evenmin tekenen van cellulaire stress noch apoptosis (Figuur 1) maar leiden tot een voldoende opname van de 4sU.

RNA labeling tijd kan ook worden ingekort (≤5 min) die leidt tot een toename van kortstondige intronic sequenties in vergelijking met langer labeling tijden. Om te visualiseren co-transcriptional splicing tarieven, 4sU-labeling tijden moeten niet groter is dan 30 min. Raadpleeg voor meer informatie over 4sUlabeling, Rädle et al. 19

Kwaliteitscontrole: RNA integriteit is van groot belang bij het verwerken van RNA. Is het meest handig om de kwaliteit van de RNA van 4sU-label RNA te controleren na biotinylation door electrophoretical analyse (Zie Tabel van materialen). Overwegen verifiëren van geïsoleerde RNA vanaf stap 2.2.2, vooral bij het gebruik ervan voor het rangschikken van totale RNA. RNA integrity nummer (RIN) moet ≥8 om RNA integriteit voor verdere verwerking (Figuur 3).

Electrophoretical analyse kan ook worden gebruikt om te controleren of nieuw getranscribeerde RNA. Wees ervan bewust dat nieuw getranscribeerde RNA bevat aanzienlijk minder volwassen rRNAs in vergelijking met de totale RNA met de typische rRNA bands wordt veel minder prominent.

Ribosoom profiling: PCR versterking van de cDNA Bibliotheek: versterking van cDNA (stap 4.9.1) is een cruciale stap om een goed rangschikkend resultaten. Versterkte bibliotheken analyseren door electrophoretical analyse. Een goed voorbeeld van versterkte bibliotheken toont een piek rond 140-160 bp (figuur 4A). Grote hoeveelheden van adapter Dimeren moeten worden vermeden (figuur 4B) en deze monsters verder moeten worden gezuiverd met behulp van de pagina zuivering procedure volgens de fabrikant protocol (pagina zuivering van PCR producten). Teveel sjabloon of te veel cycli van PCR kunnen leiden tot over-amplificatie gekenmerkt door het verschijnen van de hoger-dan-verwachte molecuulgewicht bands, vlekkerig PCR producten en adapter dimeer producten (figuur 4C). Voor de meeste monsters levert 1-5 µL van circularized cDNA en 9 cycli van PCR voor versterking meestal voldoende hoeveelheden van het juiste PCR product.

ChIP: chromatine schuintrekken: Optimale schuintrekken omstandigheden moeten worden aangepast voor elk type cel. Schuintrekken omstandigheden (bijvoorbeeld, aantal cycli, hoge of lage macht) vooraf bepalen. Gebruik hetzelfde aantal cellen en hetzelfde volume voor testdoeleinden, omdat een lagere celdichtheid de shearing efficiency verhoogt. Probeer te vermijden over - of onder-scheren de chromatine. Grote chromatine fragmenten kunnen drastisch invloed op ChIP resultaten door verstopping, en overdreven schuintrekken epitopes op de proteïne van belang, wat leidt tot een lagere bindende efficiëntie door het antilichaam kan vernietigen. In dit experiment, de beste resultaten werden behaald wanneer het belangrijkste gedeelte van de sheared chromatine ongeveer 1.000 was bp of iets lager (figuur 5A).

Verifiëren ChIP door qPCR: Voordat u begint de ChIP, is het raadzaam om te testen of het gebruikte antilichaam geschikt voor de ChIP is (indien mogelijk, gebruik ChIP rang antilichamen) door ChIP-qPCR. Controleren van de ChIP voor het rangschikken door qPCR voordat de bibliotheek voorbereiding (zie stap 5.6.5). Het ontwerpen van inleidingen die zich aan een bekende doelsite van de proteïne van belang binden. Als de exacte doelsite binnen een gen onbekend is, kunnen verschillende primerparen worden gebruikt voor het scannen van het gen en de bijbehorende regelgevende elementen. Voor de RNAPII ChIP van Th1 cellen Ifng, die is transcriptionally upregulated op stimulatie en actine inleidingen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Sox9 en insuline dienen als een negatieve controle, aangezien deze genen niet worden uitgedrukt in Th1 cellen (figuur 5B). Vergeet niet om gebruik van de exon-spanning primers, die normaal gesproken worden gebruikt voor qPCR van mRNA. Een IgG-controle kan ook worden gebruikt om aan te tonen van de specificiteit van het gebruikte antilichaam. Immunoprecipitated DNA kan worden gemeten met een geschikt Fluorimeter (Zie Tabel van materialen). Hoeveelheid nonspecifically afhankelijke DNA door de IgG-besturingselement moeten worden aanzienlijk lager in vergelijking met het bedrag van de DNA gebonden door het antilichaam van belang.

Wordt uitgevoerd, repliceert: bewijs van biologische betekenis: Het is sterk aangeraden om uit te voeren van de kinetische experiment voor alle methoden vanaf dezelfde groep cellen om cellen hebben dezelfde identiteit voor alle onbehandelde en behandelde monsters (Figuur 2). Toch is het aanbevolen om het nemen van kleine porties van de belangrijkste tijdstippen voor elke methode om te vergelijken monsters te een biologische repliceren (bijvoorbeelddoor qPCR, FACS analyse). Dit zorgt voor een ruwe schatting als de behandeling van beide replicatieonderzoeken reproduceerbaar was en je kon doorgaan met sequencing. Validatie van de replicatieonderzoeken moet worden verricht door middel van bioinformatical analyse. Reproduceerbaarheid van de resultaten kan worden beoordeeld in termen van de correlatie tussen FPKM waarden tussen wordt gerepliceerd en gevisualiseerd met behulp van scatter percelen (Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: Controle van de optimale 4sU-labeling omstandigheden zonder storing veroorzaakt celfysiologie (figuur van Davari et al.. 11)
(A) detectie van apoptosis van de cel FACS analyse: In vitro gegenereerd Th0 cellen werden behandeld met verschillende concentraties van 4sU (aangegeven in vierkante haken) voor 0.5 h, 1 h en 2 h, respectievelijk. BH3I-1 behandeling werd gebruikt voor het opwekken van apoptosis bepaald door Annexine V, overwegende dat warmte schok (5 min bij 95 ° C) werd gebruikt voor het opwekken van de dood van de cel bepaald door 7-AAD. (B) westelijke vlekkenanalyse voor p53 van 4sU behandeld en T-cellen geactiveerd: monsters waren gelabeld met 200 µM 4sU voor de aangegeven tijd van de activering, behalve 0.5 h tijd daarover was gelabeld met 500 µM 4sU. (C) westelijke vlekkenanalyse van phospho-EIF2a en totale EIF2a in geactiveerde Th1 cellen met dezelfde labeling voorwaarden zoals in (B). Thapsigargin werd gebruikt als positieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van een kinetische setup genoom-brede wijzigingen bijhouden
Dit schema illustreert de setup voor het combineren van 4sU-seq, totaal RNA-seq ribosoom Profiling en ChIP-seq te bestuderen van genoom-brede veranderingen bij de behandeling van de cel. Bundelen van cellen en zet opzij het vereiste aantal cellen voor onbehandeld controlegewas. Behandelen van de resterende cellen en split voor elk punt methode en tijd. Label onbehandeld/behandeld cellen voor 4sU-seq met 4sU zoals beschreven. Tijdstippen en monsters voor elke methode is afhankelijk van de specifieke biologische vraag onderzocht. Nemen van monsters voor elk tijdstip en elke methode en volgen het specifieke deel van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: controle van de kwaliteit van 4sU-label RNA
Totaal RNA en biotinyleerd RNA geactiveerde Th1 cellen verkregen werden geanalyseerd op een Bioanalyzer. 18s rRNA en 28 rRNA staan en RNA integriteit nummer (RIN) wordt gegeven door het instrument om de integriteit van het RNA. RIN moet ≥8 om RNA integriteit te garanderen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Bioanalyzer profielen van ribosoom profiling libraries
(A) A goede bibliotheek: het voorbeeld toont een piek op de verwachte groottewaaier (140-160 bp) en geen verdere zuivering nodig is. (B) dit voorbeeld toont buitensporige adapter dimeer versterkte product (120 bp) ten opzichte van het gewenste product (140-160 bp). Deze bibliotheek vereist verdere zuivering. (C) een overdreven versterkte monster: hoger-dan-verwachte molecuulgewicht pieken en vlekkerig PCR waarbij zichtbaar zijn (aangegeven door de pijlen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Optimale chromatine grootte na het scheren en verificatie van de ChIP door qPCR
(A) Agarose gel foto de omvang van de optimale fragment van de sheared chromatine van drie monsters die zijn geschoren voor 25 cycli op een ultrasoonapparaat en gezuiverd toont zoals beschreven in het protocol. (B) Q-PCR-resultaten van een totale RNAPII ChIP (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) wordt weergegeven als een percentage van de input. Ifng en actine inleidingen werden gebruikt als een positief, terwijl Sox9 en insuline negatieve controles zijn (beide genen zijn niet uitgedrukt in geactiveerde Th1-cellen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Vergelijking van biologische repliceert (figuur van Davari et al. 11)
Representatieve scatterplot expressie waarden (FPKM) te vergelijken tussen repliceert van nieuw getranscribeerde (4sU) RNA 4 h na stimulatie van geactiveerde Th1-cellen. De groene lijn geeft aan gelijke FPKM waarden en rangschikking correlatie in ieder waarnemingspunt is aangegeven.

