Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.
Após a ativação, células alterar rapidamente os seus programas funcionais e, desse modo, seu perfil de expressão do gene. Grandes mudanças na expressão gênica ocorrem, por exemplo, durante a diferenciação celular, morfogênese e estimulação funcional (como a ativação de células do sistema imunológico), ou após a exposição a drogas e outros fatores do ambiente local. Dependendo do tipo de estímulo e célula, essas mudanças ocorrem rapidamente e em qualquer nível possível de regulação gênica. Exibir todos os processos moleculares de uma célula de resposta para um determinado tipo de estímulo/droga é uma das tarefas mais difíceis em biologia molecular. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise simultânea de múltiplas camadas de regulação gênica. Podemos comparar, em particular, fator de transcrição vinculação (cromatina-imunoprecipitação-sequenciamento (ChIP-seq)), transcrição de novo (4-thiouridine-sequenciamento (seq-4sU)), processamento de mRNA e volume de negócios, bem como tradução (Ribossoma criação de perfil). Combinando estes métodos, é possível exibir um curso detalhado e todo o genoma de ação.
Sequenciamento do RNA recém transcrito é especialmente recomendado quando analisando rapidamente adaptar ou alterar sistemas, desde que este retrata a atividade transcricional de genes de todos durante o tempo de exposição 4sU (independentemente se eles são acima – ou ativador). A utilização combinatória de RNA total-seq e perfilamento Ribossoma, além disso, permite o cálculo das taxas de rotatividade e tradução de RNA. Análise de Bioinformatic dos resultados do sequenciamento do elevado-throughput permite muitos meios para análise e interpretação dos dados. Os dados gerados também permite rastreamento co-transcriptional e alternativas emenda, só para mencionar alguns resultados possíveis.
A abordagem combinada descrita aqui pode ser aplicada para organismos modelo diferentes ou tipos de células, incluindo as células primárias. Além disso, podemos fornecer protocolos detalhados para cada método utilizado, incluindo controles de qualidade e discutir potenciais problemas e armadilhas.
Nos últimos anos, sequenciamento de RNA (RNA-seq) tornou-se a ferramenta padrão para analisar tudo expressas RNAs dentro de uma célula ou um organismo1. No entanto, para compreender todo o processo de adaptação em resposta a uma estímulo/droga específica de células, é necessário determinar completamente todos os processos subjacentes, variando de transcrição de mRNA para processamento, faturamento e tradução. A curto prazo alterações na transcrição do RNA dificilmente podem ser medidas por RNAseq total, desde que as alterações do RNA total dependem de fatores por exemplo, RNA meias-vidas e atividade transcricional, que são um modelo pobre para refletindo a adaptação de células para efeitos ambientais2,3. Com efeito, uma variedade de novas técnicas de sequenciamento foram desenvolvidos que permitem uma análise das diferentes etapas no processo de gene Regulamento4 quando combinados da maneira correta. Este protocolo descreve como combinar algumas técnicas de sequenciamento bastante facilmente aplicável que permitem o acompanhamento do Regulamento das camadas essenciais do mRNA de forma comparativa. Para analisar a atividade transcricional, uma variedade de métodos têm sido descritos, como Cap-análise do gene expressão (CAGE)5, alongamento nativo transcrição sequenciamento (NET-seq)6e todo o genoma nuclear pperigoso (GRO-seq)7 , 8, bem como bromouridine-sequenciamento (Bru-seq) e 4-thiouridine-sequenciamento (seq-4sU), que usam metabólitos que são incorporados no recém transcrito de RNA9,10, só para citar alguns. Enquanto gaiola identifica o local de início de transcrição exata, NET-seq e GRO-seq fornecem informações mais precisas sobre as direções de leitura e 4sU-seq (que é o método descrito aqui) detecta apenas recentemente transcrito de RNA. No entanto, 4sU-seq é altamente sensível e pode ser aplicado em diferentes períodos de tempo para medir a atividade transcricional quantitativa em ativamente mudando células, bem como alterações quantitativas no processamento de mRNA (que acontece em poucos minutos)9, 11,12. Além disso, 4sU-seq é ideal para combinar com o RNA-seq para calcular taxas de rotatividade de RNA para genes9. A transcrição do mRNA é realizada pela RNA polimerase II (RNAPII), que por sua vez é influenciado por uma multiplicidade de fatores, tais como fatores de transcrição, modificações do histone e ativadores/repressores gerais que pode até mesmo ser parte do transcriptional complexo. Para testar quantas regiões do gene/promotor/realçador obrigam-se em um fator, ChIP-seq desenvolveu-se, que agora é o método padrão para essa finalidade, devido a muitos anticorpos comercialmente disponíveis13. No entanto, apesar de ChIPseq dá informações claras sobre onde regulamenta fatores vincular, não reflete se ele realmente leva a alterações na transcrição14. Portanto, realizar ChIP-seq com 4sU-seq é a combinação ideal para tais questões biológicas. Regulação da expressão genética também pode ocorrer numa fase posterior, desde que os níveis de mRNA e proteína não se correlacionam necessariamente15,16, indicando Regulamento potencialmente significativo na translação ou borne-translational nível, dependendo do contexto. No ano de 2011, o ribossoma profiling tinha foram combinado pela primeira vez com RNA-seq e é agora o método de escolha para quantificar as mudanças que ocorrem rapidamente em proteínas, uma vez que ainda existem alguns limites de sensibilidade com espectrometria de massa17. Com efeito, taxas de conversão obtidas de tais métodos foram mostradas para fornecer uma estimativa relativamente bom de alterações nos níveis de proteína (medidas pelo menos para mudanças de longo prazo) e permitem uma visão mais detalhada sobre o processo de tradução, por exemplo, o determinação da tradução alternativa e iniciar-lado quadros17. A utilização combinatória de todos os quatro métodos podem ser usados em estado estacionário, entre vários tipos de células, ou em uma série de tempo experimentar de uma rápida mudança de cela11. Este uso fornece uma visão geral de todo o genoma de alterações na ligação do fator de transcrição influenciando RNA transcrição, processamento e tradução.
Analisar todo o processo de regulação gênica é necessário compreender plenamente as adaptações celulares em resposta a um estímulo ou tratamento. Combinando o RNA total-seq, seq-4sU, Ribossoma perfilamento e ChIP-seq em pontos diferentes do tempo leva a uma análise abrangente dos principais processos de regulação dos genes ao longo do tempo. Uma compreensão profunda dos processos biológicos é necessária para definir a configuração experimental, bem como os pontos de tempo ideal.
Desde métodos para estudar a regulação gênica melhorar rapidamente, estes protocolos podem ser adaptados para mudanças rápidas. No entanto, eles fornecem os métodos mais importantes para estudar os mecanismos de regulação genética básica em qualquer tipo de célula. Aqui, vamos discutir alguns dos fatos, deve-se considerar quando usando estes métodos e armadilhas.
Células: As células devem ser altamente viáveis e, se usando células isoladas primárias, pureza de populações de células deve ser garantida (por exemplo, análise de FACS para primárias células T). Células até mesmo um pouco estressadas podem influenciar os resultados desses métodos de sequenciamento muito sensível e diminuir a quantidade de RNA recém transcrito ou traduzido e levar a leituras indesejadas da resposta stress nos resultados do sequenciamento. A velocidade de centrifugação mencionada neste protocolo para células de Pelotas é otimizada para primárias células T. Assim, ajuste a velocidade de acordo com o tipo de célula.
4 sU efeitos na fisiologia celular: Além das opções acima para verificar a mínima perturbação de fisiologia celular sobre adição 4sU, análise adicional e/ou adicional pode ser executada, especialmente quando os números de celular são limitados. Efeitos sobre a proliferação celular podem ser testados por verificar o tempo de duplicação das células simplesmente contando células etiquetadas e sem rótulo. Indução de estresse nucleolar também poderia ser testada através da análise de morfologia celular através de mancha de nucleolin e núcleos da imunofluorescência. Para ainda mais verificar o impacto de 4sU, expressão gênica global alterado poderia ser medido pela correlação ler contagens de RNA total rotulado de RNA total sem rótulo.
Números de celular: Para em vitro gerado as células T, recomendamos começar pelo menos a quantidade de células indicado na tabela 2. Escolha números adequados por método de acordo com o tipo de células. Uma vez que as células T têm menos citoplasma e RNA em comparação com outras células, provavelmente menor quantidade de outras células será adequada. Para ChIP-seq, número de células altamente depende o anticorpo usado e o nível de expressão da proteína de interesse dentro das células. Para histona ou ChIP RNAPII, células fewe podem ser usadas, Considerando que o número de células precisa ser aumentada quando são utilizados fatores de transcrição, especialmente se eles são expressos em níveis baixos.
4 sU-rotulagem e RNA biotinylation: Ao usar células aderentes, 4sU rotulagem pode ser direcionado conforme descrito por Rädle et al. 19 desde 4sU muito rapidamente incorporar células, ele pode ser adicionado diretamente ao meio de suspensão, aderente ou células semi aderentes.
Recomenda-se iniciar o biotinylation com 60-80 µ g de RNA. No entanto, a menor quantidade de RNA pode ser usada, embora não testámos para menos de 30 µ g. adicionar uma coprecipitant (por exemplo, GlycoBlue) quando precipitação do RNA se o sedimento é difícil de ver. Duffy et al . demonstraram também que biotina methylthiosulfonate ativado (MTS-biotina) mais eficientemente reage com RNA 4sU-rotulado HPDP-biotina31. Por isso, valeria a pena pensando em mudar para MTS-biotina, em particular, para a recuperação de pequenos RNAs, que tendem a ter menos resíduos de uridina (referem-se ao protocolo biotinylation mencionado pela Sé de Duffy et al; purificação do RNA 4sU-rotulados, Procedimentos experimentais).
Para a recuperação do RNA recém transcrito, é possível usar grânulos paramagnéticos ou grânulos de limpeza de RNA de sua escolha. Sempre leve em conta que estes kits podem ou não podem purificar para RNAs específicos. Por exemplo, se você está interessado em miRNAs, considere o uso de jogos específicos para sequenciamento e captura de miRNA.
Quantificação do RNA recém transcrito: Para quantificar com precisão recentemente transcrito de RNA, medição deve ser realizada por um dados adequados (ver Tabela de materiais). Dentro de 1 h de exposição 4sU, recentemente transcrito de RNA representa cerca de 1-4% do RNA total. Recentemente transcrito de RNA de 1h rotulado, células T ativadas consiste em ~ 90-94% de rRNA11.
De perfil Ribossoma: Ao estabelecer o método, determinamos que usando 1,5 x a quantidade de nuclease do sugerido no protocolo original garante a boa digestão. Além disso, sem efeitos adversos têm sido relatados para quantidades elevadas de nuclease. Desde que é muito difícil para overdigest os RPFs enquanto eles são parte do RNA vinculado por proteínas ribossomais, ainda ligeiramente pode aumentar a quantidade para dosear a digestão de nuclease ideal.
Se inferior a 500 ng do RPF RNA foram recuperadas na etapa 4.4.2, repita a depleção de rRNA e piscina purificado RPFs com RNA Clean & concentrador-5 colunas. Em alternativa, carrega duas amostras idênticas ao lado uns aos outros sobre o gel (etapa 4.5.3) e fatias de gel de piscina durante a eluição de RNA do gel (etapa 4.5.6).
Recomendamos que os RPFs de corte em um gel tão firmemente quanto possível, para as bandas de nt 28 e 30. Isso ajuda na eliminação de fragmentos indesejados de rRNAs e tRNAs, que mais tarde tornar-se parte de sua biblioteca e reduzirá a leituras de sequenciamento para seus RPFs.
Também é aconselhável evitar a luz durante a purificação de gel UV. Isto pode criar nicks em fragmentos de RNA, os dímeros de pirimidina, que no final podem afetar severamente a biblioteca preparação e resultados de sequenciamento.
Preparação de biblioteca e sequenciamento de dados: Ribossoma protocolo de criação de perfil permite que para gerar uma biblioteca de cDNA apropriada para sequenciamento. Gerado pelo 4sU-rotulagem de amostras podem ser usadas diretamente para a preparação de biblioteca com qualquer kit de sequenciamento de RNA apropriado. Desde recentemente transcrito RNA, especialmente quando usando curto rotulagem vezes, pode ainda não estar polyadenylated, nenhuma seleção de poli-A deve ser realizada. Em vez disso, recomendamos a depleção de ARNr para evitar reduzir a profundidade de sequenciamento para a amostra real. Usando células-T, começamos com depleção de rRNA 400 ng de RNA total e recentemente transcrito (dependendo do kit, veja materiais), executada e reduzidos ciclos de amplificação por PCR minimizar o viés PCR. Preparação de biblioteca pode ser executada com menos matéria-prima. Conta para números de complexidade biblioteca de ciclos PCR deve ser otimizada.
Para ChIP-seq há também muitos kits disponíveis para preparação de biblioteca. Em nossa biblioteca de mãos preparação trabalhou bem, começando com 2 ng de DNA de ChIP (ver materiais para uma sugestão na qual kit de usar). Não se esqueça de verificar os índices para o equilíbrio de cor durante o sequenciamento. Recomendamos uma profundidade de sequenciamento de ≥ 40 x 106 lê cada para 4sU-seq, total RNA-seq e amostras de ChIP-seq e ≥ 80 x 106 leituras para Ribossoma amostras de criação de perfil. A profundidade de sequenciamento depende da amostra e a análise de Bioinformática a jusante e deve ser considerada cuidadosamente. Para analisar intrônicas leituras para a emenda cotranscriptional, 100 sequenciamento de bp emparelhado-final precisa ser escolhido.
Viés de sequenciamento: Sequenciamento tornou-se o padrão de ouro ao determinar mudanças globais na ligação do fator de transcrição, tradução ou transcrição. Em anos recentes, os métodos existentes foram empurrados para os seus limites ou novas técnicas foram desenvolvidas para cada vez mais pequenos montantes iniciais do RNA de sequenciamento. Isto requer amplificação do cDNA, que introduz ruído ou preconceito. Recentemente, identificadores exclusivos moleculares (UMIs) foram desenvolvidos para identificar experimentalmente duplicatas introduzidas pelo PCR. Recentemente, foi demonstrado que UMIs apenas ligeiramente melhorar o poder de sequenciamento e taxa de falsa descoberta de expressão diferencial do gene32. No entanto, considere usando identificadores exclusivos moleculares (UMIs) para todas as bibliotecas de sequenciamento de controle para a complexidade da biblioteca, especialmente quando começar com pequenas quantidades de RNA e quando são necessários muitos ciclos de PCR.
Buffer e soluções estoque: Todos os buffers para 4sU-seq e perfilamento Ribossoma devem ser preparados em condições rigorosas, RNase-livre usando água livre de nuclease. É recomendável comprar pre-feita livre de nuclease NaCl, Tris-HCl, EDTA, citrato de sódio e água. Para garantir condições de nuclease-livre, uma solução de RNase descontaminação pode ser usada para limpar superfícies ou pipetas. Todos os buffers para ChIP-seq precisam ser pelo menos livre de DNase e podem ser armazenados à temperatura ambiente. Sempre adicionar inibidores de protease e, opcionalmente, inibidores da fosfatase bem antes de usar e manter no gelo.
Bioinformática: Análise de todos os dados de sequenciamento (i.e., ChIP-seq, RNA-seq e criação de perfil ribsosome) envolve o controle de qualidade (por exemplo, usando FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), aparamento de adaptador (por exemplo, com cutadapt20) seguido de mapeamento para o genoma de referência para as células em estudo. Para dados de RNA-seq (total e seq-4sU), bem como dados de perfil de Ribossoma, um mapeador de RNA-seq emendado é necessário, tais como 2 ContextMap21. Para alinhamentos de dados unspliced ChIP-seq, usando BWA-MEM22 é suficiente. Expressão do gene pode ser calculada usando o modelo (leituras por quilobase do Exon por milhões de fragmentos mapeados) RPKM1, depois de determinar a ler contagens por gene usando um programa, por exemplo, featureCounts23. Para chamada de pico de dados ChIP-seq, uma série de programas está disponível, por exemplo, MACS24 ou GEM25. Mais análises a jusante podem ser executadas em R26, em particular, usando ferramentas fornecidas pelo projeto Bioconductor27.
Aqui, um grande desafio em integrar os níveis de RNA – 4sU e total e atividade translacional de perfilamento do ribossoma é a normalização. É uma abordagem clássica para resolver este problema para normalizar níveis de genes de manutenção da casa. Para reduzir o ruído devido a flutuações aleatórias de genes individuais de manutenção da casa, é recomendável usar não apenas alguns genes domésticas mas níveis medianos para um conjunto maior, por exemplo, a > 3.000 genes domésticas, compilados por Eisenberg e Levanon28 . Para o cálculo das taxas de rotatividade de RNA de rácios de 4sU-para que RNA total, normalização é baseado no volume de negócios médio de taxas (por exemplo, supondo que uma meia-vida do RNA de 5h)29. No entanto, já que isto supõe nenhuma alteração global para genes de manutenção da casa, recomendamos a utilização de abordagens de análise independente de normalização, por exemplo, de uma série de tempo dos tipos de dados diferentes para identificar grupos de genes de clustering baseado em correlação com comportamento distinto em transcrição e tradução durante a ativação. Para uma descrição detalhada sobre a integração de bioinformatical dos tipos de dados diferentes, consultar a publicação original11.
Análise de integração de dados e taxas de volume de negócios: Um artigo recentemente publicado33 comparando a meia-vida determinada por um controle de gene multiplexado (MGC) com métodos globais poderia mostrar que meias-vidas correlacionaram melhor com aqueles obtidos por métodos de rotulagem metabólicos em comparação com outros métodos (por exemplo, inibição geral da transcrição por drogas). No entanto, deve ser mencionado que as diferenças entre os cálculos de Half-Life podem surgir e tem sido descrito 15,34. Nós representam a maioria dos problemas e diferenças introduzidas pela resposta de estresse devido à exposição prolongada 4sU. Portanto, é indispensável para excluir a resposta ao stress introduzida por 4sU-rotulagem. Para validar ainda mais taxas de rotatividade, recomendamos o uso de MGCs.
Além disso, um conjunto de dados, conforme gerado aqui também poderia ser usado para um mais Integrativa dados análise (por exemplo, regulamento de tempo não-codificantes RNAs)35,36.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Lars Dölken para o Conselho para estabelecer 4sU rotulagem para primárias células T; Elisabeth Graf e Thomas Schwarzmayr pela crítica ajuda nas gerações de biblioteca e sequenciamento; Dirk Eick e Andrew Flatley para fornecimento de anticorpos RNAPII e células T; S. Henriette Uhlenhaut e Franziska Greulich para ajudar na preparação da biblioteca para ChIP-seq; Caroline C. Friedel foi apoiado por subsídios FR2938/7-1 e CRC 1123 (Z2) da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher foi apoiado pela subvenção GL 870/1-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e do centro alemão de pesquisa para Diabetes (DZD), Helmholtz Zentrum München.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |