Det här protokollet beskriver kombinatoriska användningen av ChIP-seq, 4sU-seq, totalt RNA-seq och Ribosomen profilering för cellinjer och primära celler. Det gör det möjligt för spåra ändringar i transkriptionsfaktor bindande, de novo transkription, RNA bearbetning, omsättning och översättning över tiden, och visar samlade händelseförloppet i aktiverat och/eller snabbt föränderliga celler.
Vid aktivering, celler snabbt ändrar sina funktionella program och därmed deras gen uttryck profil. Massiva förändringar i genuttryck uppstå, till exempel under celldifferentiering och morfogenes funktionella stimulering (t.ex. aktivering av immunceller), eller efter exponering för droger och andra faktorer från den lokala miljön. Beroende på stimulans och cellen kan sker dessa förändringar snabbt och på alla möjliga nivåer av genreglering. Visar alla molekylära processer cellkant svarar för en viss typ av stimulans/drogen är en av de svåraste uppgifterna i molekylärbiologi. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör samtidig analys av flera lager av genreglering. Vi jämför, i synnerhet transkriptionsfaktor bindande (kromatin-immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq)), de novo transkription (4-thiouridine-sekvensering (4sU-seq)), mRNA bearbetning, och omsättningen samt översättning (Ribosomen profilering). Genom att kombinera dessa metoder, är det möjligt att visa en detaljerad och genome-wide handlingsväg.
Sekvensering nyligen transkriberade RNA rekommenderas speciellt när man analyserar snabbt anpassa eller ändra system, eftersom detta skildrar transkriptionell aktiviteten av alla gener under 4sU exponeringstiden (oavsett om de är upp- eller nedreglerade). Kombinatoriska användning av totala RNA-seq och Ribosomen profilering tillåter dessutom beräkning av RNA omsättning och översättning. Bioinformatiska analyser av hög genomströmning sekvensering resultat möjliggör många hjälpmedel för analys och tolkning av data. Den genererade data kan också spåra co-transcriptional och alternativ splitsning, bara för att nämna några möjliga utfall.
Den kombinerade metoden som beskrivs här kan användas för olika modellorganismer eller celltyper, inklusive primära celler. Dessutom vi tillhandahåller detaljerade protokoll för varje metod som används, inklusive kvalitetskontroller, och diskutera potentiella problem och fallgropar.
Under de senaste åren har RNA-sekvensering (RNA-seq) blivit den standard verktyget för att analysera alla uttryckta RNAs inom en cell eller en organism1. För att förstå hela processen för celler anpassning som svar på en viss stimulus/medicin, är det dock nödvändigt att fullständigt bestämma alla underliggande processer, alltifrån mRNA transkription till bearbetning, omsättning och översättning. Kortsiktiga förändringar i RNA transkriptionen kan knappast mätas av totala RNAseq, eftersom ändringar av total-RNA beror på faktorer t.ex. RNA halveringstider och transkriptionell aktivitet, som är en dålig mall för reflekterande anpassning av celler för att miljöeffekter2,3. Faktiskt, en mängd nya sekvensering tekniker har utvecklats som gör en analys av de olika stegen i processen gen nr4 när de kombineras på rätt sätt. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar några ganska enkelt tillämpliga sekvensering metoder som tillåter spårning regleringen av väsentliga lager av mRNA i ett jämförande sätt. För att analysera transkriptionell aktivitet, en mängd metoder har beskrivits, såsom Cap-analys av gen uttryck (CAGE)5, infödda töjning avskrift sekvensering (NET-seq)6och genome-wide nuclear kör (GRO-seq)7 , 8, och bromouridine-sekvensering (Bru-seq) samt 4-thiouridine-sekvensering (4sU-seq), som använder metaboliter som ingår i nyligen transkriberade RNA9,10, bara för att nämna några. Medan bur identifierar exakt transkription start platsen, NET-seq och GRO-seq leverera mer exakt information om läsning riktningar och 4sU-seq (vilket är den metod som beskrivs här) identifierar endast nyligen transkriberade RNA. Men 4sU-seq är mycket känsliga och kan appliceras i olika tidsramar att mäta kvantitativa transkriptionell verksamhet aktivt förändra celler, samt kvantitativa förändringar i mRNA bearbetning (vilket händer inom minuter)9, 11,12. 4sU-seq är dessutom perfekt att kombinera med RNA-seq att beräkna RNA omsättning priser för gener9. Transkriptionen av mRNA utförs av RNA-polymeras II (RNAPII), som i sin tur påverkas av en mängd faktorer, såsom transkriptionsfaktorer, Histon modifieringar och allmänna aktivatorer/kvinnoförtryckarna som kan även vara en del av den transkriptionell komplexa. För att testa hur många gen/arrangören/förstärkare regioner är bundna av en faktor, har ChIP-seq utvecklats, vilket är nu standard metod för detta ändamål, på grund av många kommersiellt tillgängliga antikroppar13. Men även om ChIPseq ger tydlig information om där reglera faktorer bind, avspeglar inte om det verkligen leder till förändringar i transkription14. Därför är utför ChIP-seq med 4sU-seq en idealisk kombination för sådana biologiska frågor. Reglering av genuttryck kan också inträffa i ett senare skede, eftersom mRNA och protein nivåer inte nödvändigtvis korrelerar15,16, som visar potentiellt betydande förordning på translationell eller post-translationella nivå, beroende på sammanhanget. I år 2011, ribosom profilering först hade kombinerats med RNA-seq och är nu vald analysmetod att kvantifiera förändringar som sker snabbt i protein, eftersom det finns fortfarande vissa känslighet gränser med masspektrometri17. Faktiskt, översättning priser erhålls från sådana metoder har visat sig leverera en relativt god uppskattning av förändringar i proteinnivåer (åtminstone mätt för långsiktiga förändringar) och tillåta en ännu mer detaljerad vy på processen för översättning, e.g. de bestämning av start-sida och alternativa översättning ramar17. Kombinatoriska användningen av alla fyra metoderna kan användas i steady-state mellan olika celltyper, eller i en tid-följetong experimentera i en snabbt föränderlig cell11. Denna användning ger en genome-wide översikt över förändringar i transkription faktorn bindning påverkar RNA transkriptionen, bearbetning och översättning.
Analysera hela processen för genreglering är nödvändigt att fullt ut förstå cellulära anpassningar som svar på en viss stimulus eller behandling. Kombinera totalt RNA-seq, leder 4sU-seq, ribosom profilering och ChIP-seq vid olika tidpunkter till en omfattande analys av de viktigaste processerna för genreglering över tid. En djupgående förståelse för biologiska processer krävs för att definiera de experiment samt optimal tidpunkter.
Eftersom metoder för att studera genreglering förbättra snabbt, kan dessa protokoll anpassas till snabba förändringar. De ger dock de viktigaste metoderna för att studera grundläggande gen regleringsmekanismer i någon typ av cell. Här diskuterar vi några av de fallgropar och fakta måste man tänka på när man använder dessa metoder.
Celler: Cellerna måste vara mycket lönsamt och om använder primära isolerade celler, renhet av cellpopulationer måste garanteras (t.ex., FACS analys för primär T-celler). Ännu något stressade celler kan påverka resultaten av dessa mycket känsliga sekvenseringsmetoder och sänka mängden nyligen transkriberas eller översatt RNA, och leda till oönskade avläsning av stress svar i sekvensering resultaten. Den centrifugeringsvarvtal som nämns i detta protokoll till pellet celler är optimerad för primär T-celler. Således, justera hastigheten enligt celltypen.
4 sU effekter på cellfysiologi: Förutom ovannämnda alternativ för att verifiera minimal störning till cellulär fysiologi vid 4sU tillägg, kan ytterligare eller ytterligare analys utföras, särskilt när cell nummer är begränsade. Effekter på cell spridning kan testas genom att verifiera den fördubbling tid av celler genom att helt enkelt räkna märkta och omärkta celler. Nukleolära stress induktion kan också testas genom att analysera cellmorfologi via immunofluorescens färgning av nucleolin och kärnor. För att ytterligare verifiera effekterna av 4sU, kan förändrade globala genuttryck mätas genom att sammanföra läsa räknas från märkt total-RNA till namnlösa total-RNA.
Cell nummer: För in vitro- genererade T-celler rekommenderar vi att du börjar med minst mängden celler som anges i tabell 2. Välja lämpliga nummer per metod enligt vilken typ av celler. Eftersom T-celler har mindre cytoplasman och RNA jämfört med andra celler, blir sannolikt lägre mängder av andra celler tillräcklig. För ChIP-seq beroende cell nummer mycket antikroppen används och uttryck nivån av proteinet av intresse inom cellerna. För Histon eller RNAPII ChIP, kan fewe celler användas, medan cell nummer behöva ökas när transkriptionsfaktorer används, särskilt om de uttrycks på låga nivåer.
4 sU-märkning och RNA biotinylation: När du använder vidhäftande celler, kan 4sU märkning riktas som beskrivs av Rädle et al. 19 sedan celler mycket snabbt införliva 4sU, det kan läggas direkt till medlet av fjädring, anhängare eller semi vidhäftande celler.
Det rekommenderas att starta biotinylation med 60-80 µg av RNA. Dock lägre mängder av RNA kan användas, även om vi inte testa för mindre än 30 µg. lägga till en coprecipitant (t.ex., GlycoBlue) när utfällning RNA om pelleten är svårt att se. Duffy et al. har också visat att methylthiosulfonate-aktiverat biotin (MTS-biotin) reagerar mer effektivt med 4sU-märkt RNA än HPDP-biotin31. Därför kan det vara värt funderar på att byta till MTS-biotin, särskilt återvinning av små RNAs, som tenderar att ha färre uridin rester (se protokollet biotinylation nämns av Duffy et al.; se rening av 4sU-märkta RNA, Experimentella rutiner).
För återvinning av nyligen transkriberade RNA är det möjligt att använda paramagnetiska pärlor eller RNA Cleanup pärlor av ditt val. Ta alltid hänsyn till att dessa satser kan eller kan inte rena för specifika RNAs. Exempelvis om du är intresserad av MicroRNA, överväga att använda specifika kit för miRNA fånga och sekvensering.
Kvantifiering av nyligen transkriberade RNA: För att exakt kvantifiera nyligen transkriberade RNA, mätning bör utföras av en lämplig fluorometer (se Tabell för material). Inom 1 h av 4sU exponering representerar nyligen transkriberade RNA ca 1-4% av total-RNA. Nyligen transkriberade RNA på 1 h märkt, aktiverade T-celler består av ~ 90-94% av rRNA11.
Ribosomen profilering: När metoden ska vi fast beslutna att använda 1,5 x mängden nuclease än föreslog i den ursprungliga protokollet garanterar god uppslutning. Inga biverkningar har också rapporterats för förhöjda mängder nuclease. Eftersom det är ganska svårt att overdigest RPFs medan de är en del av RNA bunden av ribosomala proteiner, kan du fortfarande något öka beloppet att titrera optimal nuclease-nedbrytning.
Om mindre än 500 ng av RPF RNA återfanns i steg 4.4.2, upprepa rRNA utarmning och pool renats RPFs med RNA Clean & koncentrator-5 kolumner. Alternativt kan du ladda två identiska prover bredvid varandra på gel (steg 4.5.3) och pool gel skivor under RNA eluering från gelen (steg 4.5.6).
Vi rekommenderar att skära RPFs på en gel så tätt som möjligt till den 28 och 30 nt banden. Detta hjälper till att eliminera oönskade fragment från rRNAs och tRNAs, som senare kommer att bli en del av ditt bibliotek och minska sekvensering läsningar för din RPFs.
Det rekommenderas också att undvika UV-ljus under gel reningen. Detta kan skapa nicks i RNA fragment, as well as pyrimidin dimerer, som i slutändan kan allvarligt påverka bibliotek förberedelse och sekvensering resultat.
Bibliotek förberedelse och sekvensering av data: Ribosomen profilering protokoll gör det möjligt för att generera ett cDNA-bibliotek som är lämplig för sekvensering. Prover som genereras av 4sU-märkning kan användas direkt för bibliotek förberedelser med någon lämplig RNA-sekvensering kit. Sedan nyligen transkriberade RNA, särskilt när du använder kort märkning gånger, kanske ännu inte polyadenylated, bör inga poly-ett urval utföras. Istället rekommenderar vi starkt rRNA utarmning att förhindra att minska sekvensering djup för det riktiga provet. Med hjälp av T-celler, vi började med 400 ng nyligen transkriberas och totalt RNA (beroende på kit, se material), utförs rRNA utarmning och minskad cykler för PCR-amplifiering att minimera PCR bias. Bibliotek förberedelse kan utföras med mindre utgångsmaterial. För att beakta bibliotek komplexitet antalet PCR cykler bör optimeras.
För ChIP-seq finns det också många kits för bibliotek beredning. I våra händer bibliotek beredning arbetat väl börjar med 2 ng av ChIP DNA (se material för ett förslag på vilket kit du använder). Var noga med att kontrollera indexen för färgbalans under sekvenseringen. Vi rekommenderar sekvensering djup ≥40 x 106 läser varje för 4sU-seq, totalt RNA-seq, och ChIP-seq prover, och ≥80 x 106 läsningar för Ribosomen profilering prover. Sekvensering djupet beror på provet och nedströms bioinformatik analys och bör övervägas noga. För att analysera intronic läsningar för cotranscriptional skarvning, 100 måste bp Parade-end sekvensering väljas.
Sekvensering bias: Sekvensering blivit gold standard vid fastställandet av globala förändringar i transkription, översättning eller transkription faktorn bindande. Inom senare år, befintliga metoder drevs till sina gränser eller nya tekniker har utvecklats för sekvensering allt mindre utgångsbelopp RNA. Detta kräver förstärkning av cDNA, som introducerar buller eller bias. Nyligen, unika molekylära identifierare (UMIs) utvecklades för att experimentellt identifiera dubbletter som infördes genom PCR. Nyligen visades att UMIs bara milt förbättra sekvensering makt och falsk upptäckten hastighet för differentiell gen uttryck32. Emellertid överväga att använda unika molekylära identifierare (UMIs) för alla sekvensering bibliotek till kontroll för bibliotek komplexitet, speciellt när start med låga mängder RNA och när många PCR cykler behövs.
Buffert och stamlösningar: Alla buffertar för 4sU-seq och Ribosomen profilering måste förberedas strikta villkor RNase-fri med nuclease-gratis vatten. Det är rekommenderat att köpa färdiga nuclease-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumcitrat och vatten. För att säkerställa nuclease-fria villkor, kan ett RNase dekontaminering lösning användas för att rengöra pipetter eller ytor. Alla buffertar för ChIP-seq behöver vara minst DNAS-fri och kan förvaras i rumstemperatur. Alltid lägga till proteashämmare och, valfritt, fosfatas-hämmare just före användning och håll på is.
Bioinformatik: Analys av alla sekvensering data (d.v.s., ChIP-seq, RNA-seq och ribsosome profilering) innebär kvalitetskontroll (t.ex., med FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimning (t.ex., med cutadapt20) följt av mappning till referens genomet för cellerna under studien. För RNA-seq data (både totalt och 4sU-seq), samt Ribosomen profilering data, krävs en skarvade RNA-seq mapper, såsom ContextMap 221. För ChIP-seq data Osplitsat linjeföring är använda BWA-MEM22 tillräckligt. Genuttryck kan beräknas med RPKM modell (läsningar per Kilobase av Exon per miljoner fragment mappas)1, efter att fastställa Läs räknas per gen med hjälp av ett program, t.ex. featureCounts23. För peak kallelse från ChIP-seq data, det finns ett antal program, t.ex., Mac24 eller GEM25. Ytterligare kan nedströms analyserna utföras i R26, i synnerhet genom verktyg som tillhandahålls av det Bioconductor projekt27.
Här är en stor utmaning i att integrera 4sU- och total RNA-nivåer och translationell aktivitet från Ribosomen profilering normalisering. En klassisk metod att lösa detta problem är normalisera till nivåer av städning gener. För att minska buller på grund av slumpmässiga variationer för enskilda städning gener, det rekommenderas att inte bara använda några städning gener men medianvärdet nivåer för en större uppsättning, e.g. de > 3.000 städning gener sammanställd av Eisenberg och Italine28 . För beräkning av RNA omsättning från nyckeltal av 4sU-till total-RNA, normalisering är baserad på median omsättning priser (t.ex., förutsatt att en RNA halveringstid på 5 h)29. Men eftersom detta förutsätter inga övergripande förändringar för städning gener, rekommenderar vi använda analys metoder oberoende av normalisering, t.ex., korrelation-baserad klustring av en tidsserier av olika datatyper att identifiera grupper av gener med distinkta beteende i transkription och translation under aktiveringen. För en detaljerad beskrivning av bioinformatiska integration av olika datatyper hänvisar vi till den ursprungliga publikation11.
Analys av omsättning priser och data integration: En nyligen publicerad papper33 jämföra halveringstider bestäms av en multiplexade gen kontroll (MGC) till globala metoder kunde visa att halveringstider korrelerade bäst med sådana som erhållits genom metaboliska märkning metoder jämfört med andra metoder (t.ex., de allmänna hämning av transkription av droger). Det bör dock nämnas att skillnaderna mellan half-life beräkningar kan uppstå och ha varit beskrivs 15,34. Vi svarar för de flesta problem och skillnader som införs av stress svar på grund av långvarig 4sU exponering. Därför är det nödvändigt att utesluta den stressreaktion som infördes genom 4sU-märkning. För att ytterligare validera omsättning priser, rekommenderar vi användning av MGCs.
Dessutom kunde en uppsättning data som skapas här också användas för en mer integrativ data analys (t.ex., reglering av långa icke-kodande RNAs)35,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Lars Dölken för råd att upprätta 4sU märkning för primär T-celler; Elisabeth Graf och Thomas Schwarzmayr för kritiska hjälp i biblioteket generationer och sekvensering; Dirk Eick och Andrew Flatley för att tillhandahålla RNAPII och T-cells-antikroppar; N. Henriette Uhlenhaut och Franziska Greulich för hjälp bibliotek förberedelse för ChIP-seq; Caroline C. Friedel stöddes av bidrag FR2938/7-1 och CRC 1123 (Z2) från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG); Elke Glasmacher stöddes av anslaget GL 870/1-1 från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) och den tyska Center för Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |