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Genetics

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

Abstract

활성화, 세포 급속 하 게 그들의 기능 프로그램 변경 및, 따라서, 그들의 유전자 식 프로필. 유전자 발현에 거 대 한 변화, 예를 들어 중 발생 세포 분화, morphogenesis, 고 기능 자극 (예: 면역 세포의 활성화), 또는 로컬 환경에서 약물 및 기타 요인에 노출 후. 자극 및 세포 유형에 따라 이러한 변경 내용을 신속 하 고 유전자 규칙의 모든 수준에서 발생합니다. 자극/약물의 특정 유형에 응답 셀의 모든 분자 프로세스 표시 분자 생물학에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 여기, 우리는 유전자 규칙의 여러 층의 동시 분석을 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리를 비교 하 여, 특히, 녹음 방송 요인 바인딩 (Chromatin-immunoprecipitation-시퀀싱 (칩 seq)), 드 노 보 전사 (4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq)), mRNA 처리, 및 회전율으로 번역 (리보솜 프로 파일링). 이러한 메서드를 결합 하 여 작업의 상세 하 고 게놈 넓은 과정 표시 가능 하다.

새로 베 껴 진된 RNA 시퀀싱 특히 좋습니다 빠르게 적응 또는이 (업 또는 downregulated 인지 여부)에 관계 없이 4sU 노출 시간 동안 모든 유전자의 transcriptional 활동을 묘사 하는 때문에, 시스템, 변화를 분석할 때. 총 RNA-seq와 리보솜 프로 파일링의 조합 사용은 또한 RNA 회전율 및 번역 요금 계산 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 결과 Bioinformatic 분석 분석 및 데이터의 해석에 대 한 많은 의미에 대 한 수 있습니다. 생성 된 데이터는 또한 co-transcriptional 및 대체 접합, 그냥 몇 가지 가능한 결과 언급을 추적 있습니다.

결합된 방법은 여기에 설명 된 다른 모형 유기 체 또는 세포 유형, 1 차 셀을 포함 하 여 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 품질 컨트롤을 포함 하 여 사용 하 고, 각 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 잠재적인 문제 및 함정을 토론.

Introduction

최근 몇 년 동안, RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석 하는 셀 또는 유기 체1내 모든 표현된 RNAs를 표준 도구가 되고있다. 그러나, 특정 자극/약물에 대 한 응답에 적응 하는 셀의 전체 프로세스를 이해 하려면 그것은 완벽 하 게 처리, 회전율, 및 번역 mRNA 전사에서 배열 하는 모든 기본 프로세스를 결정 하는 데 필요한. RNA 녹음 방송에 있는 단기적인 변화 거의 측정 될 수 있다 총 RNAseq에 의해 총 RNA의 변화 요인 예: RNA 반감기 그리고 transcriptional 활동에 따라 달라 집니다 이후는 세포의 적응을 반영을 위한 빈약한 서식 파일 환경 효과2,3. 사실, 다양 한 새로운 시퀀싱 기법 개발 되었다 유전자 규칙4 오른쪽 방식으로 결합 하는 과정에서 다른 단계에 대 한 분석을 허용 하는. 이 프로토콜 비교 방식에서 mRNA의 필수 레이어 규제를 추적 하도록 하는 일부 오히려 쉽게 적용 가능한 시퀀싱 기법을 결합 하는 방법을 설명 합니다. Transcriptional 활동을 분석 하기 위한 다양 한 방법 설명 되었습니다, 모자-진 식 (케이지)5, 네이티브 신장 사본 시퀀싱 (NET-seq)6및 게놈 넓은 핵 실행 (GRO-seq)7 의 분석 등 , 8로 bromouridine-시퀀싱 (Bru-seq) 및 4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq), 대사 산물을 사용 하는에 새로 통합은 복사할 RNA9,10, 그냥 몇 가지 언급. 케이지 정확한 전사 시작 사이트 식별, NET-seq와 촉진제-seq 방향, 독서에 대 한 더 정확한 정보 제공 및 4sU-seq (이 방법은 여기에 설명 된) 감지만 새로 동안 RNA를 복사할 수 있습니다. 그러나, 4sU-seq 매우 민감한 이며 적극적으로 변화 하는 mRNA 처리 (분 이내 발생)는 양적 변화 뿐 아니라 셀에 양적 transcriptional 활동 측정에 서로 다른 시간 프레임에 적용할 수 있는9, 11,12. 또한, 4sU-seq RNA 유전자9에 대 한 이직 률을 계산 하는 RNA-seq와 결합 이상적입니다. MRNA의 전사를 실시 하 여 RNA 중 합 효소 II (RNAPII), 녹음 방송 요인, 히스톤 수정 및 일반적인 활성/repressors 수는 transcriptional의 일부가 될 같은 다양 한 요인에 의해 영향에 복잡 한. 테스트 하려면 얼마나 많은 유전자/발기인/증강 지역 한 요인에 의해 묶여있다, 칩 seq는 개발 되었습니다는 지금 많은 상용 항 체13인이 목적에 대 한 표준 방법입니다. 그러나, 비록 ChIPseq 어디 바인딩 요소 규제에 대 한 명확한 정보를 제공, 그것은 반영 하지 않습니다 그것은 실제로 전사14에서 변화를 리드 하는 경우. 따라서, 4sU-seq와 함께 수행 하는 칩 seq 같은 생물학 질문에 대 한 이상적인 조합 이다. MRNA와 단백질 수준에 반드시15,16, 변환 또는 닢에 잠재적으로 중대 한 규칙을 나타내는 연관 하지 않습니다 이후 유전자 발현의 규칙 또한 이후 단계에서 발생할 수 있습니다. 수준, 상황에 따라입니다. 2011 년에 리보솜 프로 파일링 먼저 RNA-seq 결합 되었습니다 했다 하 고 지금 있기 때문에 여전히 일부 감도 한계 질량 분석17단백질, 급속 하 게 발생 하는 변화를 계량 하는 선택의 방법입니다. 실제로, 그런 방법에서 얻은 번역 요금 보였다 변화 단백질 수준 (적어도 장기적인 변화에 대 한 측정)에 상대적으로 좋은 견적을 제공 하 고 번역, 예를 들면 의 과정에 더 상세한 보기를 허용 하는 시작-측면 및 대체 번역의 결정17프레임. 모든 4 개의 방법의 조합 사용 다양 한 세포 유형 사이 정상 상태에서 사용할 수 있습니다 또는 시간 직렬에서11빠르게 변화 하는 셀 실험. 이 사용의 녹음 방송 요인 바인딩 RNA 전사, 처리, 및 번역에 영향을 미치는 변화 게놈 넓은 개요를 제공 합니다.

Protocol

모든 방법을 따라와 헬름홀츠 Zentrum 뮌헨 기관, 주, 그리고 연방 지침 준수에 있습니다.

1입니다. 준비

  1. 실험 설정 시간 일정 등의 자세한 계획 세포 배양 매체에 4sU를 추가 하 고 각 방법에 대 한 셀을 수확 하는 경우. 생물학 질문에 따라 신중 하 게 시간에 샘플 드로잉, 4sU 라벨 시간과 농도 (표 1)에 대 한 포인트를 고려 하십시오.
    참고: 4sU 세포 생존 능력에 미치는 영향을 확인 하 고 사전에 응답 스트레스 ("확인 최적의 4sU 라벨 조건" 대표 결과에 그림 1참조). 하나 이상의 샘플 각 방법의 예비 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다. RNA/DNA의 양과 품질 깊은 시퀀싱 (프로토콜 참조 전용 부품), 그리고 빠른 연습 하지만 실험 도중 셀의 부드러운 처리에 대 한 충분 한 인지를 확인 합니다.
  2. 각 방법의 모든 시간 지점에 필요한 셀의 수 계산 (표 2 참조 거친 추정에 대 한 기본 T 세포를 사용 하는 경우). 또한, 보다 그냥 4sU RNA (예를 들어, 그냥 시간 포인트 번역 요금 또는 RNA 매출 비율을 계산 해야에 대 한)의 총 RNA의 적은 샘플을 시퀀싱 고려 하십시오. 확인 하 고 (권장) 하는 결과의 의미를 확인, 생물 복제를 하나 이상 만듭니다.
    참고: 중요 한 것은, 모든 메서드 및 연속 시간 포인트, 샘플 되어야 합니다 셀의 동일한 시작 풀에서. 각 메서드에 대 한 하나 이상의 전용된 연구 것이 좋습니다.
  3. (예를 들어, aliquoted 4sU, cycloheximide, 포유류 세포의 용 해 버퍼, 그리고 1% 포름알데히드) 사전에 필요한 모든 것을 준비 합니다. 4sU의 추가, 후 하지 마십시오 노출 밝은 빛에 셀이 세포질 단백질184sU 표시 된 RNA의 가교를 이어질 수 있습니다.
  4. 치료 (그림 2) 직전 한 플라스 크에 대 한 관심의 모든 셀을 풀. 셀 (예를 들어는 hemocytometer 함께) 하 고 필요한 금액을 사용 하 여 각 방법의 치료 제어 (잊지 마세요 또한 4sU와 4sU-seq에 대 한 치료 컨트롤의 레이블을 지정). 남아 있는 세포를 치료 하 고 즉시 각 시간 포인트 및 방법에 대 한 셀의 필요한 수를 분할. 세포 온도 또는 CO2 레벨의 변경으로 인해 스트레스를 최소화 하기 위해 가능한 한 빨리 처리 합니다.
    참고: 예를 들어 샘플 촬영 1 시간, 2 시간, 3 h 치료 후, 다음 셀의 1/4은 치료 제어 사용, 그리고 3 분기 처리 제어에 사용 됩니다.

2. 4sU-라벨

참고:이 프로토콜은 Rädle에서 수정 외. 19 4sU와 대사 라벨에 관한 추가 정보에 대 한 그들의 프로토콜을 참조 하십시오. 모든 메서드 및 연속 시간 포인트에 대 한 샘플 셀의 동일한 시작 풀에서 생성 되어야 합니다.

  1. 라벨의 시작
    1. Aliquoted 4sU 사용 직전 녹여 추가 4sU 각 시간 지점에서 직접 관심의 세포를 포함 하는 매체 (참조 표 2 권장된 T 세포 숫자, 시간 포인트 당 최소 60 µ g RNA), 부드럽게, 혼합 하 고 다시는 인큐베이터. 4sU 남은 dispose (refreeze 하지 마십시오).
    2. 라벨의 끝에서 셀 (예를 들어, 셀 스 크레이 퍼)와 (는 높은 g 힘 저항) 폴 리 프로필 렌 튜브에 4 ° C에서 5 분 동안 330 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. 중간 발음 하 고 RNA 격리에 대 한 시 약을 추가 (≥1 mL 당 3 x 106 셀, 추천에 대 한 자료를 참조 하십시오 사용 하는) 각 관에. 완전히 resuspend 펠 릿 (3 x 106 셀 당 ≥1 mL), 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어 고-20 ° c.에 샘플을 동결 샘플은 적어도 1 달 동안-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
      주의: RNA 격리에 사용 되는 시 약은 피부 또는 눈 접촉 지 고 매우 위험한. 이러한 치료와 함께 처리 하 고. 의 안전 지침을 고려 하십시오
  2. RNA 격리 프로토콜 수정 RNA 준비를 사용 하 여
    1. RNA 분리 시 약 1 mL 당 0.2 mL 클로 프롬을 추가 하 고 철저 하 게 대사 라벨 프로토콜 (단계 1-12, 2에서에서 언급 한 대로 15 미 진행 동안 흔들어 혼합. RNA 준비를 사용 하 여 수정 trizol 프로토콜) Rädle 외에서. 19
    2. RNA 농도 측정 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라. 총 RNA-seq 뿐만 대 한이 RNA를 사용 하 여 (단계 3을 참조 하십시오. 총 RNA-seq) 또는 적어도 1 달 동안-80 ° C에서 저장.
  3. 새로 베 껴 진된 RNA의 thiol 전용 Biotinylation
    1. 총 세포질 RNA의 µ g 30-80으로 시작 합니다. 60 µ g RNA 새로 베 껴 진된 RNA의 충분 한 양을 얻을 수 있습니다.
    2. 라벨 반응 준비. 다음 순서에 따라 (µ g RNA) 당 피 펫: Biotinylation 버퍼, 7 µ RNA L x 1 µ L 10 (1 µ g nuclease 무료 H에 희석 한 RNA를 포함2O), 그리고 2 µ L biotin-HPDP (1 mg/mL). 마지막 biotin-HPDP를 추가 하 고 즉시 pipetting으로 혼합. 알루미늄 호 일 밝은 빛에 노출을 피하기 위해 튜브를 바꿈. Biotin-HPDP 대신에 대 한 토론을 참조 하십시오. 1.5 h 회전 RT에서 품 어.
    3. 원심 분리기 적절 한 2 mL 튜브 ( 재료의 표참조) 15000 x g 2 분에서 미리 냈 지 2 mL 튜브에 biotinylated RNA의 모든 플라스틱, 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 적극적으로 혼합. 2 품 어-3 분 단계 분리 하기 시작 때까지 및 거품이 사라질 시작 합니다.
    4. 4 ° c.에 15 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기 조심 스럽게 새 튜브로 위 수성 단계를 전송 합니다.
    5. 2.3.3 단계를 반복 합니다. 그리고 2.3.4입니다. 한 번. 수성 단계에 NaCl (5 M)의 볼륨 및 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨의 10%를 추가 합니다. 4 ° c.에 20 분 20000 x g에서 원심 분리기 상쾌한을 삭제 합니다.
    6. 동일한 볼륨 갓 준비 75% 에탄올을 추가 합니다. 20000 x g. 삭제는 상쾌한에 centrifuge, 짧게, 회전 하 고 나머지 에탄올을 제거 합니다. 30-100 µ L H2O (사용 1 µ L H2O 단계 2.3.1에서에서 1 µ g 입력된 RNA 당) 피 펫을 혼합 하 여 완전히 resuspend.
    7. 전기 이동 분석, RNA 무결성을 확인 하거나는 약 수를 받아 고 나중에 확인 합니다.
  4. 분리의 새로 변하게 (표시) 및 기존 (레이블된) RNA
    1. 4 ° C 저장에서 상자성 구슬 ( 재료의 표참조)를 제거 하 고 그것은 실내 온도에 그들을가지고 적어도 30 분 동안 서 보자. 65 ° c 열 4sU 세척 버퍼 (샘플 당 3 mL)
    2. 100 m m dithiothreitol (DTT) 솔루션을 준비 합니다. 초 미세 규모 DTT 무게 고 nuclease 무료 물의 필요한 금액을 추가 합니다. 항상 신선한 준비. 샘플 당 200 µ L을 사용 합니다.
    3. Biotinylated RNA 샘플 (1 µ g / µ L) 10 분을 변성 즉시 얼음에 65 ° C에가 열. Biotinylated RNA 100 µ L streptavidin 구슬을 추가 하 고 회전 15 분 RT에서 품 어.
    4. 적절 한 열을 배치 (권장 사항에 대 한 재료의 표 참조) 각 마그네틱 스탠드에 샘플 하 고 미리 1 mL 실내 온도 4sU 세척 버퍼 각 열을 equilibrate.
      참고:이 약 5-10 분 소요 됩니다. 열 중 하나는 5 분 후 배출 시작 하지, gloved 손가락으로 열 위에 살짝 누릅니다.
    5. 각 열의 중간에는 RNA/비즈 믹스를 적용 합니다. 레이블이 없는 RNA 복구할 필요가 하지 않는 흐름을 통해 삭제 합니다. 그렇다면, 적어도 첫 번째 세척을 통해 흐름을 수집 합니다. Rädle 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 RNA의 복구 수행 (단계 1-7, 7. 레이블이 없는, 언바운드 RNA의 복구)19.
    6. 0.9 mL RT 4sU 세척 버퍼, 0.9 mL 4sU 세척 버퍼 (단계 2.4.2에서에서 65 ° C로 preheated.)와 3 회 각각 씻어.
    7. 상자성 비즈를 사용 하 여 새로 베 껴 진된 RNA를 복구. 샘플 및 장소 각 열 아래 당 관에 잘 분산된 실시간 상자성 구슬의 400 µ L 플라스틱 100 µ L 100 mM DTT와 새로 베 껴 진된 RNA elute 3 분까지 기다립니다 고 100 µ L 100 mM DTT와 함께 두 번째 차입을 수행 합니다. (선택 사항: Rädle 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 차입 및 복구를 수행) 19
    8. 새로 믹스 피 펫 10 번을 혼합 하 여 RNA/비즈를 철저 하 게 문자 하 고 제조업체의 지침에 따라 진행 합니다. 11 µ L nuclease 무료에 RNA elute H2적합 한 fluorometer를 사용 하 여 O.Quantify RNA ( 재료의 표참조). RNA-80 ° C에 1 개월 이상 저장할 수 있습니다.
      참고: 새로 복사할 RNA를 사용할 수 있는 차세대 시퀀싱 cDNA 라이브러리를 준비 (사용 하는 키트에 대 한 제안에 대 한 테이블의 자료 를 참조) 또는 다운스트림 분석. 100-500 ng RNA는 대부분 라이브러리 준비 키트 (내용 참조)에 대 한 충분 한.

3. 총 RNA-Seq

  1. 직접 수정된 시를 사용 하 여 전체 RNA-seq를 RNA 격리 프로토콜에 대 한 RNA 준비 후 RNA를 표시 하는 4sU에서 RNA를 걸릴 (2.2.2 단계를 참조 하십시오.)
  2. 라이브러리 준비, 50-100 ng의 최종 농도에 RNA 약 수를 희석 / µ L. 새로 베 껴 진된 RNA의 라이브러리 준비에 관해서는 같은 키트를 사용 하 여. 100-500 ng RNA는 대부분 라이브러리 준비 키트에 대 한 충분 한.

4. 리보솜 프로 파일링

참고: 모든 메서드 및 연속 시간 포인트, 샘플 셀의 동일한 시작 풀에서 수 있어야 합니다. 추천 사용, 테이블의 자료를 참조 하는 키트에에 대 한.

  1. 준비 및 리보솜의 절연 보호 조각 (RPFs):
    1. 각 시간 지점에 대해 적절 한 양의 셀을 사용 하 여 (권장된 T 세포 번호 표 2 참조). 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로 cycloheximide와 부착 세포를 처리 합니다.
      주의: Cycloheximide은 매우 독성이 고 돌연변이 일으킬 수 있습니다. 피부 접촉 및 흡입 하지 마십시오.
    2. 수집 및 풀 비-또는 세미-adherent 셀 각 시간에서 하나의 폴 리 프로필 렌 튜브에 가리키고 셀 관련 매체 (예를 들어, T 세포에 대 한 보충된 RPMI)의 mL 당 1 x 106 셀을 최종 농도 조정 합니다. 0.1 mg/mL의 최종 농도와 cycloheximide를 추가 하 고, 폴 리 프로필 렌 튜브를 거꾸로 하 여 혼합 4 ° c.에 330 x g에 5 분 동안 원심 분리기 세포를 1 분에 대 한 품 어 중간 발음 하 고 적어도 10 mL PBS cycloheximide (0.1 mg/mL의 최종 농도)와 보충을 가진 세포를 씻어.
    3. 4 ° c.에 330 x g에 5 분 동안 원심 분리기 셀 중간 발음을 10 x 106 셀 당 100 µ L 포유류 세포 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 완전히 세포를 lyse 하 메 마른 22 25 게이지 바늘을 통해 추방.
    4. Precooled 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할. 정기적인 뒤집어와 얼음에 10 분 동안 품 어. 20000 x g는 lysate 명확 하 4 ° c에서 10 분 원심 분리기. Precooled 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.
    5. 준비 하는 1시 10분 희석 nuclease 무료 물과는 분 광 광도 계를 사용 하 여 레코드 A260독서 lysate의. Nuclease 무료 물을 사용 하 여 빈과 1시 10분으로 희석 포유류 세포 세포의 용 해 버퍼의 표준으로. 다음 방정식에 따르면 lysate의 A260/mL 농도 계산:
      (260 세포 lysate-260 포유류 세포의 용 해 버퍼) x 10 희석 요소 =260/mL
    6. 얼음은 lysate의 200 µ L aliquots를 만들고 nuclease 치료와 함께 진행 합니다.
      참고: 필요에 따라 준비 100 µ L aliquot 총 RNA에 대 한, 10% sds 10 µ L을 추가 하 고 혼합. 4 ° C에서 저장 하 고 4.3.2 진행. 총 4sU 표시 된 RNA에서 RNA를 사용 하는 것이 좋습니다 (3 단계를 참조 하십시오. 총 RNA-seq)입니다.
  2. 리보솜 프린팅
    1. 냉동은 lysate 없이 nuclease 치료를 즉시 수행 합니다. 각 A260 lysate의 7.5 단위의 nuclease (권장된 키트에 포함)를 추가 합니다. 예를 들면: 80 A260/mL lysate 0.2 mL x 7.5 U/A260nuclease lysate x 120 U nuclease =.
      참고: 필요에 따라, 제조 업체에 의해 설명 된 대로 소화 nuclease 적정 하십시오.
    2. 부드러운 혼합과 RT에서 45 분 nuclease 반응을 품 어. 액체 질소로 lysate의 200 µ L aliquots 고정 및-80 ° C에서 저장 또는 15 µ L RNase 억제제 aliquot, 각 200 µ L을 추가 하 여 nuclease 반응을 중지 하 고 단계 4.3.2 계속.
  3. RPFs의 정화
    1. 소화 nuclease RPFs의 한 샘플을 고정 하 고 15 µ L RNase 억제제를 추가 합니다. 얼음에 샘플을 유지.
    2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 RPFs 정화 (열 정화 권장)는 분 광 광도 계에 RNA 농도 측정 하 고.
  4. rRNA 고갈
    1. RRNA 고갈에 대 한 정화 RPFs의 5 µ g를 사용 합니다.
    2. RRNA 고갈에 대 한 제조 업체의 프로토콜 (1-2 단계, 기본 rRNA 고갈)를 따릅니다. RRNA의 측정 RNA 농도 분 광 광도 계에 RPFs를 고갈.
  5. RPFs의 페이지 정화
    1. RRNA의 사용 500 ng 페이지 정화에 대 한 RPFs를 고갈.
    2. 페이지 정화에 대 한 RNA 컨트롤, 예제 및 사다리를 준비 합니다. 믹스 5 µ L RNA 제어 및 5 µ L 변성 시키기 젤 0.5 mL microcentrifuge 튜브에 염료를 로드. 혼합 10 µ L 각 RPF의 젤 로드, 각각을 변성 시키기의 10 µ L로. Aliquot 사다리를 준비 (4 µ L 20/100 사다리, 1 µ L nuclease 무료 물, 그리고 5 µ L 변성 시키기 젤 로드 염료). 각 샘플 사이의 crosscontamination를 방지 하기 위해 제어 로드 됩니다.
    3. 5 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 샘플 및 사다리 denature 고 즉시 얼음에 놓습니다. 각 샘플의 20 µ L 로드 (필요에 따라, 10 µ L 및 동결 남은 20 ° C에서 샘플 로드) 12% 또는 15% 우 레 아-polyacrylamide 젤에 준비 된 사다리의 10 µ L로 구분. 10 µ L의 RNA 컨트롤을 로드 합니다. Bromophenol 블루 밴드 젤 (180 V, ~ 70 분)의 맨 아래에 도달할 때까지 젤을 실행 (그림 3).
    4. 4 ° c.에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 얼룩 RNA를 시각화 하기 위해 파란 빛을 방출 하는 다크 필드 transilluminator를 사용 합니다. 젤 조각 ~ 28 및 30에 해당 하는 각 샘플에 대 한 소비 세 길이 nt. 참조로 RNA를 장악 하 고 그것은 삭제할.
      참고: RPFs 거의 볼 수 있습니다. 샘플 표시 되지 않는 경우에 길이 28 및 30 nt의 두 oligos 포함-RNA 컨트롤에 의해 표시 된 크기에서 조각 삭제하시오
    5. 0.5 mL microcentrifuge 튜브의 하단에 구멍 살 균 20 게이지 바늘으로 찔린 합니다. 별도 튜브와 출장 장소 튜브 1.5 mL 튜브에서에 각 젤 슬라이스를 전송 합니다. G. 반복 원심 분리 젤 조각 1.5 mL 튜브에 완전히 조각 하지는 경우 x 12, 000에서 2 분 동안 원심 분리기.
    6. Elute RNA 방해 젤 조각 400 µ L nuclease 무료 물, 40 µ L 염화 아세테이트 (5 M), 및 2 µ L SDS (10%)에서 4 ° c.에 각 하룻밤
    7. 1 mL 피 펫 팁 (넓은 구멍 팁 또는 컷 끝 성가 1 mL 팁) 1.5 mL 필터 튜브 (권장된 키트와 함께 제공) 슬러리 전송. 2000 x g 분리에 3 분 동안 원심 분리기 eluted RNA 젤 조각에서. 부드럽게 1.5 mL 튜브에 용액을 플라스틱. 2 µ L glycogen (권장된 키트와 함께 제공)와 700 µ L 100% 소 프로 파 놀과 저장소 추가 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서.
    8. 20 분 13000 x g.에서 4 ° C에서 원심 취소 상쾌한. G. 삭제 상쾌한 x 13000에서 10 분 동안 4 ° C에서 미리 냉장된 갓된 80% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 건조. 20 µ L에서 각 샘플 및 8 µ L nuclease 무료 물에 RNA 컨트롤을 resuspend. 필요한 경우에-20 ° C에서 저장 합니다.
  6. 조각화, 최종 수리 3' 어댑터 결 찰, 반전 녹음 방송
    1. 제조 업체의 프로토콜 (조각화 및 최종 수리, 3' 어댑터 결 찰, 및 반전 녹음 방송)에서 설명한 대로 절차를 수행 합니다.
  7. CDNA의 페이지 정화
    1. 페이지 정화에 대 한 샘플, RNA 제어 및 사다리를 준비: 10 µ L를 각 샘플 및 RNA 제어의 믹스 10 µ L 염료를 각각 로드 하는 젤을 변성 시키기. Aliquot 사다리를 준비 (4 µ L 20/100 사다리, 1 µ L nuclease 무료 물, 5 µ L 젤 로드 염료를 변성 시키기). 각 샘플 사이의 crosscontamination를 방지 하기 위해 제어 로드 됩니다.
    2. 5 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 샘플 및 사다리 denature 고 즉시 얼음에 놓습니다. 각 샘플의 20 µ L 로드 (필요에 따라, 10 µ L 및 동결 남은 20 ° C에서 샘플 로드) 10 %polyacrylamide / 7-8 M 요소/TBE 젤에 준비 된 사다리의 10 µ L로 구분. 10 µ L의 RNA 컨트롤을 로드 합니다. Bromophenol 블루 젤 (180 V ~ 60 분) 완전히 마이그레이션합니다 때까지 젤을 실행 합니다.
    3. 4 ° c.에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 얼룩 RNA를 시각화 하 고 젤 조각 ~ 70-80 nt에 해당 하는 각 샘플에 대 한 소비 세를 파란 빛을 방출 하는 다크 필드 transilluminator를 사용 합니다.
    4. 4.5.8 4.5.5-단계에 설명 된 대로 진행 하 고 각 샘플 10 µ L nuclease 무료 물에서 resuspend.
  8. cDNA Circularization
    1. 얼음에 각 샘플에 대 한 다음과 같은 시 약을 결합 하 여 모든 반응에 대 한 충분 한 circularization 마스터 믹스를 준비: 4.0 µ L Circularization 반응 혼합, 2.0 µ L ATP, 2.0 µ L MnCl2및 2.0 µ L 리가.
    2. 각 샘플에 마스터 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 짧게 원심. 얼음에 샘플링 장소 즉시 2 h. 60 ° C에서 샘플을 품 어.
  9. PCR 증폭
    1. PCR 증폭에 대 한 제조 업체의 프로토콜 (1-3 단계, PCR 확대)을 따릅니다. 기본 T 세포에 대 한 9 PCR 사이클 확대를 위한 circularized cDNA의 4 µ L를 사용 하 여 최상의 결과 달성 하기 위해.
    2. 라이브러리를 정화 하 고 그들의 분포, 제조 업체의 프로토콜 (단계 4-8, PCR 확대)에 따라 확인. 증폭된 라이브러리의 예상된 크기는 140-160 bp ( 그림 4참조).
    3. 시퀀싱 라이브러리에 대 한 제조 업체의 프로토콜 및 추가 지침에 대 한 시퀀싱 기능을 참조 하십시오.

5입니다. 칩 Seq

참고:이 프로토콜은 고 넨 Blecher에서에서 수정 외. 14 그들의 프로토콜 칩 시퀀스에 관한 자세한 정보를 참조 하십시오 모든 메서드 및 연속 시간 포인트, 샘플 셀의 동일한 시작 풀에서 수 있어야 합니다.

  1. 가교와 셀 수확
    1. 셀 (권장된 T 세포 번호 표 2 참조) 각 시간 지점 cellspecific 매체는 (예를 들어, T 세포에 대 한 보충된 RPMI) 실 온에서 10 분에 1% 포름알데히드의 최종 농도와 Crosslink 적절 한 수 부드러운 락와. 0.125 M의 최종 농도에 글리신의 추가 의해 가교 반응을 중지 합니다.
    2. 4 ° c.에서 5 분 동안 330 x g에서 원심 분리기 세포 삭제는 상쾌한 고 얼음 처럼 차가운 PBS에 세포를 씻어. 단계 5.1.2를 두 번 반복 하 고 셀 알 약-80 ° c.에 동결 6 개월 이상 냉동된 펠 릿을 저장할 수 있습니다.
  2. 세포 세포의 용 해 및 쥡니다
    참고: 모든 세포 세포의 용 해 및 쥡니다 단계 동안 샘플 유지 되어야 한다 얼음에 또는 crosslink 반전 및 단백질 저하를 최소화 하 4 ° C에서.
    1. (인산 가수분해 효소 억제제를 선택적으로 추가) 하는 핵을 갓 추가 protease 억제제와 1 mL 얼음 세포 세포의 용 해 버퍼에 셀 펠 릿을 resuspend. 얼음에 4 ° c.에서 5 분 동안 2600 x g에서 원심 분리기 10 분 동안 품 어
    2. 상쾌한 발음 하 고 갓 추가 protease 억제제와 1 mL 얼음 핵 세포의 용 해 버퍼에서 핵 펠 릿 resuspend (선택적: 인산 가수분해 효소 억제제를 추가). 얼음에 10 분 동안 품 어. 0.2-1.0 kb의 의미 DNA 크기 일부 생성 하 셀 sonicate ( 그림 5참조).
      참고: 셀 형식을 최적화 하 고 더 쥡니다 조건 필요 조건 (예를 들어, 셀 번호, 볼륨, 및 버퍼). 기본 T 세포에 대 한 20-25 사이클 쥡니다 것이 좋습니다 (자세한 설명에 대 한 참조 자료).
    3. 20-50 µ L 깎인된 chromatin와 10 분 95 ° C에서와 1000 rpm을 빠른 역방향 crosslink 수행 chromatin 크기 확인을 떨고 열 aliquot 가져가 라. 2-5 µ L K 성분 추가 하 고 1000 rpm 떨고 56 ° C에서 20 분 동안 품 어. 95 ° C 및 1000 rpm 동요에서 10 분 동안 열 비활성화를 수행 합니다. 적절 한 키트 chromatin 정화 ( 재료의 표참조). 1 %agarose 젤에 chromatin 크기를 확인 하 고 100 bp 플러스 마커를 사용 하 여.
    4. 펠 렛의 불용 성 염색 질과 파편을 DNA 크기 분수 0.2-1.0 kb 20000 x g와 4 ° C에서 10 분의 평균으로 깎인된 chromatin 원심. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 얼음에 계속.
    5. 입력으로 sonicated chromatin의 5-10%를 유지. -20 ° C (단계 5.5.2에서에서 사용 하는)에 고정 합니다.
  3. 구슬에 몇 항 체
    1. 몇 10 µ g 항 체 (예, 안티-RNA Pol II; 안티 Histon H3K36me3) 220 µ L PBS에 (0.5% 0.5 %BSA 트윈 20) 80 µ L superparamagnetic 구슬 G 단백질 결합을 ( 재료의 표참조) 회전 실 온에서 1 시간 이상에 대 한.
    2. 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 자석에 바인딩된 구슬과 상쾌한 제거 될 때까지 기다립니다. 6 µ L 더 블록 sonicated 연어 정자 PBS에서 DNA (0.5% 0.5 %BSA 트윈 20) 회전 실 온에서 30 분.
    3. 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 구슬 자석에 바인딩됩니다 분명 상쾌한 제거 될 때까지 기다립니다. 칩 IP 버퍼와 구슬 세 번 씻어.
  4. Chromatin Immunoprecipitation
    1. 갓 추가 protease 억제제와 핵 세포의 용 해 버퍼에 1 mL 전체 볼륨 chromatin 희석 (필요에 따라 추가 인산 가수분해 효소 억제 물). 갓 추가 protease 억제제와 칩 IP 버퍼 추가 (필요한 경우 추가 인산 가수분해 효소 억제제) 3 mL의 최종 볼륨을. 항 체는 구슬에 결합 하는 동안 얼음에 또는 4 ° C에서 유지.
    2. 항 체를 희석된 chromatin 단계의 5.3.3 구슬을 결합 하 고 부드러운 회전 4 ° C에서 밤새 품 어를 추가 합니다.
    3. 회전 5 분 동안 실내 온도에 (1 mL를 각각 재료의 표참조) 다음 버퍼와 세척, 튜브 자석에 다시 놓고 상쾌한 제거: 워시 버퍼, 버퍼 2 차 세척, 세척 버퍼 III, 그리고 테 pH 8.0 x 2 각각.
    4. 상쾌한 무시 하 고 ~ 5 분에 대 한 건조.
  5. 가교 역
    1. 자석에서 샘플을 제거 합니다. 50 µ L 차입 버퍼를 추가 하 고 구슬에서 DNA 단백질 복합물을 elute를 pipetting으로 혼합.
    2. 앞으로이 단계에서 입력된 sample(s)을 포함 합니다. 추가 차입 버퍼 (버퍼 구성 유지 칩 샘플 비슷합니다)를 50 µ L의 최종 볼륨에 대 한 sample(s)를 입력 하 고 칩 샘플 함께 프로세스.
    3. 차입 버퍼와 RNase (DNase 무료)의 2 µ L의 믹스 3 µ L. 각 샘플을 믹스의 5 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
    4. 믹스 2.5 µ L 성분을 K, 1 µ L glycogen, 그리고 샘플 당 1.5 µ L 차입 버퍼. 각 샘플 (1 U 성분을 K 및 샘플 당 20 µ g glycogen)을 믹스의 5 µ L을 추가 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
    5. 역방향 가교 수행을 떨고와 65 ° C에서 하룻밤 (적어도 4 h) 샘플을 품 어.
    6. 적어도 30 s 및 전송에 대 한 자석에 튜브를 놓고 새로운 튜브에 상쾌한. 샘플 최대 12 개월 동안-20 ° C에서 동결 될 수 있습니다.
  6. DNA 정화
    1. 샘플 (2.3:1 비율)의 60 µ L를 잘 분산 된 상자성 구슬의 140 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 철저 하 게 혼합을 25 번 위아래 플라스틱. 각 관에 액체 동종 인지 확인 합니다. 2 분 4 분, 또는 때까지 모든 구슬 자석에 튜브 자석에 고는 상쾌한 폐기 장소에 대 한 실 온에서 품 어.
    2. 자석에 튜브를 두고 갓된 70% 에탄올의 200 µ L을 추가. 30에 대 한 튜브를 품 어 구슬 방해 하지 않고 s. 상쾌한 삭제 하 고이 단계를 한 번 더 반복. 에탄올을 완전히 발음 하 고는 상자성 구슬 4 분에 대 한 건조.
      참고: 불완전 한 에탄올 제거 수 있습니다 심각 하 게 DNA 복구 감소와 항복. 건조 한 펠 릿 건조까지만. -펠 릿 건조 DNA 복구 감소 하 고 얻을 수 있습니다.
    3. 자석에서 튜브를 제거 하 고 20 µ L 10 mM Tris HCl (pH 8.0)를 추가 합니다. 부드럽게 철저 하 게 혼합을 25 번 위아래로 전체 볼륨 플라스틱. 실 온에서 2 분 동안 품 어. 4 분에 대 한 자석에 다시 튜브를 놓고 다른 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.
    4. 적당 한 fluorometer와 DNA의 양을 측정 ( 재료의 표참조).
    5. 칩 정량 (정량에 대 한 100 µ l H2O와 사용 2-5 µ L에 희석 µ 1 L)에 의해 성공 했다 확인 하십시오. (관심사의 단백질의 알려진된 바인딩 사이트) 긍정 및 부정적인 컨트롤 (예:, 침묵은 관심사의 단백질의 목표는 아니지만 한 유전자)에 대 한 특정 뇌관을 사용 합니다.
      참고: 라이브러리 준비 2 수행할 수 있습니다 키트에 따라 칩 DNA의 ng (사용 하는 키트에 대 한 제안에 대 한 재료의 표 참조).

Representative Results

4 수 라벨: 최적의 확인 4 수 라벨 조건 (apoptosis, 핵 스트레스, 세포질 긴장), 시간, 및 농도: 4sU의 높은 수준의 생산 및 처리 rRNA의 억제 하 고 세포질로 핵 스트레스30유도 수 있습니다. 따라서, 관심사의 세포 apoptosis로 서 4sU을 이용한 스트레스 테스트 되어야 합니다. 서쪽 오 점 분석 시각화 p53 축적, 핵 스트레스를 나타내는 것이 좋습니다 세포질 스트레스와 형광 활성화 된 세포 apoptosis에 대 한 분석 (FACS) 정렬 표시 인-EIF2a 레벨을 증가. 높은 수준 및 4sU 또는 thapsigargin 또는 arsenite 같은 약물에 긴 노출 세포 스트레스를 유도 하기 위해 사용할 수 있습니다. Apoptosis 또는 세포 죽음을 유도, 세포 BH3I-1로 치료 했다 (500 ng / µ L) 또는 incubated 95 ° C (열 충격)에서 5 분. V/7-AAD 얼룩 annexin apoptotic (Annexin V)과 죽음 (7-AAD) 셀을 결정 하기 위해 사용 되었다. 500 µ M 4sU와 0.5 h에 대 한 기본 Th1 세포 생성 된 생체 외에서 의 라벨 (최종 농도) 또는 200 µ M 4sU와 함께 1 h도 유도 하는 세포 긴장의 표시도 apoptosis (그림 1)은 충분 한 4sU 설립 하지만 이어질.

RNA 라벨 시간 또한 단축 될 수 있다 (≤ 5 분) 이상에 비해 라벨 시간 시퀀스 intronic 짧은 증가를 리드. Co-transcriptional 접합 속도 시각화 하려면 4sU 라벨 시간 30 분 넘지 말아야 한다. 4sUlabeling에 대 한 자세한 내용은 Rädle 외를 참조 하십시오. 19

품질 관리: RNA 무결성은 매우 중요 때 RNA를 처리. 그것은 electrophoretical 분석에 의해 biotinylation 후 4sU 표시 된 RNA의 RNA 품질을 확인 하기 가장 편리한 ( 재료의 표참조). 총 RNA의 시퀀싱에 대 한 그것을 사용 하는 경우에 특히 단계 2.2.2에서 고립 된 RNA를 확인 하십시오. RNA 무결성 번호 (린) ≥8 추가 처리 (그림 3)에 대 한 RNA 무결성을 보장 해야 합니다.

Electrophoretical 분석은 또한 새로 베 껴 진된 RNA를 확인을 사용할 수 있습니다. 훨씬 덜 눈에 띄는 되 고 전형적인 rRNA 밴드와 함께 총 RNA에 비해 훨씬 덜 성숙 rRNAs 새로 베 껴 진된 RNA에 포함 되어 있음을 유의 하십시오.

리보솜 프로 파일링: cDNA 라이브러리의 PCR 증폭: cDNA 증폭 (단계 4.9.1) 좋은 시퀀싱 결과 보장 하기 위해 중요 한 단계입니다. Electrophoretical 분석에 의해 증폭 된 라이브러리를 분석 합니다. 증폭된 라이브러리의 좋은 샘플 보여줍니다 주위 피크 140-160 bp (그림 4A). 이합체 되어야 하는 어댑터의 과도 한 양의 피해 (그림 4B)와 제조 업체의 프로토콜 (PCR 제품의 정화 페이지)에 따라 페이지 정화 절차를 사용 하 여 이러한 샘플을 더 순화 될 한다. 너무 많은 템플릿 또는 너무 많은 PCR 주기 예상 보다 높은 분자량 밴드, 바탕색이 PCR 제품 및 어댑터 이합체 제품 (그림 4C)의 외관에 의해 특징-증폭 될 수 있습니다. 대부분의 샘플에 대 한 circularized cDNA의 1-5 µ L 및 확대를 위한 9 PCR 주기 올바른 PCR 제품의 충분 한 양의 얻을 것입니다 일반적으로.

칩: Chromatin 전단: 최적의 전단 조건 셀의 각 유형에 대 한 조정 될 필요가 있다. 사전에 전단 조건 (예를 들어, 사이클, 높은 또는 낮은 전력의 수)을 결정 합니다. 셀과 동일한 볼륨의 동일한 수를 사용 하 여 테스트 목적으로, 더 낮은 세포 밀도 전단 효율 증가 때문에. 이상-또는 아래-기울이기는 chromatin를 방지 하려고 합니다. 큰 chromatin 조각 극적으로 영향을 미칠 수 칩 결과 막힘, 여 고-전단 항 체에 의해 낮은 바인딩 효율성에 지도 하는 관심사의 단백질에 epitopes를 파괴할 수 있다. 이 실험에서 전단된 chromatin의 주요 분수 주위 1000 때 최상의 결과 달성 했다 혈압 또는 약간 낮은 (그림 5A).

정량 하 여 칩 확인: 시작 하기 전에 칩, 그것은 사용 된 항 체는 칩에 적합 테스트 하는 것이 좋습니다 (만약에 가능 하다 면, 칩 학년 항 체 사용) 칩 정량에 의해. 라이브러리 준비를 시작 하기 전에 정량 하 여 시퀀싱에 대 한 칩을 확인 (단계 5.6.5 참조). 관심사의 단백질의 알려진된 대상 사이트에 바인딩되는 뇌관 디자인. 유전자 내에서 정확한 대상 사이트를 알 수 없는 경우 여러 뇌관 쌍 유전자와 관련 된 규제 요소 검색에 사용할 수 있습니다. RNAPII 칩의 Th1 세포 Ifng, 대 한 어떤 transcriptionally 자극, 따라 upregulated 이며 말라 뇌관 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. Sox9 및 인슐린 역할을 부정적인 컨트롤 때문에이 유전자 Th1 세포 (그림 5B)에서 표현 되지 않는다. MRNA의 정량에 대 한 일반적으로 사용 되는 엑손에 걸친 프라이 머를 사용 하지 기억 하십시오. IgG 컨트롤 사용된 항 체의 특이성을 증명 하기 위해 사용할 수 있습니다. Immunoprecipitated DNA는 적당 한 fluorometer로 측정 될 수 있다 ( 재료의 표참조). IgG 컨트롤에서 바인딩된 nonspecifically DNA의 양은 해야 크게 낮은에 비해 수 DNA 금액의 항 체에 의해 구속.

복제: 생물학 중요성의 증거: 그것은 강력 하 게 셀 모든 치료 및 치료 샘플 (그림 2)는 동일한 id를 가질 수 있도록 셀의 동일한 수영장에서 시작 하는 모든 방법에 대 한 운동 실험을 수행 하 고 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 복제 (예를 들어, 정량, FACS 분석에 의해)을 샘플 비교 하 각 방법에 대 한 주요 시간 포인트의 작은 aliquots를 려는 것이 좋습니다. 이로써 거친 추정 두 복제에 대 한 치료 재현 되었고 시퀀싱으로 진행할 수 있습니다. 유효성 검사는 복제의 bioinformatical 분석을 통해 수행 되어야 한다. 결과의 재현성 복제 사이의 FPKM 값 사이 상관 관계 측면에서 평가 될 수 있다 고 점도 (그림 6)를 사용 하 여 시각.

Figure 1
그림 1: 세포 생리학을 perturbing 없이 최적의 4sU 라벨 조건 확인 (그림에서 Davari 외. 11)
FACS 분석에 의해 세포 apoptosis의 (A) 탐지: 시험관에 각각 생성 Th0 세포 0.5 h, 1 시간, 2 시간, (괄호 안에 표시) 4sU의 다른 농도로 치료 했다. BH3I-1 치료는 반면 열 충격 (95 ° C에서 5 분) 7-AAD에 의해 결정 하는 세포 죽음을 유도 하는 데 사용 되었다 Annexin V에 의해 결정 하는 apoptosis를 유도 하기 위해 사용 되었다. (B) 서쪽 오 점 분석 4sU의 p53에 대 한 치료 및 T 세포 활성화: 샘플 200 µ M 4sU 활성화, 0.5 h 시간 점은 500 µ M 4sU와 함께 표시 했다를 제외 하 고 지정 된 시간에 대 한 표시 했다. (C) 인 EIF2a 및 (B)와 같이 동일한 라벨 조건 활성화 Th1 세포에서 총 EIF2a의 서쪽 오 점 분석. Thapsigargin 긍정적인 제어로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 게놈 넓은 변화를 추적 하는 키네틱 설치의 개요 개요
이 제도 4sU-seq, 총 RNA-seq, 리보솜 프로 파일링 및 세포 치료 시 게놈 넓은 변화를 공부 하 칩 seq 결합에 대 한 설치 프로그램을 보여 줍니다. 세포를 풀 고 치료 컨트롤에 대 한 셀의 필요한 수를 따로. 나머지를 취급 하 고 각 방법 및 시간 요소에 대 한 분할. 설명 된 대로 4sU와 4sU-seq에 대 한 치료/치료 셀 라벨. 시간 점 및 각 메서드에 대 한 샘플 검사 되 고 특정 생물 학적 질문에 따라 달라 집니다. 각 시간 포인트 및 방법, 샘플 고 프로토콜의 전용된 부분을 따라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
4sU 표시 된 RNA의 그림 3: 품질 관리
총 RNA와 RNA 활성화 Th1 세포에서 얻은 biotinylated는 Bioanalyzer에 분석 되었다. 18S rRNA와 28S rRNA 표시 되 고 RNA 무결성 번호 (린) RNA의 무결성을 확인 하는 계기에 의해 주어진 다. 린 ≥8 RNA 무결성을 보장 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Bioanalyzer 프로 파일 라이브러리를 프로 파일링 하는 리보솜의
(A) A 좋은 라이브러리: 샘플 예상된 크기 범위 (혈압 140-160)에 피크를 표시 하 고 아니 더 정화가 필요 하다. (B)이이 샘플 보여 과도 한 어댑터 이합체 증폭된 제품 (120 bp) 원하는 제품 (혈압 140-160)를 기준으로. 이 라이브러리는 더 정화를 필요합니다. (C)-증폭 된 샘플: 예상 보다 높은 분자량 봉우리와 바탕색이 PCR amplicons (화살표로 표시) 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 최적의 chromatin 크기 전단 및 칩의 정량 확인 후
(A) Agarose 젤 그림 25 주기는 sonicator에 대 한 전단 및 정화 하기 전에 프로토콜에 설명 된 대로 세 가지 샘플에서 깎인된 chromatin의 최적의 조각 크기를 보여 줍니다. (B) 총 RNAPII 칩 (안티-RNA Pol II, 8WG16, ab817)의 Q-PCR 결과 입력의 백분율로 표현 됩니다. Sox9 와 인슐린 부정적인 컨트롤 (두 유전자 활성화 Th1 세포에 표현 되지 않는다)는 Ifng 와 말라 뇌관 긍정적으로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 생물의 비교 복제 (Davari 그 외 여러분 에서 그림 11)
식 값 (FPKM) 사이 비교 하는 대표적인 점도 활성화 Th1 세포의 자극 후 새로 베낀된 (4sU) RNA 4 h의 복제 합니다. 녹색 라인 같은 FPKM 값을 나타냅니다 그리고 순위 상관 관계 각 플롯에 표시 됩니다.

기간 (분) 라벨 권장된 4sU 농도 (µ M)
120 100-200
60 200-500
15-30 500-1000
< 10 500-2000

표 1: 권장 4sU 농도 (Rädle에서 외. 19)
권장된 4sU 농도의 범위는 라벨의 다른 시간에 대 한 표시 됩니다.

메서드 휴대폰 번호 RNA의 금액
4sU 라벨 ≥2 10 x7 ≥60µg
리보솜 프로 파일링 ≥2 x107
칩 seq ≥2 10 x7 -3 x 107

표 2: 필요한 양의 기본 T 세포
각 방법에 대 한 필요한 기본 T 세포의 최소 양입니다. 다른 세포 유형을 사용 하 여 때 금액은 작을 수도 있습니다.

Discussion

유전자 규칙의 전체 과정을 분석 하는 것은 완전히 특정 자극 또는 치료에 대 한 응답에 세포질 적응을 이해 하는 데 필요한입니다. 총 RNA-seq 결합, 4sU-seq, 프로 파일링, 리보솜 그리고 다른 시간 지점에서 칩 seq 시간 유전자 규칙의 주요 프로세스에 대 한 포괄적인 분석을 지도 한다. 생물 학적 과정의 깊은 이해는 실험 설정으로 최적의 시간 포인트 정의 필요 합니다.

유전자 규칙을 공부 하는 방법을 빠르게 개선, 이후 이러한 프로토콜의 급속 한 변화에 적용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그들은 모든 종류의 셀에 기본 유전자 규제 메커니즘을 공부에 대 한 가장 중요 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리가 논의 일부 함정 사실 하나는이 메서드를 사용할 때 고려해 야 하.

셀: 셀 매우 실용적 이어야 하 고, 순도 세포 인구의 기본 격리 된 셀을 사용 하는 경우 (예를 들어, 기본 T 세포에 대 한 FACS 분석) 보장 되어야 한다. 조금 이라도 스트레스 세포 수 있습니다이 매우 민감한 시퀀싱 방법의 결과 영향을 미칠 및 새로 베낀 또는 번역 된 RNA의 양을 줄이는 고 시퀀싱 결과에 스트레스 반응의 원치 않는 정보. 작은 셀을이 프로토콜에 언급 된 원심 분리 속도 기본 T 세포에 최적화 되어 있습니다. 따라서, 셀 형식에 따라 속도 조정 합니다.

4 세포 생리학에 수 효과: 4sU 추가 시 세포질 생리학을 최소한의 섭 동을 확인 하기 위한 전술 옵션 외에 추가 및 추가 분석 수행할 수 있습니다, 셀 수는 제한 하는 경우에 특히. 세포 증식에 영향을 단순히 레이블 및 레이블 셀을 계산 하 여 셀의 2 배 시간을 확인 하 여 테스트할 수 있습니다. Nucleolar 스트레스 유도 수 또한 nucleolin와 핵의 면역 형광 염색을 통해 셀 형태를 분석 하 여 테스트할 수 있습니다. 추가로 4sU의 영향을 확인, 변경 된 글로벌 유전자 발현 레이블이 없는 총 RNA를 레이블이 총 RNA에서 카운트를 읽는 연관 하 여 측정 될 수 있는.

휴대폰 번호: T 세포에서 생체 외에서 생성 된 표 2에 표시 된 셀의 금액 이상으로 시작 하는 것이 좋습니다. 셀 유형 방법 당 충분 한 숫자를 선택 합니다. 이후 T 세포 적은 세포질 RNA를 다른 세포에 비해, 다른 셀의 가장 가능성이 낮은 금액 적절 한 될 것입니다. 칩 seq에 대 한 셀 숫자 매우 사용 하는 항 체 및 세포 내에 관심사의 단백질의 표현 수준에 따라 다릅니다. 히스톤, RNAPII 칩에 대 한 fewe 셀 사용할 수 있습니다, 반면 셀 숫자 증가 녹음 방송 요인 사용 됩니다 때, 그들은 낮은 수준에서 표현 하는 경우에 특히 필요.

4 수 라벨 및 RNA biotinylation: 부착 세포를 사용할 때 4sU 라벨 감독이 할 수 Rädle 외에 설명 된 대로. 19 셀 매우 빠르게 통합 4sU, 이후 그것은 추가할 수 있습니다 서 스 펜 션, 부착, 또는 반 부착 세포의 매체에 직접.

RNA의 60-80 µ g는 biotinylation 시작 하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 낮은 양의 RNA 사용할 수 있는, 우리가 30 미만 테스트 하지 않았다 비록 µ g. 추가 (예:GlycoBlue)에 coprecipitant 때 펠 릿은 보기 힘들 경우 RNA를 계기. 더 피 외. 그 methylthiosulfonate 활성화 비오 틴 (biotin MTS) HPDP-biotin31보다 4sU 표시 된 RNA와 보다 효율적으로 반응 또한 나타났습니다. 따라서, 그것은 하는 경향이 (더 피 외.; 참조 4sU 표시 된 RNA의 정화에 의해 언급 하는 biotinylation 프로토콜을 참조 하십시오 적은 uridine 잔류물, 작은 RNAs의 복구에 대 한 특히, MTS-biotin, 전환 고려 가치가 있을 수도 있습니다. 실험 절차)입니다.

새로 베 껴 진된 RNA의 복구, 상자성 구슬 또는 당신의 선택의 RNA 정리 구슬 사용 가능 하다. 항상 고려이 키트 또는 특정 RNAs에 대 한 정화 하지 않을 수 있습니다. 예를 들어 당신이 miRNAs에 관심이 있다면, 미르 캡처 및 시퀀싱에 대 한 특정 키트를 사용 하십시오.

새로 베 껴 진된 RNA의 정량화: 새로 베 껴 진된 RNA는 정확 하 게 계량, 측정은 적당 한 fluorometer에 의해 수행 되어야 합니다 ( 재료의 표참조). 4sU 노출의 1 시간, 내 새로 베 껴 진된 RNA 총 RNA의 약 1-4%를 나타냅니다. 1 h 표시의 새로 베 껴 진된 RNA, 활성화 된 T 세포의 rRNA11~ 90-94% 이루어져 있다.

리보솜 프로 파일링: 방법 때, 우리는 적절 한 소화를 보장 보다 원래 프로토콜에 제안 된 nuclease 금액 x 1.5를 사용 하 여 결정. 또한, 아무 부작용 높은 양의 nuclease에 대 한 보고 되었습니다. 꽤 어려운 ribosomal 단백질에 의해 구속 하는 RNA의 일부인 동안에 RPFs를 overdigest 때문에, 최적의 nuclease 소화 적정 금액을 여전히 약간 높일 수 있습니다.

만약 500 ng RPF RNA의 단계 4.4.2에서에서 재기 되었다, rRNA 고갈 및 수영장 정화 RPFs RNA 클린 & 집중-5 열 반복. 또는 젤 (4.5.6 단계)에서 RNA 차입 중 젤 (4.5.3 단계)에 서로와 수영장 젤 조각 2 개의 동일한 샘플을 로드 합니다.

가능한 한 단단히 28 및 30 nt 밴드에는 RPFs 젤에 절단 하는 것이 좋습니다. 이 rRNAs를 tRNAs는 나중에 라이브러리의 일부가 되 고 당신의 RPFs에 대 한 시퀀싱 읽기를 줄일 것입니다 원치 않는 파편을 제거에 도움이 됩니다.

그것은 또한 UV 젤 정화 동안 빛을 피하기 위해 권장 됩니다. 닉스는 RNA 조각으로 pyrimidine 이합체, 그 끝에 심하게 라이브러리 준비 및 시퀀싱 결과 영향을 미칠 수 있습니다 만들 수 있습니다이.

라이브러리 준비 및 데이터의 연속: 프로토콜을 프로 파일링 하는 리보솜 시퀀싱에 대 한 적합 한 cDNA 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 샘플 4sU 라벨에 의해 생성 된 모든 적절 한 RNA 시퀀싱 키트 라이브러리 준비를 위해 직접 사용할 수 있습니다. 이후 새로 베 껴 진된 RNA, 특히 때 짧은 사용 시간, 라벨 수 있습니다 아직 polyadenylated, 아니 폴 리 A 선택 수행 되어야 한다. 대신, 우리는 좋습니다 rRNA 고갈 방지 하기 위해 실제 샘플에 대 한 시퀀싱 깊이 감소. T 세포를 사용 하 여, 우리는 400 수행 (키트, 참조 자료), 따라 새로 베 껴 진 고 총 RNA의 ng rRNA 고갈 시작 하 고 PCR 바이어스를 최소화 하기 위해 PCR 확대 주기를 감소. 라이브러리 준비는 더 적은 시작 물자로 수행할 수 있습니다. PCR의 라이브러리 복잡 한 숫자에 대 한 계정에 최적화 되어야 합니다.

칩 seq에 또한 있다 많은 키트 라이브러리 준비에 사용할 수 있는. 우리 손으로 도서관에서 준비 일 잘 2 시작 칩 DNA의 ng (사용 하는 키트에 대 한 제안에 대 한 자료 참조). 시퀀싱 하는 동안 색상 균형에 대 한 인덱스를 확인 해야 합니다. 4sU-seq, 총 RNA-seq, 및 칩 seq 샘플, 각 106 읽기 x ≥40 x 106 읽기 리보솜 샘플 프로 파일링에 대 한 ≥80의 시퀀싱 깊이 좋습니다. 시퀀싱 깊이 샘플 및 다운스트림 생물 정보학 분석에 의존 하 고 신중 하 게 고려해 야 합니다. Cotranscriptional 접합, 100 intronic 읽기를 분석 하 bp 쌍-엔드 시퀀싱 선택 될 필요가 있다.

바이어스 시퀀싱: 전사, 번역, 또는 녹음 방송 요인 바인딩 글로벌 변화를 결정할 때 시퀀싱 금 되고있다. 최근 몇 년 동안, 내 기존의 방법 그들의 한계를 밀어 했다 또는 새로운 기술을 점점 시작의 소량 RNA 시퀀싱을 위해 개발 되었다. 잡음 또는 편견을 소개 하는 cDNA 증폭을 해야 합니다. 최근, 독특한 분자 식별자 (Umi) 실험적으로 PCR에 의해 도입 된 중복을 식별 하기 위해 개발 되었다. 최근, Umi를 그냥 약간 전원 시퀀싱 및 차동 진 식32거짓 검색 속도 개선 보였다. 그럼에도 불구 하 고, RNA의 낮은 금액으로 시작 하는 때에 특히 그리고 많은 PCR 주기 필요한 모든 시퀀싱 라이브러리 라이브러리 복잡성에 대 한 제어를 위한 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하 여 고려 하십시오.

버퍼 및 재고 솔루션: 4sU-seq와 리보솜 프로 파일링에 대 한 모든 버퍼 nuclease 무료 물을 사용 하 여 엄격한 RNase 없는 조건 하에서 준비 되어야 한다. 미리 만든된 nuclease 무료 NaCl, Tris HCl, EDTA, 나트륨 구 연산 염과 물 구입 하는 것이 좋습니다. Nuclease 무료 조건을 보장 하기 위해, 펫 또는 표면 청소 RNase 오염을 솔루션을 사용할 수 있습니다. 칩 seq에 대 한 모든 버퍼 해야 적어도 DNase 무료 실내 온도에 저장 될 수 있다. 항상 protease 억제제와, 필요에 따라 사용 하기 바로 전에 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 하 고 얼음에 계속.

생물 정보학: (즉, 칩 seq, RNA-seq, 및 ribsosome 프로 파일링) 모든 시퀀싱 데이터 분석의 품질 관리를 포함 (예를 들어, FastQC를 사용 하 여 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), 어댑터 트리밍 (예를 들어, 함께 cutadapt20) 다음에 매핑 참조 게놈 연구에서 셀에 대 한. (총 및 4sU-seq), RNA-seq 데이터 뿐만 아니라 데이터를 프로 파일링 하는 리보솜, 접합된 RNA-seq 매퍼는 ContextMap 221등 필요 합니다. 칩 seq unspliced 데이터 정렬의 경우, BWA MEM22 를 사용 하 여 충분 하다. 유전자 발현은 유전자 프로그램, 예를 들면 featureCounts23을 사용 하 여 당 수를 읽고 확인 한 후 RPKM 모델 (Kilobase의 Exon 백만 조각 매핑 당 당 읽기)1을 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 하기 위한 피크 칩 seq 데이터, 프로그램의 수 있습니다, 예를 들어, 맥24 또는 보석25. 또한 다운스트림 분석 R26, 특히 Bioconductor 프로젝트27에서 제공 하는 도구를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

여기, 4sU 및 총 RNA 수준 및 리보솜 프로 파일링에서 변환 활동의 통합에 주요 도전은 정규화 이다. 이 문제를 해결 하기 위해 고전적인 방법은 집 유지 유전자의 수준에 정상화 하는 것입니다. 소음을 줄이기 위해 개별 집 유지 유전자에 대 한 임의의 변동으로 인해, 것이 좋습니다 아니라 더 큰 집합, 예를 들어 중간 수준 하지만 몇 집 유지 유전자를 사용 하는 > 3000 집 유지 유전자 아이젠 버그와 Levanon28에 의해 컴파일된 . 비율-에 4sU의 총 RNA, 정규화는 평균 매출 기반에서 RNA 이직 률의 계산에 대 한 요금 (예를 들어, 5 h의 RNA 반감기를 가정)29. 그러나,이 가정 집 유지 유전자에 대 한 전체 변경, 이후 좋습니다 정규화, 예, 상관 관계 기반 유전자의 그룹을 식별 하는 다른 데이터 형식의 시계열의 클러스터링의 독립적인 분석 방법을 사용 하 여 와 함께 전사 및 번역 활성화 중에 뚜렷한 동작입니다. 서로 다른 데이터 형식의 bioinformatical 통합에 대 한 자세한 설명에 대 한 우리는 원래 게시11를 참조 하십시오.

회전율 속도 데이터 통합의 분석: 최근에 출판 된 종이33 반감기 멀티플렉스 유전자 제어 (MGC)에 의해 결정 글로벌 방법 비교 반감기 (예를 들어, 다른 방법에 비해 대사 표기 방법으로 얻은 그 최고 상관을 보여줄 수 있는 일반의 금지 약물에 의해 전사)입니다. 그러나, 그것은 하프 라이프 계산 차이 발생할 수 있습니다 고 설명된 15,34되었습니다 언급 되어야 합니다. 우리는 대부분의 문제 및 장기 4sU 노출으로 인해 스트레스 반응에 의해 도입 된 차이점에 대 한 계정. 따라서, 4sU 라벨 도입 스트레스 응답을 제외에 없어서는 아니다. 이직 률을 추가 검증 하려면 MGCs 사용을 하는 것이 좋습니다.

또한, 데이터 집합으로 여기에 생성 된 더 통합 데이터 분석 (예를 들어, 긴 비 코딩 RNAs의 규칙)35,36또한 사용 될 수 있습니다.

Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

우리는 4sU 라벨 기본 T 세포;에 대 한 설정에 대 한 조언 라스 Dölken 감사 합니다. 엘리자베스 그라프와 토마스 Schwarzmayr에 대 한 중요 한 도움 라이브러리 세대와 시퀀싱; RNAPII 및 T 세포 항 체;를 제공 하기 위한 Eick와 앤드류 Flatley 더크 명. Henriette Uhlenhaut와 프란체스카 Greulich 칩 seq;에 대 한 라이브러리 준비에 대 한 도움 캐롤라인 C. 프리 델 FR2938/7-1 하 고 CRC 1123 (Z2)에서 도이치 가운데 (DFG); 교부 금에 의해 지원 되었다 Elke Glasmacher 부여 GL 870/1-1 독일 가운데 (DFG) 독일 센터에서 대 한 당뇨병 연구 (DZD), 헬름홀츠 Zentrum 뮌헨에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

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References

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유전학 문제 133 4 thiouridine 프로 파일링 칩 seq RNA-seq RNA 게놈 넓은 RNA 가공 접합 cotranscriptional 접합 번역 속도 회전 속도 새로 변하게 하는 리보솜 녹음 방송 요인 바인딩
바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석
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Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

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