Vuxen mus DRG Explant och dissocierade cellmodeller för att undersöka neuroplasticitet och Svaren till miljömässiga förolämpningar inklusive virusinfektion
Summary
I denna rapport markerade fördelarna med organotypic kulturer och dissocierade primära kulturer av mus-derived dorsalrotsganglier för att undersöka en rad mekanismer som är associerad med neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticity, neuroinflammation och svar på virusinfektion.
Abstract
Det här protokollet beskriver en ex vivo -modell av mus-derived dorsalrotsganglier ganglier (DRG) explant och in vitro- DRG-derived samtidig kultur dissocierade sensoriska neuron och gliaceller satellit. Dessa är användbara och mångsidiga modeller att undersöka en mängd biologiska svar förknippas med fysiologiska och patologiska förhållanden av det perifera nervsystemet (PNS) alltifrån neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticity, neuroinflammation och virusinfektion. Användningen av DRG explant är vetenskapligt fördelaktigt jämfört naiv enstaka celler modeller av flera skäl. Till exempel, som en organotypic kultur ger den DRG explant ex vivo överföring av ett helt neuronala nätverk inklusive den extracellulära närmiljön som spelar en betydande roll i alla neuronala och gliaceller funktioner. Ytterligare, DRG bladsticklingar kan också upprätthållas ex vivo för flera dagar och odlingsbetingelserna kan vara orolig som önskas. Dessutom kan den skördade DRG ytterligare särskiljas i en in vitro- samtidig kultur av primära sensoriska nervceller och satellit gliaceller att undersöka neuronala-gliaceller interaktion, neuritogenesis, axonal kon interaktion med den extracellulära närmiljön, och mer allmänt, någon aspekt som är associerad med neuronal metabolism. Därför, DRG-explant systemet erbjuder en stor flexibilitet att studera en rad olika händelser relaterade till biologiska, fysiologiska och patologiska förhållanden på ett kostnadseffektivt sätt.
Introduction
I detta manuskript redovisar vi en metod att få en organotypic ex vivo modell av mus härrör DRG modellsystem som en bevarade vävnad-liknande närmiljön att undersöka en rad biologiska svar till PNS förolämpningar alltifrån neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticitet, inflammatoriska markörer, till virusinfektion. Dessutom har vi vidareutvecklat ett protokoll för att skapa en primär samtidig kultur av DRG-derived enda sensoriska nervceller och satellit celler.
DRG är satellit grå-materia-enheter längs de dorsala spinal rötterna av spinal nerver utanför det centrala nervsystemet (CNS). De DRG, ligger i närheten av intervertebral foramina, house Pseudounipolär sensoriska nervceller och satellit gliaceller. Pseudounipolär nervceller har en enda neurite som delas upp i en perifer process som transporterar somatisk och visceral ingångar från perifera mål till cellkroppen och en central process som skickar sensorisk information från cellkroppen i CNS. En bindväv kapsel definierar och isolerar detta perifera kluster av neuron och gliaceller från CNS. Ingen postnatal cellmigration till eller från DRG någonsin har beskrivits och en lokal stamcellsnischen ansvarar för neurogen händelser som inträffar i hela livet1. Denna modell är därför särskilt lämplig att studera adult neurogenes, axonogenesis, svar på posttraumatisk lesion, och cell death2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
I fältet för neuroregeneration, DRG skördas från in vivo och explanterad i vitro återger axonotmesis, en skada villkor i vilka axoner undertrckande fullt och neuronala cellkroppen är frånkopplad från innerverade målet10 ,11. Det är väl känt att perifer nervskada kan orsaka minskade och ökade genuttryck i DRG och många av dessa förändringar är ett resultat av regenerativ processer men många kan också vara ett resultat av immunsvar eller ett annat svar från icke-neuronala celler. Med hjälp av en ex vivo system av isolerade DRG, några av denna komplexitet avlägsnas och mekanistiska vägar kan undersökas mer enkelt.
Förutom sin centrala roll i att förmedla sensoriska input till CNS, överflödet av receptorer för många signalsubstanser inklusive GABA12,13,14,15 i nivå med den neuronala soma samt bevis på interneuronal cross-magnetisering kan antyda att DRG är sofistikerade preliminära integratörer sensoriska input16,17. Dessa nya rön ger till den DRG explant ett mini-neuronala nätverkssystem liknar andra ”mini hjärnan” modeller, som är nervös-vävnad-specifika organoids används för bredare experimentell fält av utredning och terapeutiska egenskaper förhållningssätt till neurologiska sjukdomar18,19. Dessa bevis tillsammans med det faktum att DRG är en diskret och väl definierade kluster av neuronal vävnad omgiven av en bindväv kapsel, gör det ett lämpligt organ för ex vivo transplantation.
Odling mus DRG presenterar ett attraktivt flercelliga alternativ att modellera mänskliga pathophysiologies på grund av strukturella och genetiska likheter mellan arterna. Dessutom är en stor databas av transgena möss stammar mycket gynnsam för framtida mekanistiska studier. Neurite extension både under utveckling och efter skada kräver mekanisk interaktioner mellan tillväxt kon och substrat20,21. Nano – och mikro-mönstrad substrat har använts som verktyg att direkt neurite utväxt och visa sin förmåga att svara på topografiska dragen i sin mikromiljö. Nervceller har visat sig överleva, följa, migrera och orientera sina axoner för att navigera surface-funktioner som grooves i substrat22,23. Dock dessa studier har oftast använt odlade cellinjer och det är svårt att förutsäga hur primär neuronala celler kommer svara på väldefinierade, fysiska ledtrådar i vivo eller ex vivo.
Ex vivo explant modell mus DRG används för detta förslag efterliknar riktiga cell-cell interaktioner och biokemiska signaler kring växande axoner. Bland många olika experimentella paradigm alltifrån axonal regenerering, neurosphere produktion, till neuroinflammation, DRG explant fortsätter modell att fungera som ett värdefullt verktyg för att undersöka den viral infektion och latens aspekten inom sensoriska ganglierna24,25,26,27.
Nervsystemet (NS) är i allmänhet målet för virusinfektioner28,29,30. De flesta virus infekterar epitelial och endothelial cellen ytbehandlar och gör sin väg från surface vävnaden till NS via perifer nerv sensoriska och motoriska fibrer. I synnerhet herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) efter en första infektion i epitelceller upprättar en livslång latens i sensoriska ganglier företrädesvis DRG av den PNS31,32. HSV-1 neuroptropic förmåga att infektera PNS ytterst leder till neurologiska sjukdomar33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo DRG modellen är mycket användbart att undersöka ett brett spektrum av händelser såsom neuron-glia interaktion samt effekten av närmiljön på båda neuronala och gliaceller metabolism37. Ytterligare, DRG-modellen skulle kunna användas som ett kostnadseffektivt verktyg för att ta itu med relevanta frågor om patogena mekanismen och associerade markörer genom att utveckla ex vivo system för akut kronisk och latent fas av infektion eller i en viss sjukdom. Dessutom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Imaging core-anläggningen på Midwestern University (Arbetskraftsenhet) och gruppen av studenter [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo och Casey Sigerson] för deras bidrag i cellkultur och imaging arbete. Detta forskningsarbete stöddes av Arbetskraftsenhet Intramural bidragsfinansiering att M.F. och forskning start-up medel till VT.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
