ويصف هذا البروتوكول اندماجي استخدام رقاقة seq 4sU seq، وتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع والريبوسوم التنميط لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. فإنه يمكن تتبع التغييرات في النسخ-عامل ملزم، النسخ حيثياته وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، ودوران والترجمة على مر الزمن، وعرض مسار الأحداث عموما في الخلايا المنشط و/أو المتغيرة بسرعة.
عند التنشيط، تغيير الخلايا سريعاً على البرامج الفنية، ومن ثم صورتها التعبير الجيني. تحدث تغييرات هائلة في التعبير الجيني، على سبيل المثال، خلال التمايز الخلوي و morphogenesis والتحفيز الوظيفي (مثل تنشيط الخلايا المناعية)، أو بعد التعرض للمخدرات وعوامل أخرى من البيئة المحلية. اعتماداً على نوع التحفيز والخلية، هذه التغيرات تحدث بسرعة وعلى أي مستوى ممكن لتنظيم الجينات. عرض جميع العمليات الجزيئية للخلية المستجيبة لنوع معين من مدمني المخدرات التحفيز واحدة من أصعب المهام في البيولوجيا الجزيئية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يتيح التحليل المتزامن لطبقات متعددة من تنظيم الجينات. قارنا، على وجه الخصوص، عامل النسخ ملزمة (الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن-تسلسل (الرقائق-seq)) والنسخ دي نوفو (4-ثيوريديني-تسلسل (4sU-seq))، وتجهيز مرناً، ودوران، فضلا عن الترجمة (الريبوسوم إنشاء تشكيل جانبي). وبالجمع بين هذه الأساليب، من الممكن لعرض مسار عمل مفصلة والجينوم على نطاق المنظومة.
تسلسل الحمض النووي الريبي يدون حديثا ينصح خاصة عند تحليل سرعة تكييف أو تغيير الأنظمة، حيث يصور هذا النشاط الترانسكربتي من جميع الجينات خلال وقت التعرض 4sU (بغض النظر عما إذا كانوا حتى-أو دوونريجولاتيد). بالإضافة إلى ذلك يسمح اندماجي استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع والتنميط الريبوسوم في حساب معدلات الدوران وترجمة الرنا. ويتيح تحليل Bioinformatic نتائج التسلسل الفائق للعديد من الوسائل لتحليل وتفسير البيانات. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن أيضا تتبع الربط كوترانسكريبشونال والبديلة، اكتفى هنا بذكر عدد قليل من النتائج المحتملة.
يمكن تطبيق النهج الموحد المذكور هنا للكائنات نموذج مختلفة أو أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، ونحن توفير بروتوكولات مفصلة لكل أسلوب استخدامها، بما في ذلك عمليات مراقبة الجودة، ومناقشة المشاكل والمخاطر المحتملة.
في السنوات الأخيرة، أصبح الجيش الملكي النيبالي-تسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) أداة قياسية لتحليل الكشف عن جميع داخل خلية أو الكائن حي1. ومع ذلك، فهم العملية برمتها من الخلايا تكييف استجابة لحافز/دواء معين، من الضروري تماما تحديد جميع العمليات الأساسية، بدءاً من النسخ مرناً للتجهيز، والدوران، والترجمة. لا يكاد يمكن أن تقاس التغيرات القصيرة الأجل في الجيش الملكي النيبالي النسخ بإجمالي رناسيق، نظراً للتغييرات في الجيش الملكي النيبالي إجمالي تعتمد على عوامل مثل الحمض النووي الريبي نصف حياة ونشاط النسخي، التي قالب فقيرة لتعكس تكيف الخلايا إلى الآثار البيئية2،3. وفي الواقع، تم وضع مجموعة متنوعة من التقنيات الجديدة للتسلسل التي تسمح بإجراء تحليل لمختلف خطوات عملية الجينات اللائحة4 عندما تقترن بالطريقة الصحيحة. ويصف هذا البروتوكول كيفية الجمع بين بعض تسلسل يسهل تطبيقها بدلاً من التقنيات التي تسمح لتتبع تنظيم الطبقات الأساسية مرناً بطريقة نسبية. لتحليل النشاط الترانسكربتي، وقد وصف مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل كاب-تحليل الجينات التعبير (كيج)5، واستطالة الأصلية نسخة التسلسل (صافي-seq)6وعلى نطاق الجينوم النووي التحضير (غرو-seq)7 , 8، فضلا عن بروموريديني-تسلسل (Bru-seq) و 4-ثيوريديني-تسلسل (seq-4sU)، التي تستخدم نواتج الأيض التي أدرجت حديثا في نسخها من الجيش الملكي النيبالي9،10، فقط على سبيل المثال لا الحصر. القفص ويحدد موقع بدء النسخ الدقيقة، seq صافي وغرو seq تقديم معلومات أكثر دقة حول قراءة الاتجاهات ويكشف seq 4sU (وهي الطريقة الموضحة هنا) إلا حديثا نسخها الجيش الملكي النيبالي. مع ذلك، 4sU seq حساسة للغاية ويمكن أن تطبق في أطر زمنية مختلفة لقياس كمية النشاط النسخي في تغيير نشاط الخلايا، فضلا عن التغيرات الكمية في تجهيز مرناً (الذي يحدث في غضون دقائق)9، 11،12. وعلاوة على ذلك، 4sU seq مثالية للجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي لحساب معدلات دوران الحمض النووي الريبي للجينات9. يضطلع نسخ مرناً بالثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابيي)، التي بدورها تتأثر بالعديد من العوامل، مثل عوامل النسخ والتعديلات هيستون وتفعيل/ريبريسورس العامة حتى يمكن أن تكون جزءا من النسخي المعقدة. لاختبار كيفية العديد من الجينات/المروج/محسن مناطق مرتبطة بعامل واحد، وضعت رقاقة seq، الذي هو الآن الطريقة القياسية لهذا الغرض، بسبب العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجارياً13. ومع ذلك، على الرغم من أن تشيبسيق يعطي معلومات واضحة بشأن تنظيم العوامل حيث ربط، أنها لا تعكس إذا كان الفعل يؤدي إلى تغييرات في النسخ14. ولذلك، أداء رقاقة seq مع 4sU seq هو مزيج مثالي لمثل هذه المسائل البيولوجية. تنظيم التعبير الجيني يمكن أن يحدث أيضا في مرحلة لاحقة، نظراً لمستويات البروتين ومرناً لا ترتبط بالضرورة15،16، مشيراً إلى تنظيم كبير محتمل على متعدية أو بوستترانسلاشونال مستوى، تبعاً للسياق. في عام 2011، الريبوسوم التنميط أدمجت أولاً بتسلسل الحمض النووي الريبي، وهو الأسلوب المفضل لقياس التغيرات التي تحدث في سرعة في البروتين، حيث لا تزال هناك بعض حدود حساسية مع الطيف الكتلي17الآن. في الواقع، أظهرت أسعار الترجمة التي تم الحصول عليها من هذه الأساليب لتقديم تقدير جيد نسبيا للتغييرات في مستويات البروتين (على الأقل قياس التغيرات الطويلة الأجل) والسماح بطريقة عرض أكثر تفصيلاً في عملية الترجمة، مثلاً تحديد الترجمة الجانب ابدأ، والبديل إطارات17. استخدام جميع الأساليب الأربعة اندماجي يمكن استخدامها في حالة مستقرة، بين مختلف أنواع الخلايا، أو في وقت-مسلسل التجربة الخلايا المتغيرة بسرعة11. هذا الاستخدام لمحة عامة على نطاق الجينوم للتغييرات في ربط عامل النسخ التي تؤثر على الحمض النووي الريبي النسخ وتجهيزها، والترجمة.
تحليل العملية برمتها من تنظيم الجينات من الضروري أن نفهم تماما التكيفات الخلوية في استجابة لحافز معين أو العلاج. الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع، 4sU seq، الريبوسوم التنميط، ورقاقة-seq في نقاط زمنية مختلفة يؤدي إلى تحليل شامل للعمليات الرئيسية لتنظيم الجينات على مر الزمن. مطلوب فهم عميق للعمليات البيولوجية لتحديد الإعداد التجريبية، فضلا عن النقاط الزمنية المثلى.
منذ تحسين أساليب لدراسة تنظيم الجينات بسرعة، يمكن أن تكون هذه البروتوكولات تتكيف مع التغيرات السريعة. ومع ذلك فإنها توفر الأساليب الأكثر أهمية لدراسة آليات تنظيمية الجينات الأساسية في أي نوع من الخلايا. وهنا نحن نناقش بعض المزالق والوقائع التي يتعين على المرء أن ينظر عند استخدام هذه الأساليب.
الخلايا: يجب أن تكون الخلايا عالية قابلة للحياة، وإذا كان استخدام الخلايا الأولية المعزولة، يجب أن تضمن نقاء السكان خلية (مثلاً، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لخلايا تي الأولية). الخلايا حتى قليلاً وأكد يمكن أن تؤثر على النتائج من هذه الأساليب تسلسل حساسة جداً وخفض كمية الحمض النووي الريبي يدون أو المترجمة حديثا، ويؤدي إلى قراءات غير المرغوب فيها لاستجابة الإجهاد في نتائج التسلسل. هو الأمثل سرعة الطرد المركزي المشار إليها في هذا البروتوكول بيليه الخلايا لخلايا تي الأولية. وهكذا، ضبط سرعة حسب نوع الخلية.
4 آثار سو على فيزيولوجيا الخلية: بالإضافة إلى الخيارات المذكورة أعلاه للتحقق من الحد الأدنى من اضطراب للفيزيولوجيا الخلوية عند إضافة 4sU، يمكن إجراء تحليل آخر و/أو إضافية، لا سيما عندما تقتصر أرقام الخلية. ويمكن اختبار آثار على تكاثر الخلايا بالتحقق من الوقت مضاعفة الخلايا ببساطة عد الخلايا المسماة وغير المسماة. يمكن أيضا اختبار الإجهاد النوية التعريفي من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا عن طريق تلطيخ الفلورة نوكليولين ونوى. كذلك التحقق من تأثير 4sU، ويمكن قياس التعبير الجيني العالمي تغير بربط قراءة التهم من الحمض النووي الريبي المجموع المسمى بالجيش الملكي النيبالي إجمالي غير مسمى.
الخلية الأرقام: في المختبر إنشاء خلايا T، نوصي بدءاً على الأقل كمية الخلايا المشار إليها في الجدول 2. اختر أعدادا كافية من كل أسلوب حسب نوع الخلايا. نظراً للخلايا T أقل من السيتوبلازم والجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى، ستكون كافية على الأرجح مبالغ أقل من الخلايا الأخرى. لرقاقة-seq، تعتمد أرقام الخلية عاليا على جسم المستخدمة ومستوى التعبير من بروتين الاهتمام داخل الخلايا. هيستون أو “رقاقة رنابي”، يمكن استخدام خلايا فو، بينما أرقام الخلية بحاجة إلى زيادة عند استخدام عوامل النسخ، خاصة إذا كان يتم التعبير عنها عند مستويات منخفضة.
4 سو-وضع العلامات، والجيش الملكي النيبالي بيوتينيليشن: عند استخدام الخلايا ملتصقة، وسم 4sU يمكن توجيهها كما وصفها Rädle وآخرون. 19 منذ 4sU جداً سرعة دمج الخلايا، يمكن إضافته إلى وسيلة لتعليق أو ملتصقة أو الخلايا شبه ملتصقة مباشرة.
من المستحسن أن تبدأ في بيوتينيليشن مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، يمكن استخدام كميات أقل من الجيش الملكي النيبالي، على الرغم من أننا لا اختبار لأقل من 30 ميكروغرام. إضافة كوبريسيبيتانت (مثلاً، جليكوبلوي) عندما عجل الجيش الملكي النيبالي إذا كان من الصعب رؤية بيليه. دافي وآخرون أظهرت أيضا أن البيوتين تنشيط ميثيلثيوسولفوناتي (النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين) أكثر كفاءة يتفاعل مع الحمض النووي الريبي المسمى 4sU هبدب-البيوتين31. ومن ثم، قد يكون من المفيد النظر في التحول إلى النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين، على وجه الخصوص، لاسترداد الكشف الصغيرة، التي تميل إلى أن تكون أقل من المخلفات أردين (الرجوع إلى بروتوكول بيوتينيليشن ذكرها دافي وآخرون؛ انظر تنقية الحمض النووي الريبي المسمى 4sU، الإجراءات التجريبية).
لاسترداد رنا يدون حديثا، فمن الممكن استخدام الخرز باراماجنيتيك أو الخرز تنظيف الجيش الملكي النيبالي من اختيارك. تأخذ دائماً في الاعتبار أن هذه المجموعات قد أو قد لا تنقية للكشف محددة. على سبيل المثال، إذا كنت ترغب في ميرناس، النظر في استخدام مجموعات محددة لالتقاط ميرنا وتسلسلها.
التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا: لدقة قياس الحمض النووي الريبي يدون حديثا، القياس ينبغي أن يؤديها إلى فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). ضمن ح 1 من التعرض 4sU، رنا يدون حديثا يمثل حوالي 1-4% من مجموع الجيش الملكي النيبالي. رنا يدون حديثا من ح 1 المسمى، وتنشيط خلايا تي تتألف من ~ 90-94% من الرنا الريباسي11.
الريبوسوم التنميط: عند إنشاء الطريقة، عقدنا العزم أن استخدام 1.5 x مبلغ نوكلاس مما اقترح في البروتوكول الأصلي يضمن الهضم السليم. أيضا، أبلغ أي آثار سلبية لكميات مرتفعة من نوكلاس. نظراً لأنه من الصعب جداً أوفيرديجيست المفاضلة في حين أنهم جزء من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بالبروتينات ريبوسومال، يمكنك زيادة المبلغ الذي تيتراتي الهضم nuclease الأمثل لا يزال قليلاً.
إذا كان أقل من 500 نانوغرام من “الجبهة الوطنية الرواندية الجيش الملكي النيبالي” وعثر في خطوة 4.4.2، كرر استنزاف الرنا الريباسي وتجمع تنقية المفاضلة مع الحمض النووي الريبي نظيفة ومركزات-5 أعمدة. وبدلاً من ذلك، تحميل عينات مماثلة اثنين بجانب بعضهما البعض على الهلام (الخطوة 4.5.3) وتجمع جل الشرائح أثناء شطف الحمض النووي الريبي من الهلام (الخطوة 4.5.6).
ونحن نوصي بقطع المفاضلة على جل أحكام قدر الإمكان لعصابات nt 28 و 30. وهذا يساعد في إزالة الأجزاء غير المرغوب فيها من ررناس وترنس، التي سوف تصبح جزءا من المكتبة الخاصة بك وتقليل ما يلي تسلسل للمفاضلة الخاصة بك في وقت لاحق.
كما يوصي بتجنب ضوء أثناء تنقية هلام الأشعة فوق البنفسجية. هذا يمكنك إنشاء نيكس في الأجزاء رنا، فضلا عن dimers بيريميدين، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً شديدا على إعداد مكتبة وتسلسل النتائج في نهاية المطاف.
إعداد مكتبة وتسلسل البيانات: تمكن الريبوسوم التنميط بروتوكول لإنشاء مكتبة كدنا مناسبة للتسلسل. يمكن استخدام العينات التي تم إنشاؤها بواسطة العلامات 4sU مباشرة لإعداد مكتبة مع أي مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي المناسبة. منذ يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي، خاصة عند استخدام قصيرة وسم تايمز، قد لا تكون بوليادينيلاتيد، ينبغي إجراء لا بولي–مجموعة مختارة. بدلاً من ذلك، نوصي بشدة باستنفاد الرنا الريباسي للحيلولة دون تخفيض عمق التسلسل للعينة الفعلية. استخدام خلايا تي، بدأنا مع 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي يدون حديثا ومجموع (تبعاً لهذه المجموعة، انظر مواد)، يقوم الرنا الريباسي نضوب وانخفاض دورات للتضخيم PCR للتقليل من التحيز PCR. إعداد مكتبة يمكن أن يؤديها بأقل المواد البداية. ينبغي أن يكون الأمثل لحساب المكتبة تعقد أرقام دورات PCR.
لرقاقة seq هناك أيضا العديد من مجموعات المتاحة لإعداد المكتبة. في مكتبتنا أيدي عملت إعداد جيدا بدءاً من 2 نانوغرام من “رقاقة الحمض النووي” (انظر المواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم). يجب التأكد من مراجعة الأرقام القياسية لتوازن اللون أثناء تسلسل. ونحن نوصي بعمق تسلسل إيه فور زيرو × 106 يقرأ كل 4sU seq ومجموع الجيش الملكي النيبالي-seq، وعينات seq رقاقة، وإيه إيت زيرو × 106 ما يلي: الريبوسوم التنميط عينات. عمق التسلسل يعتمد على العينة وتحليل المتلقين للمعلومات المعلوماتية الحيوية وينبغي النظر بعناية. لتحليل ما يلي إينترونيك للربط كوترانسكريبشونال، 100 يحتاج bp إقران نهاية تسلسل يتم اختياره.
تسلسل التحيز: التسلسل أصبح معيار الذهب عند تحديد التغيرات العالمية في النسخ أو الترجمة أو النسخ عامل ملزم. في السنوات الأخيرة، تم دفعها من الأساليب القائمة على حدودها أو تم تطوير تقنيات جديدة لتسلسل مبالغ بداية صغيرة متزايدة من الجيش الملكي النيبالي. ويتطلب هذا تضخيم كدنا، الذي يدخل الضوضاء أو التحيز. في الآونة الأخيرة، وضعت معرفات فريدة الجزيئية (أميس) تجريبيا تحديد التكرارات عرضته PCR. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن أميس أقل ما يقال مجرد تحسين تسلسل السلطة، ومعدل اكتشاف كاذبة ل التعبير الجيني التفاضلي32. ومع ذلك، النظر في استخدام معرفات فريدة الجزيئية (أميس) لجميع المكتبات التسلسل لعنصر التحكم للمكتبة تعقد، خاصة عند البدء بكميات قليلة من الجيش الملكي النيبالي، وعندما تكون هناك حاجة العديد من دورات PCR.
المخزن المؤقت وحلول الأسهم: ويجب إعداد كافة المخازن المؤقتة ل 4sU seq والتنميط الريبوسوم تحت شروط صارمة خالية من رناسي استخدام مياه خالية من نوكلاس. من المستحسن لشراء مسبقة الصنع خالية نوكلاس كلوريد الصوديوم وتريس-HCl، يدتا، وسترات الصوديوم والماء. ولضمان ظروف خالية من نوكلاس، يمكن استخدام حلاً ديكونتاميناتينج رناسي لتنظيف الممصات أو الأسطح. كافة المخازن المؤقتة لرقاقة seq بحاجة إلى أن تكون على الأقل خالية من الدناز ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة. دائماً إضافة مثبطات البروتياز، واختيارياً، مثبطات الفوسفاتيز الحق قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد.
المعلوماتية الحيوية: تحليل جميع البيانات التسلسل (أي، seq رقاقة وتسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط ريبسوسومي) ينطوي على مراقبة الجودة (مثلاً، استخدام فاستقك، http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)، التشذيب المحول (مثلاً، مع كوتادابت20) متبوعاً برسم خرائط الجينوم مرجع الخلايا قيد الدراسة. لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (المجموع و 4sU seq)، فضلا عن الريبوسوم التنميط البيانات، مطلوب مخطط تسلسل الحمض النووي الريبي المقسمة، مثل 2 كونتيكستماب21. للتحالفات seq رقاقة البيانات أونسبليسيد، استخدام MEM التحالف22 كافية. يمكن حساب التعبير الجيني باستخدام نموذج (قراءة كل “كيلوبس إكسون” الواحدة ملايين الأجزاء المعينة) ربكم1، بعد تحديد قراءة التهم كل الجينات استخدام البرنامج، مثل فيتوريكونتس23. تتوفر لاستدعاء الذروة من البيانات seq رقاقة، عددا من البرامج، مثلاً، أجهزة ماكينتوش24 أو25من الأحجار الكريمة. كذلك يمكن إجراء تحليلات المصب في ص26، لا سيما باستخدام الأدوات التي توفرها المشاريع بيوكوندوكتور27.
هنا، تحديا كبيرا في دمج 4sU-ومجموع مستويات الحمض النووي الريبي والنشاط متعدية الجنسيات من الريبوسوم التنميط هو التطبيع. نهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة تطبيع لمستويات من البيت-حفظ الجينات. للحد من الضوضاء بسبب التقلبات العشوائية لحفظ البيت الجينات الفردية، من المستحسن أن ليس فقط استخدام قليلة البيت حفظ الجينات ولكن المستويات الوسطية لمجموعة أكبر، مثل > 3,000 البيت حفظ الجينات التي جمعتها أيزنبرغ وليفانون28 . لحساب معدلات دوران الجيش الملكي النيبالي من نسب 4sU-إلى مجموع الجيش الملكي النيبالي، التطبيع هو استناداً إلى معدل دوران متوسط معدلات (مثلاً، على افتراض نصف الجيش الملكي النيبالي من ح 5)29. بيد أن هذا يفترض لا التغييرات الشاملة لحفظ البيت الجينات، نوصي باستخدام نهج تحليل مستقل للتطبيع، مثلاً، تجميع لسلسلة زمنية من أنواع بيانات مختلفة لتحديد مجموعات من الجينات على أساس الارتباط مع السلوك متميزة في النسخ والترجمة أثناء التنشيط. للحصول على وصف مفصل في التكامل بيوينفورماتيكال لأنواع البيانات المختلفة، نشير إلى أن المنشور الأصلي11.
تحليل لتكامل البيانات ومعدلات الدوران: يمكن أن تظهر ورقة نشرت مؤخرا33 مقارنة نصف حياة مصممة بعنصر تحكم متعدد جينات (MGC) إلى الأساليب العالمية أن نصف العمر ارتباطاً أفضل مع تلك التي تم الحصول عليها بطرق وضع العلامات الاستقلابية مقارنة بالأساليب الأخرى (مثلاً، العامة تثبيط النسخ بالمخدرات). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الاختلافات بين حسابات نصف العمر يمكن أن تنشأ، وقد تم وصف 15،34. يمكننا حساب لمعظم المشاكل والخلافات التي يتم تقديمها بواسطة استجابة الإجهاد بسبب التعرض لفترات طويلة 4sU. ولذلك من الضروري استبعاد إجهاد استجابة عرض العلامات 4sU. للتحقق من صحة زيادة معدلات الدوران، نوصي باستخدام مجكس.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام مجموعة من البيانات كما تم إنشاؤه هنا لبيانات تحليل (مثلاً، تنظيم الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز)35،أكثر تكاملية36.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر لارس Dölken لتقديم المشورة وضع العلامات 4sU لخلايا تي الأولية؛ إليزابيث غراف، وتوماس شوارزماير لمساعدة حاسمة في مكتبة الأجيال وتسلسل؛ ديرك إيك وأندرو Flatley لتوفير الأجسام المضادة رنابي و T الخلية؛ أ. هنرييت أوهلينهاوت وال [فرنزيسكا Greulich للحصول على مساعدة في إعداد المكتبة لرقاقة-seq؛ وأيده كارولين جيم فريدل المنح FR2938/7-1 و CRC 1123 (Z2) من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG)؛ وأيد جلاسماتشير الكه المنحة GL 870/1-1 من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) والمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD)، ميونيخ Zentrum هلمهولتز.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |