Summary
이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.
Abstract
이 프로토콜 지 루트 마우스 파생 중추 (DRG) explant 및 생체 외에서 DRG 파생 공동 문화 해리 감각 신경 그리고 glial 위성 세포의 비보 전 모델을 설명합니다. 이들은 다양 한 생물학 응답 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해에서 이르는 말 초 신 경계 (PNS)의 생리 적 및 병 적인 상태와 관련 된 조사를 유용 하 고 다재 다능 한 모델 neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염입니다. DRG explant의 사용은 여러 이유로 단순한 단일 셀 모델에 비해 과학적으로 유리 하다. 예를 들어, organotypic 문화, DRG explant 비보 전 모든 신경 그리고 glial 기능에 중요 한 역할을 재생 하는 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 전체 신경 네트워크의 전송을 수 있습니다. 또한, DRG explants 또한 유지할 수 있습니다 비보 전 위해 몇 일 및 문화 조건으로 불안정 수 있습니다 원하는. 또한, 수확된 DRG 수 수 더 해리를 생체 외에서 공동 문화에 기본 감각 신경 그리고 glial 신경 상호 작용, neuritogenesis, axonal 콘 상호는 extracellular 조사 위성 glial 세포의 microenvironment, 그리고 더 일반적으로, 신경 물질 대사와 관련 된 모든 측면. 따라서, DRG explant 시스템 유연성을 다양 한 비용 효율적인 방식으로, 생리 적, 생물 학적 및 병 적인 조건에 관련 된 이벤트를 연구의 큰 거래를 제공 합니다.
Introduction
이 원고에서 우리를 PNS 모욕 신경 폐해에서 배열에 생물학 응답의 넓은 범위를 조사 하는 보존된 조직 같은 microenvironment로 파생 된 마우스 DRG 모델 시스템의 organotypic ex vivo 모델을 받는 방법을 보고합니다 상호 작용, neuroplasticity, 염증 성 마커, 바이러스 성 감염. 또한, 우리는 더 DRG 파생 한 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화를 만들려는 프로토콜 개발.
DRG는 위성 회색-문제-단위 척추 신경의 등 쪽 척추 뿌리 따라 중앙 신경 시스템 (CNS) 밖에 위치 해 있습니다. DRG, 척추 foramina의 근접에 있는 pseudounipolar 감각 뉴런 하며 위성 glial 세포. Pseudounipolar 신경 셀 시체 주변 대상에서 체세포와 내장 입력을 들고 주변 프로세스 및 CNS에 세포 체에서 감각 정보를 전송 하는 중앙 프로세스에 분할 단일 neurite 기능. 연결 캡슐 정의 CNS에서 신경 그리고 glial 세포의 주변이 클러스터를 분리 하 고. DRG에서 출생 후 셀 마이그레이션 없음 설명 적 이며 지방 줄기 세포 틈새 생활1에 걸쳐 발생 하는 neurogenic 이벤트에 대 한 책임. 따라서,이 모델은 특히 성체, axonogenesis, 외상 성 병 변, 및 세포 죽음2,3,,45,6,7 공부에 적합 ,,89 .
Neuroregeneration의 분야에는 DRG vivo에서 에서 수확 explanted 시험관에서 재현 axonotmesis, 신경 세포 체는 축 삭은 완전히 절단에 부상 상태 innervated 대상10에서 분리 ,11. 그것은 잘 알려져 주변 신경 상해는 DRG에 감소 및 증가 유전자 발현을 발생할 수 있습니다 및 이러한 변경의 많은 재생 프로세스의 결과 있지만 많은 비 신경 세포에서 면역 반응 또는 다른 결과 수도 있습니다. 비보 전 을 사용 하 여이 복잡성의 일부 고립 된 DRG의 시스템을 제거 하 고 기계적 경로 보다 쉽게 조사 수 있습니다.
CNS, 많은 신경 전달 물질 GABA12,13,,1415 신경 소마의 수준에서를 포함 하 여에 대 한 수용 체의 풍부에 감각 입력을 전달에 중앙의 역할 외에도 interneuronal 크로스-여기의 증거는 DRG 감각 입력16,17의 정교한 예비 통합자는 제안할 수 있습니다. 이러한 새로운 결과 부여 DRG explant에 비슷한 신경 조직 특정 organoids의 광범위 한 실험 분야에 사용 되는 다른 "미니 두뇌" 모델 및 치료 미니 신경 네트워크 시스템의 특성 신경 질환18,19에 접근. 이러한 증거는 사실은 DRG 연결 캡슐에 의해 포위 하는 신경 조직의 개별 및 잘 정의 된 클러스터 함께 비보 전 이식에 대 한 적합 한 장기 게.
자란 마우스 DRG 매력적인 다세포 옵션 종 간의 구조 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 pathophysiologies 모델을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 마우스 긴장의 큰 저장소 미래 기계 론 적인 연구에 매우 도움이 되는. Neurite 확장 모두 개발 및 그 이후 부상 성장 콘 및 기판20,21사이 기계적인 상호 작용을 요구 한다. 나노 및 마이크로 패턴이 기판 neurite 결과와 그들의 microenvironments에서 지형 기능에 대응 하는 자신의 능력을 보여주는 도구로 사용 되었습니다. 뉴런, 준수, 마이그레이션, 생존과 기판22,23에 홈 같은 표면 기능 탐색에 그들의 축 삭의 방향을 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 연구는 일반적으로 교양된 셀 라인 활용 하 고 어떻게 기본 신경 세포 지 예측 하기 어려운 비보 전또는 vivo에서 잘 정의 된, 물리적 신호에 응답.
마우스 사용이 제안에 대 한 DRG explant 모델 비보 전 진짜 셀 상호 작용 및 생 화 확 적인 신호 성장 축 삭을 둘러싼 모방 합니다. 많은 다른 neuroinflammation, axonal 재생, neurosphere 생산에서에서 배열 하는 실험적인 패러다임에서 DRG explant 가운데 모델 감각 내 바이러스 성 감염 및 대기 시간 측면을 조사 하는 유용한 도구 역할을 계속합니다 중추24,25,,2627.
신경 계통 (NS)는 일반적으로 바이러스 감염28,,2930에 대 한 대상입니다. 대부분 바이러스 감염 상피 그리고 내 피 세포 표면 그리고 주변 신경 통해 ns 표면 조직에서 그들의 방법을 감각 및 모터 섬유. 특히, 포진 심 플렉스 바이러스 타입 1 (HSV-1) 상피 세포에 초기 감염 감각 중추에 선호, 평생 대기 시간을 설정 후 PNS31,32의 DRG. PNS 감염 HSV-1 neuroptropic 기능 신경 질환33에 궁극적으로 지도 한다.
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Protocol
동물의 사용을 포함 한 모든 절차는 제도적 검토 보드 승인 프로토콜 (IACUC 중서부 대학)에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 배아에서 DRG 수확
-
잘린 뒤 질 식 방법 (CO2)에 의해 성인 쥐 안락사 즉시 수술 척추 열 제거를 진행 합니다.
- Dorsally 좋은 위를 사용 하 여 피부 레이어 아래로 절단 하 여 척추 열을 노출 합니다. 동물의 나머지에서 척추 열을 구분 하는 천 골을 통해 열의 양쪽에 있는 갈비뼈를 절단 하 여 척추 열을 격리 합니다.
- 바늘/핀을 사용 하 여 수술 매트에 척추 칼럼 (복 부 쪽)를 탑재 합니다.
- 좋은 위 만들기를 사용 하 여 double 척추 운하의 복 부 측 폭로 척추의 양쪽에 잘라.
- 현미경 수술 (배율 X 4로 설정)가 위를 사용 하 여 부드럽게 contralateral 등 쪽 척추 뿌리를 노출 하 고 주변 신경의 지 뿌리 따라 DRG를 찾으려고 편이 척수를 이동. 각 절의 척추 foramina 안에 부분적으로 숨겨집니다.
- DRG, 수확 한 집게 (척수와 사이 DRG) 지 루트 꼬집어 고 부드럽게 척추 구멍에서 DRG를 꺼내.
- DRG에 주변 척추 신경에 두 번째 집게를 배치 하 고 척추 신경 및 척추 루트 DRG를 당겨.
- 수집된 DRG 35mm 차가운 혈 청 자유로운 미디어 (SFM)34의 3 mL를 포함 하는 배양 접시에에서 놓습니다.
- 마른 유리 샬레에에서 각 개별 DRG 전송, 수술 현미경 청소 하 고 트림 초과 섬유와 여전히 DRG는 블레이드를 사용 하 여에 연결 하는 결합 조직. DRG는 흰색 척추 신경/루트 따라 불 룩 한 투명 구조로 쉽게 식별. 종종는 DRG를 둘러싼 혈관 발견 된다.
- 얼음 처럼 차가운 SFM 미디어를 포함 하는 새로운 페 트리 접시에 청소 DRG를 놓습니다.
- 젤라틴 단백질 혼합물을 희석 ( 재료의 표참조)에 얼음 처럼 차가운 SFM (1:1).
- DRG 비보 전 12-잘 접시에 접시 미리 젤라틴 단백질 혼합물의 10/20 µ L로 코팅 하 고 30-60 분에 대 한 37 ° C, 5% CO2 배양 기 안에 그들을 설정 합니다.
- 부드럽게 커버 전체 explant 및 유지 조건 (37 ° C, 5% CO2) 경작에서 explants 문화 시스템에 SFM의 1.5-2 mL를 추가 합니다.
참고: 이것은 중요 한 단계는 DRG 유리 요리만 생산 젤라틴 단백질 혼합물에 의해 고정 되어 있기 때문 에입니다. 중 합 및 pipetting 능력의 시간 부동 피하기 위해 중요 하다. - 성장 DRG 마다 72 h의 매체 변경 하 고 필요한 만큼 성장 하는 DRG를 하자.
2. 격리 DRG에서 단일 셀 신경
- 모든 DRG 콜라 IV의 1.25 mg/mL를 포함 하는 F12 미디어의 1.2 mL 살 균 1.5 mL 튜브에 수집 하 고 37 ° C, 5% CO2 45 분에서 그것을 품 어 또 다른 45 분에 대 한 첫 번째 부 화 후이 단계를 반복 합니다.
- 30 분에 대 한 트립 신 (0.025%)를 포함 하는 37 ° C, 5% CO2에 콜라 IV 치료 후 즉시 F12 미디어의 2 mL와 explants 취급 합니다.
- 15 분 동안 37 ° C, 5% CO2 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 33%)를 포함 된 F12 미디어 2 mL와 함께 품 어.
- Explants F12 미디어의 2 mL로 세 번 세척 하 고 기계적으로 해리 그들 유리 피 펫과 미디어 흐린 변할 때까지 계속 합니다.
참고:이 절차는 이전 섹션에 설명 된 대로 동물에서 청소/손질 DRG의 컬렉션을 포함 한다. Explants의 기계적 분리를 수행할 때 부드러운 고 흘림 및 작업 자료의 손실을 발생할 수 있습니다 이후 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오. - 0.22 μ m 필터 어떤 불순물 및 과도 결합 조직 제거를 통해 해리 세포 배양을 필터링 합니다. 필터링 된 셀 (2500 x g)에서 lysate 원심 2 분.
- 제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿 신경 문화 (1x), 항생제 혼합 (1x), L-글루타민 산 염 (0.5 m m)에 대 한 보충을 포함 하는 neurobasal 미디어의 500 µ L에서 resuspend 및 신경 성장 인자 (5 µ g/mL) ( 재료의 표참조).
- 기본 셀 밀도 laminin 코팅 커버 슬라이드 (50 µ g/mL, 참조 테이블의 재료)에 천연된 셀 접시. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다.
참고: 우리가 도금 25000 셀/커버 슬라이드에 세포. 이 기술은 신경 그리고 glial 위성 세포의 분리 수 있습니다. Pseudounipolar 신경와 공동 경작 glial 구성 요소 신경 생존을 위해 중요 한 역할을 한다.
3. HSV-1 감염 DRG Explants의 DRG 파생 해리 셀
참고:이 작업 엄격 하 게는 우리는 완벽 하 게 갖춘된 실험실 중서부 대학 biosafety 위원회에 의해 승인 되는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 요구에 따라 이루어졌다. HSV-1에의 KOS 스트레인이이 연구에 사용 되었다. 바이러스 긴장을 사용 하는 경우 적절 한 측정 및 현지 기관 지침에 따라 안전 조치 보시기 바랍니다.
- 확인 하 고 바이러스 감염 모델 SFM 미디어에 올바른 희석에 준비. 이 연구에 사용 된 바이러스는 HSV-1에의 KOS 긴장 했다. DRG 파생 작업 셀 해리 때 감염, 바이러스 같은 셀의 수 수를 의미에 대 한 다양 한 감염 (MOI)의 1 단위를 사용 합니다.
- Explants DRG를 감염 하는 경우 셀에는 explant의 정확한 수를 확인할 수 없으므로 virions (예를 들어, 10000 virions)의 수를 사용 합니다.
- Explant/셀 수 바이러스에 감염 된 살 균 셀 접시 또는 SFM 미디어와 바이러스의 혼합물을 포함 하는 튜브에 놓습니다.
참고: 우리는 25000 셀 (1 나)를 포함 하는 커버 슬라이드에 대 한 25000 virions를 사용. explant 감염, 우리는 10000 virions를 사용 합니다. - 열릴; 감염에 대 한 37 ° C에서 셀 플레이트 또는 관 배치 바이러스 노출 시간 바이러스 infectivity 따라 달라질 수 있습니다.
참고: 바이러스 항목 직교-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) 및 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) 분석 실험26사용 하 여 확인 되었다.
4입니다. 면역 형광 검사
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4% 포 르 말린에 explants 및 단일 셀 샘플을 수정. PBS에서 3 시간 10 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
- 원하는 기본 항 체 (안티-β-tubulin, 안티-peripherin, 안티-heparan 황산 염 (HS), 또는 반대로 당단백질 D (gD) 항 체, 희석에 대 한 참조 테이블의 자료 ) 0.3% 버퍼 PBS에에서 희석 된 샘플을 품 어 트리톤-X (PBST) 및 10 % 정상 염소 혈 청입니다. 밤새 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
- 3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 1 h 적절 한 이차 항 체에 대 한 실 온에서 샘플을 품 어 (488 또는 Cy3; 희석에 대 한 재료의 표 참조) PBS에 희석.
- 3 번 10 분 각 PBS 가진 대 한 샘플을 씻으십시오. 설치 단계 전에 20 분에 대 한 PBS에 Hoechst 염료 (1.5 µ M)와 샘플을 품 어.
- 형광 장착 매체와 coverslip를 사용 하 여 유리 슬라이드에 샘플을 탑재 합니다.
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Representative Results
Neuroplasticity 및 신경-환경 상호 작용의 여러 측면 DRG와 단일 해리 셀 문화 모델을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 우리는 DRG explant와 DRG 파생 해리 셀 개요로 서 그림 1에 표시를 분리 하 여 연구를 시작 했다. 조직 및 단일 셀 모델은 다양 한 면역 형광 검사, 서쪽 오 점, 게놈 분석, 실험 설계 및 목표의 성격에 따라 다른 분석 기법 등 분자 기술 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫째, 우리는 axonal 성장 (그림 2)에 생 화 확 적인 큐의 효과 조사 하기 위해 우리의 DRG explant 모델을 사용. 더블 또는 트리플 면역 형광 검사에서 peripherin (그림 2A, B; 레드)와 β-tubulin (그림 2A, B; 녹색)의 차동 식 모두 신경 셀 시체와 주변 neurite 콩나물을 확인 했다. 세포 핵 발견 했다 Hoechst 얼룩 (그림 2A, 파란색)과. 위에서 언급 한 마커의 표현 했다 추가 4 %paraformaldehyde 톰 단면 (그림 3A)에 고정 후 전체 DRG explant에서 분석. 우리의 결과 peripherin 및 β-tubulin는 선택적으로 표현 절 뉴런의 두 모집단에서 peripherin는 "작은 빛", 신경의 "큰, 어두운" 모집단에서 β-tubulin에 각각 표시 되 고 확인 했다. 감각 뉴런에서 신흥 중 표시와 함께 neurites immunolabeled 주변으로 종료 하기 전에 전체 신경 절을 통해 전기가 발견 됐다. Hoechst 얼룩은 주로 glial 위성 핵에서 신경 절 내에서 위치를 식별합니다. 그림 3B에 표시 된 대로 전체 세포 분리 기술 후 신경 위성 세포 상호 작용을 더 나은 시각 수 있습니다. 블루 스테인드 위성 세포 핵 β-tubulin-긍정적인 감각 신경 소마와의 광범위 한 neurites 주변으로 보였다.
우리는 더 DRG 파생 해리 셀 HSV-1 감염 조사에 활용 하 고 감각 신경 (그림 4)에서 염증 반응에 관련 된. 후 게시물 감염 (탐정)의 1 h, HSV-1 안티-HSV-1 gD 항 체 glial 세포 (그림 4A)와 DRG 뉴런 (그림 4B) 모두를 사용 하 여 검색 되었습니다. 또한, HS 얼룩은 추가 실시 이후 바이러스 첨부 파일 또는 호스트 셀 바인딩 도킹 위치를 제공 하는 HS. HS는 다기능 세포 외 기질 (ECM)의 중요 한 구성 요소로 알려져 되었으며 세포 접착, 셀 신호, 및 상처 치유, 배아 개발, 암 개장 하는 ECM에서 주요 역할을 광범위 하 게 문서화 침공, 섬유 증, 그리고 neuroinflammation35,36. 흥미롭게도, HS axonal 성장 (그림 4C)을 허용 하는 microenvironment에 그것의 잠재적인 역할을 제안 하는 ECM에 얼룩이 관찰 합니다. 마지막으로, β-tubulin 얼룩 사용 하는 neurites 긍정적인 마커로 뉴런의 무결성을 확인 하.
그림 1 . 회로도 표현을 실험 DRG와 단일 문화 모델 셀. DRG 성인 NIH/스위스 쥐, 과도 한 capsular 결합 조직, 그리고 어느 explanted ex vivo로 전체 explant에서 청소 또는 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화에 해리를 격리 했다. 두 모델은 여러 분석 기술로 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . DRG organotypic 문화 axonal 성장 조사를 모델 시스템으로 개발. DRG 비보 전 6 일에 대 한 성장 axonal는 explant에서 돋 아 조사 하는 데 사용 했다. 우리가 어떻게 다른 면역 형광에 의해 보여 생 화 확 적인 조건 섬유 콩나물의 분포에 영향을 미칠 수: 무작위로 성장과 무질서 (A) 더 선형 및 조직 패션 (B)에 비해. explants 안티-β-Tubulin (녹색)와 안티-peripherin (적색)로 표시 됩니다. 세포 핵은 Hoechst 물 얼룩 (파란색). 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 격리 된 신경 문화 모델의 분자 특성. 전체 DRG의 섹션 peripherin 및 β-tubulin 절 뉴런의 두 모집단에 선택적 표현의 두 마커를 보여주는 대 한 항 체와 immunolabeled 했다. Peripherin (레드)은 "작은, 가벼운" 신경에 표현 되며 β-tubulin (녹색) "큰, 어두운" 신경에 표현 된다. Hoechst 얼룩은 주로 glial 위성 핵 신경 절 (A) 내에서 위치를 식별합니다. 신경-위성 세포 상호 작용 전체 세포 분리 기술 (B) 후 더 나은 구상 될 수 있다. 여기 우리는 β-tubulin-긍정적인 감각 신경 육체와 위성 glial 세포로 둘러싸인 그 neurites 표시 (Hoechst: 핵, 블루). 스케일 바, A = 100 µ m; B = 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . DRG 파생에서 HSV-1 엔트리 모델의 해리 셀. Β-tubulin-긍정적인 neurites (녹색)에 따라 묘사 하는 천연된 위성 세포의 HSV-1 감염 gD 안티 바이러스 항 체 (레드)를 사용 하 여 공개 됩니다. 위성 glial 세포 핵 Hoechst (A)와 블루 얼룩이 있다. 동일한 항 체 천연된 DRG 신경 (B)에 있는 바이러스 성 항목을 보여준다. 공동 heparan 황산 염 (HS, 녹색)에 대 한 항 체를 세포 막에 표현으로 표시 됩니다. HS는 세포 외 기질 (녹색)의 구성 요소 이며 또한 axonal 성장 (C)에 대 한 중요 한 역할을 한다. 신경 세포는으로 표시 peripherin (빨간색) Hoechst 블루는 위성 세포의 핵을 식별 하는 데 사용 됩니다. 스케일 바 = 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ex vivo DRG 모델 두 신경 그리고 glial 대사37에 있는 microenvironment의 효과 뿐 아니라 신경 명과 상호 작용 등의 다양 한 스펙트럼을 조사 하기 위해 매우 유용 합니다. 또한, DRG 모델 병원 성 메커니즘 및 급성 만성 및 잠재성 단계 감염 또는 특정된 질병에 대 한 ex vivo 시스템 개발 하 여 마커를 관련 된 관련 된 질문을 해결 하기 위해 비용 효율적인 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, DRG explants에 작은 분자의 심사 도서관 약 개발이 explant 모델을 악용할 수 있습니다. 생체 외에서 모델, 특히 단일 셀 시스템, 너무 단순한 순수 관련 행사; 관련이 많습니다. vivo에서 모델을 정확 하 게 도전 하는 동안 조작, 부분적으로 부상, glial 흉터 및 금융 비용 함께 주변 ECM의 복잡성에 대 한 면역 반응 때문. 반대로, DRG explant 비보 전 전송을 허용 전체 장기의 중요 한 역할을 모든 신경 및 glial 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 신경 네트워크의 복잡 한 organotypic 문화는 기능입니다. 그러나, ex vivo 모델의 세대 수만 비슷하지만 완전히 보답 에 비보를 발견 하는 모든 조건. 이 모델을 사용할 때 염두에 두 가지 중요 한 제한이 타이밍 이며만 진정한 수 있는 조직의 피드백의 부재에 비보를 표현. DRG 중요 한 비보 전 유지 될 수 있는 제한 된 시간이이 모델을 급성 조건과 따라서 만성 조건에 대 한 매우 신뢰할 수 있는 모델이 아닌의 조사를 위해 더 적당 한 만든다. 마찬가지로, ex vivo 모델 응답 다른 기관 또는 시스템 (예, 면역 체계)의 부재에 의해 영향 될 수 있는 연구를 위한 적합 하지 않습니다.
우리는 성공적으로는 explant 비보 전 DRG 성인과 태아 쥐 및 쥐에서 분리 하 고이 모델을 사용 하 여 neuroplasticity translational 의학에 미치는 영향의 다른 여러 측면으로 HSV-1 감염 조사 수 있었다. 감각 섬유는 explant 밖에 성장 하는 것을 허용 하기 위하여 연결 주변 캡슐이 했다 부분적으로 제거1.
수를 고려, Engelbreth-Holm-떼 (EHS) 마우스 sarcom isrich laminin, 콜라겐 IV, 헤 파 린 황산 proteoglycans (HSPG), 등 다양 한 성장 인자38ECM 단백질에서에서 추출한 젤라틴 단백질 혼합물. 이 프로토콜에서 젤라틴 단백질 혼합물 문화 매체와 1:1 희석 하 고 매체의 최종 볼륨을 추가 하기 전에 37 ° C에서 30-60 분에 대 한 유해 수 있습니다. 실내 온도;에 젤라틴 단백질 혼합물 polymerizes 따라서, 그것은 explants는 도금 고를 10-20 µ L을 찬 피 펫 팁을 사용 하 여 12 음 요리에 때까지 혼합물을 냉장 보관 권장. 타이밍 문화 시저의 마지막 효율성에 대 한 중요 하 고 유형 (및 제조) 젤라틴 단백질 혼합물의 사용에 따라 다를 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물을 완전히 생산 하지, 그것은 이미 경화 하는 경우는 explant 부동 하거나 실패 한 성장에 주요 건조 수 있습니다. 우리는 경험적으로 적절 한 온도, 시간, 그리고 젤라틴 단백질 혼합물 희석 성공적인 모델을 확인 하는 조사를 권장 합니다. 우리는 DRG explants 비보 전 7-10 일 동안 유지의 성공적인 성장의 55-70%의 효율에 도달 했습니다. explant DRG 파생 된 기본 감각 신경 및 위성 셀 공동 문화에 더 해리 했다 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자 없다 공개.
Acknowledgments
우리는 진심으 세포 배양 및 이미징 작업에 그들의 공헌에 대 한 이미징 핵심 시설 중서부 대학 (MWU)와 [Chanmoly 셍, 크리스토퍼 Dipollina, 대 릴 Giambalvo, 그리고 케이시 Sigerson] 학생의 그룹에 감사 합니다. 이 연구 작업은 MWU의 Intramural 교부 V.T. M.F. 및 연구 시작 자금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
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- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
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