Duur van labeling (min) Aanbevolen 4sU concentratie (µM)
120 100 - 200
60 200 - 500
15 - 30 500 - 1000
< 10 500 - 2000

Tabel 1: Aanbevolen 4sU concentraties (uit Rädle, et al.. 19)
Het bereik van de aanbevolen 4sU concentraties is geïndiceerd voor verschillende tijden van labeling.

Methode Mobiele nummer RNA bedrag
4sU-labeling ≥2 x 107 ≥60µg
Ribosoom profilering ≥2 x107
ChIP-seq ≥2 x 107 - 3 x 107

Tabel 2: Benodigde hoeveelheid primaire T-cellen
Minimale hoeveelheid benodigde primaire T-cellen voor elke methode. Bedragen kunnen kleiner zijn dan bij het gebruik van andere celtypes.

Discussion

Analyseren van het hele proces van genexpressie is noodzakelijk om cellulaire aanpassingen in reactie op een bepaalde prikkel of behandeling volledig te begrijpen. Het combineren van totaal RNA-seq, leidt 4sU-seq, ribosoom profilering en ChIP-seq op verschillende tijdstippen tot een uitgebreide analyse van de belangrijkste processen van genregulatie na verloop van tijd. Een diep inzicht in biologische processen zal moeten vaststellen van de experimentele opstelling, alsmede optimale tijd punten.

Omdat methoden om te studeren genregulatie snel verbeteren, kunnen deze protocollen aangepast worden aan snelle veranderingen. Toch bieden ze de belangrijkste methoden voor de studie van fundamentele gene regulerende mechanismen in elk type cel. Hier bespreken we een aantal van de valkuilen en de feiten die men overwegen moet bij het gebruik van deze methoden.

Cellen: Cellen moeten zeer levensvatbaar en als primaire geïsoleerde cuvetten, zuiverheid van cel populaties (bijvFACS analyse voor primaire T-cellen) moet worden gegarandeerd. Zelfs enigszins gestresst cellen kunnen invloed hebben op de resultaten van deze zeer gevoelige sequencing methoden verlagen de hoeveelheid nieuw getranscribeerde of vertaalde RNA en leiden tot ongewenste uitlezingen van de stressrespons bij de sequencing-resultaten. De snelheid van centrifugeren vermeld in dit protocol naar pellet cellen is geoptimaliseerd voor primaire T-cellen. Dus, het aanpassen van de snelheid afhankelijk van het celtype.

4 sU effecten op celfysiologie: Naast de bovengenoemde opties voor het controleren van de minimale verstoring aan cellulaire fysiologie op 4sU toevoeging, kan verdere en/of aanvullende analyse worden uitgevoerd, vooral wanneer cel nummers beperkt worden. Effecten op celproliferatie kunnen worden getest door te controleren of de verdubbeling tijd van cellen door cellen met labels en labelloze gewoon te tellen. Nucleolar stress inductie kon ook worden getest door het analyseren van de morfologie van de cel via immunofluorescentie kleuring van nucleolin en kernen. Verder controleren het effect van 4sU, gewijzigde mondiale genexpressie prestaties kan worden gemeten door het correleren graven van gelabelde totaal RNA naar labelloze totaal RNA te lezen.

Cel nummers: Voor in vitro gegenereerd T-cellen, is het aan te raden te beginnen met ten minste het bedrag van de cellen aangegeven in tabel 2. Kies adequate nummers per methode volgens het type van cellen. Aangezien T-cellen hebben minder cytoplasma en RNA ten opzichte van andere cellen, zou waarschijnlijk lagere hoeveelheden andere cellen toereikend zal zijn. Voor ChIP-seq afhangen cel nummers hoogst het antilichaam gebruikt en het niveau van de expressie van de proteïne van belang binnen de cellen. Voor Histon of RNAPII ChIP, kunnen fewe cellen worden gebruikt, dat cel nummers dienen te worden verhoogd wanneer transcriptiefactoren worden gebruikt, vooral als ze zijn uitgedrukt op een laag niveau.

4 sU-labeling en RNA-biotinylation: Bij het gebruik van Adherente cellen, kan 4sU labeling worden gericht zoals beschreven door Rädle et al. 19 sinds cellen zeer snel nemen 4sU, kan worden toegevoegd direct naar het medium van de schorsing, aanhanger of semi-Adherente cellen.

Het is raadzaam om te beginnen met de biotinylation met 60-80 µg van RNA. Niettemin, lagere bedragen van RNA kunnen worden gebruikt, hoewel we did niet toets voor minder dan 30 µg. Voeg een coprecipitant (b.v.GlycoBlue) toen Precipiterend RNA als de pellet moeilijk is te zien. Duffy et al. hebben ook aangetoond dat methylthiosulfonate-geactiveerde Biotine (MTS-Biotine) efficiënter reageert met 4sU-geëtiketteerden RNA dan HPDP-Biotine31. Vandaar, het misschien wel overwegen over te schakelen naar MTS-biotine, in het bijzonder voor het herstel van kleine RNAs, die de neiging om minder uridine residuen (verwijzen naar het biotinylation-protocol genoemd door Duffy et al.; Zie zuivering van 4sU-label RNA, waard Experimentele Procedures).

Voor het herstel van nieuw getranscribeerde RNA is het mogelijk om paramagnetisch kralen of RNA Cleanup kralen van uw keuze te gebruiken. Altijd rekening mee dat deze kits kunnen of kunnen niet voor specifieke RNAs zuiveren. Als u geïnteresseerd in miRNAs bent, bijvoorbeeld met behulp van specifieke uitrustingen voor miRNA vastleggen en sequencing.

Kwantificering van nieuw getranscribeerde RNA: Om te nauwkeurig kwantificeren nieuw getranscribeerde RNA, meting moet worden verricht door een geschikt Fluorimeter (Zie Tabel van materialen). Binnen 1 uur van de 4sU, blootstelling vertegenwoordigt nieuw getranscribeerde RNA ongeveer 1 tot 4% van de totale RNA. Nieuw getranscribeerde RNA van 1 h met het label, geactiveerde T-cellen bestaat uit ~ 90-94% van rRNA11.

Ribosoom Profiling: Bij de vaststelling van de methode, vastbesloten wij dat met behulp van 1,5 x het bedrag van de nuclease dan voorgesteld in het oorspronkelijke protocol staat garant voor goede spijsvertering. Ook geen bijwerkingen gemeld voor verhoogde hoeveelheid nuclease. Omdat het heel moeilijk om de overdigest van de RPFs terwijl ze deel van het RNA ribosomal eiwitten gebonden uitmaken, kunt u nog steeds een beetje verhoging van het bedrag om Titreer optimale nuclease spijsvertering.

Als minder dan 500 ng van RPF RNA werden teruggevonden in stap 4.4.2, herhaal rRNA uitputting en zwembad gezuiverd RPFs met RNA Clean & Concentrator-5 kolommen. Als alternatief, laad twee identieke monsters naast elkaar op de gel (stap 4.5.3) en zwembad gel segmenten tijdens RNA elutie van de gel (stap 4.5.6).

Het is raadzaam de RPFs snijden op een gel zo dicht mogelijk naar de 28 en 30 nt-bands. Dit helpt bij het elimineren van ongewenste fragmenten uit rRNAs en tRNAs, die later zal deel uitmaken van uw bibliotheek en verminderen van sequencing leest voor uw RPFs.

Het is ook aanbevolen om te voorkomen dat UV-licht tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de gel. Dit kunt nicks maken in de fragmenten van RNA, evenals de pyrimidine-Dimeren, die uiteindelijk kunnen ernstig beïnvloeden de bibliotheek voorbereiding en rangschikkend resultaten.

Bibliotheek voorbereiding en rangschikken van gegevens: Ribosoom profilering protocol kan genereren een cDNA Bibliotheek geschikt voor het rangschikken. Monsters die worden gegenereerd door het 4sU-labeling kunnen direct gebruikt worden voor de voorbereiding van de bibliotheek met elke passende RNA sequencing kit. Sinds nieuw getranscribeerde RNA, vooral wanneer met behulp van korte labeling van tijden, nog mogelijk niet polyadenylated, moet geen poly-A-selectie worden uitgevoerd. In plaats daarvan raden we rRNA uitputting om te voorkomen dat vermindering van de sequencing diepte voor de werkelijke steekproef. Met behulp van T-cellen, we begonnen met 400 ng nieuw getranscribeerde en totaal RNA (afhankelijk van de kit, zie materialen), uitgevoerd rRNA uitputting en verminderd cycli voor PCR versterking om te minimaliseren van PCR bias. Voorbereiding van de bibliotheek kan worden uitgevoerd met minder grondstof. Ter verantwoording voor PCR cycli aantallen bibliotheek complexiteit moeten worden geoptimaliseerd.

Voor ChIP-seq zijn er ook veel kits beschikbaar voor de voorbereiding van de bibliotheek. In onze handen bibliotheek voorbereiding werkte goed vanaf 2 ng van ChIP DNA (Zie materialen voor een suggestie op welke kit te gebruiken). Zorg ervoor dat te controleren van de indices voor de kleurbalans tijdens het rangschikken. Het is raadzaam een diepte van de sequencing van ≥40 x 106 leest elke voor 4sU-seq, totaal RNA-seq, en ChIP-seq monsters, en ≥80 x 106 leest voor ribosoom profilering van monsters. De diepte van de sequencing hangt af van het monster en de stroomafwaartse bioinformatics analyse en goed moet worden overwogen. Voor het analyseren van intronic leest voor cotranscriptional splicing, 100 moet bp gekoppeld-einde sequencing worden gekozen.

Sequencing bias: Sequencing is de gouden standaard geworden bij de vaststelling van mondiale veranderingen in transcriptie, vertaling of transcriptie factor bindend. In de afgelopen jaren bestaande methoden werden geduwd voor hun plafond of nieuwe technieken werden ontwikkeld voor steeds meer kleine startende bedragen van RNA sequencing. Dit vereist versterking van cDNA, die ruis of vooringenomenheid introduceert. Onlangs, unieke moleculaire identificatoren (UMIs) werden ontwikkeld om duplicaten geïntroduceerd door PCR experimenteel te identificeren. Onlangs, werd aangetoond dat UMIs net mild rangschikkend macht en valse ontdekking tarief voor differentiële gen expressie32 verbeteren. Niettemin overwegen gebruik te maken van unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMIs) voor alle sequencing bibliotheken te controleren voor de complexiteit van de bibliotheek, met name bij het starten met een lage hoeveelheid RNA en wanneer vele cycli van PCR nodig zijn.

Buffer en voorraadoplossingen: Alle buffers voor 4sU-seq en ribosoom profiling moeten bereid onder strikte RNase-vrij voorwaarden met behulp van de nuclease-gratis water. Het is aanbevolen om het kopen van pre-en-klare nuclease-vrije NaCl, Tris-HCl, EDTA, Natriumcitraat en water. Om ervoor te zorgen nuclease-vrij voorwaarden, kan een RNase decontaminating oplossing worden aangewend om pipetten of oppervlakken schoon te maken. Alle buffers voor ChIP-seq moeten ten minste DNase-vrij en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Altijd toevoegen proteaseinhibitors en, optioneel, phosphatase inhibitors vlak voor gebruik en houd op ijs.

Bio-informatica: Analyses op alle gegevens van de sequentie (d.w.z., ChIP-seq, RNA-seq en ribsosome profilering) omvat kwaliteitscontrole (bijvoorbeeldmet behulp van FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimmen (bijvoorbeeldmet cutadapt20) gevolgd door toewijzing aan het genoom van de referentie voor de cellen onder studie. Voor RNA-seq gegevens (zowel totaal en 4sU-seq), evenals ribosoom profilering van gegevens, is een afgesplitste RNA-seq mapper vereist, zoals ContextMap 221. ChIP-seq gegevens unspliced aanpassingen is met behulp van de BWA-MEM22 voldoende. Genexpressie kan worden berekend aan de hand van het RPKM model (leest per Kilobase van Exon per miljoen fragmenten toegewezen)1, nadat u hebt bepaald tellingen per gen met behulp van een programma, bijvoorbeeld featureCounts23te lezen. Piek bellen van ChIP-seq gegevens, een aantal programma's beschikbaar zijn, bijvoorbeeld, MACS24 of GEM25. Verder kunnen stroomafwaarts analyses worden uitgevoerd in R26, in het bijzonder het gebruik van hulpmiddelen die door de Bioconductor project27.

Hier is een grote uitdaging bij de integratie van 4sU- en totaal RNA-niveaus en translationeel activiteit van het ribosoom profilering normalisatie. Een klassieke benadering van dit probleem aan te pakken is om te normaliseren tot een niveau van huis-keeping genen. Verklein geluid ontstaat door willekeurige schommelingen voor individuele house-keeping genen en het wordt aanbevolen om niet alleen een paar huis-keeping genen te gebruiken maar mediaan niveaus voor een grotere reeks, bijvoorbeeld de > 3000 genen van de house-keeping samengestelddoor Eisenberg en Levanon28 . Tarieven voor de berekening van RNA omzet vanaf ratio's van 4sU-totale RNA, normalisatie is gebaseerd op gemiddelde omzet (bijvoorbeeld, ervan uitgaande dat een RNA halfwaardetijd van 5 h)29. Echter, aangezien dit geen algemene wijzigingen voor house-keeping genen veronderstelt, raden we analyse benaderingen onafhankelijk van normalisatie, zoalscorrelatie gebaseerde clustering van een tijd-serie van de verschillende gegevenstypen om groepen genen te identificeren met verschillende gedrag in de transcriptie en vertaling tijdens de activering. Voor een gedetailleerde beschrijving op bioinformatical integratie van de verschillende gegevenstypen verwijzen we naar de oorspronkelijke publicatie11.

Analyse van omzet tarieven en data integratie: Een onlangs gepubliceerd papier-33 , helft-leven bepaald door een multiplexed gene besturingselement (MGC) vergelijken met globale methoden kon tonen dat halfwaardetijd beste gecorreleerd met die welke verkregen door metabole labeling methoden vergeleken met andere methoden (bv algemene remming van de transcriptie door drugs). Echter, opgemerkt dat de verschillen tussen half-life berekeningen kunnen ontstaan en beschreven 15,34 zijn. We zijn goed voor de meeste van de problemen en de verschillen die zijn geïntroduceerd door de stressrespons als gevolg van langdurige 4sU blootstelling. Daarom is het onontbeerlijk om uit te sluiten van de stressrespons geïntroduceerd door de 4sU-labeling. Als u wilt verder valideren omzet tarieven, raden we het gebruik van MGCs.

Een gegevensset zoals die hier worden gegenereerd kunnen daarnaast ook worden gebruikt voor een meer integratieve data analyse (bijvoorbeeld, regulering van lang niet-coderende RNAs)35,36.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij bedanken Lars Dölken voor advies om 4sU labeling voor primaire T-cellen; Elisabeth Graf en Thomas Schwarzmayr voor kritische hulp in bibliotheek generaties en sequencing; Dirk Eick en Andrew Flatley voor het verstrekken van RNAPII en T cel antilichamen; N. Henriëtte Uhlenhaut en Franziska Greulich voor hulp bij de voorbereiding van de bibliotheek voor ChIP-seq; Caroline C. Friedel werd gesteund door subsidies FR2938/7-1 en CRC 1123 (Z2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher werd gesteund door de subsidie GL 870/1-1 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en het Duitse centrum voor Diabetes onderzoek (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Tags

Genetica kwestie 133 4-thiouridine ribosoom profiling ChIP-seq RNA-seq nieuw Getranscribeerd RNA genoom-brede RNA verwerking lamineren cotranscriptional splicing vertaling tarief Verwerkingsfrequentie transcriptie factor bindende
Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C.… More

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter