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Neuroscience

वयस्क माउस डीआरजी Explant और असंबद्ध सेल मॉडल वायरल संक्रमण सहित पर्यावरण अपमान को Neuroplasticity और प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए

Published: March 9, 2018 doi: 10.3791/56757
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Anatomy, Chicago College of Osteopathic Medicine (CCOM), Midwestern University, 2Department of Microbiology and Immunology, Chicago College of Osteopathic Medicine (CCOM), Midwestern University

Summary

इस रिपोर्ट में, organotypic संस्कृतियों और माउस के असंबद्ध प्राथमिक संस्कृतियों के लाभ-पृष्ठीय रूट गैंग्लिया व्युत्पंन के साथ जुड़े तंत्र की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए प्रकाश डाला जाता है ंयूरॉन glial बातचीत, neuroplasticity, neuroinflammation, और वायरल संक्रमण के लिए प्रतिक्रिया ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूर्व वीवो माउस के मॉडल-पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) explant और इन विट्रो डीआरजी-व्युत्पंन सह-संस्कृति असंबद्ध संवेदी ंयूरॉंस और glial सैटेलाइट कोशिकाओं । ये उपयोगी और बहुमुखी मॉडल है जैविक प्रतिक्रियाओं की एक किस्म की जांच करने के लिए शारीरिक और परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) से लेकर ंयूरॉन-glial बातचीत, neuroplasticity के रोग की स्थिति के साथ जुड़े, neuroinflammation, और वायरल संक्रमण । डीआरजी explant का उपयोग वैज्ञानिक रूप से कई कारणों के लिए सरलीकृत एकल कोशिकाओं के मॉडल की तुलना में लाभप्रद है । उदाहरण के लिए, एक organotypic संस्कृति के रूप में, डीआरजी explant सभी ंयूरॉंस और microenvironment कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा है कि extracellular glial सहित एक पूरे ंयूरॉंस नेटवर्क के पूर्व vivo हस्तांतरण की अनुमति देता है । इसके अलावा, डीआरजी explants भी कई दिनों के लिए पूर्व vivo बनाए रखा जा सकता है और संस्कृति की स्थिति के रूप में वांछित परेशान जा सकता है । इसके अलावा, काटा डीआरजी आगे असंबद्ध में एक इन विट्रो सह-संस्कृति प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं की जांच करने के लिए न्यूरॉन-glial बातचीत, neuritogenesis, axonal शंकु extracellular के साथ संपर्क में हो सकता है microenvironment, और अधिक सामांय, किसी भी पहलू के साथ जुड़े ंयूरॉन चयापचय । इसलिए, डीआरजी-explant प्रणाली एक लागत प्रभावी ढंग से जैविक, शारीरिक और रोग की स्थिति से संबंधित घटनाओं की एक विस्तृत सरणी का अध्ययन करने के लिए लचीलापन का एक बड़ा सौदा प्रदान करता है ।

Introduction

इस पांडुलिपि में, हम एक विधि एक संरक्षित ऊतक के रूप में व्युत्पंन डीआरजी मॉडल प्रणाली के रूप में एक organotypic प्राप्त करने के लिए एक पद्धति की रिपोर्ट के लिए एक microenvironment के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए पीएन की तरह ंयूरॉन से लेकर glial संपर्क, neuroplasticity, भड़काऊ मार्कर, वायरल संक्रमण के लिए । इसके अलावा, हम आगे डीआरजी-व्युत्पंन एकल संवेदी न्यूरॉन्स और उपग्रह कोशिकाओं की एक प्राथमिक सह संस्कृति बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है ।

डीआरजी उपग्रह ग्रे-मैटर-स्पाइनल नसों के पृष्ठीय रीढ़ की जड़ों के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के बाहर स्थित इकाइयों रहे हैं । डीआरजी, intervertebral foramina, घर pseudounipolar संवेदी ंयूरॉंस और उपग्रह glial कोशिकाओं की निकटता में स्थित है । pseudounipolar न्यूरॉन्स एक एकल neurite कि एक परिधीय कोशिका शरीर के लिए परिधीय लक्ष्यों से दैहिक और आंत में आदानों ले प्रक्रिया में विभाजन की सुविधा है, और एक केंद्रीय प्रक्रिया है कि सीएनएस में सेल शरीर से संवेदी जानकारी प्रस्तुत. एक संयोजी कैप्सूल को परिभाषित करता है और सीएनएस से न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के इस परिधीय क्लस्टर को अलग । कोई जन्मोत्तर सेल माइग्रेशन करने के लिए या डीआरजी से कभी भी वर्णित किया गया है और एक स्थानीय स्टेम सेल आला है तंत्रिकाजन्य पूरे जीवन में होने वाली घटनाओं के लिए जिंमेदार है1। इसलिए, इस मॉडल विशेष रूप से वयस्क neurogenesis का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, axonogenesis, दर्दनाक घावों के जवाब, और कोशिका मृत्यु2,3,4,5,6,7 ,8,9 .

neuroregeneration के क्षेत्र में, डीआरजी में vivo और explanted इन विट्रो में से काटा axonotmesis, एक चोट की हालत में axons पूरी तरह से गंभीर हैं और न्यूरॉन सेल शरीर innervated लक्ष्य10 से डिस्कनेक्ट कर दिया गया है ,11. यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि परिधीय तंत्रिका चोट डीआरजी में कमी हुई है और बढ़ जीन अभिव्यक्ति पैदा कर सकता है और इन परिवर्तनों के कई reअपक्षयी प्रक्रियाओं का परिणाम है, लेकिन कई भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या गैर से एक और प्रतिक्रिया का परिणाम हो सकता है-न्यूरॉन्स कोशिकाओं. अलग डीआरजी के एक पूर्व vivo प्रणाली का उपयोग करके, इस जटिलता के कुछ हटा दिया है और यंत्रवत रास्ते और अधिक आसानी से जांच की जा सकती है ।

सीएनएस के लिए संवेदी आदानों संदेश में अपनी केंद्रीय भूमिका के अलावा, गाबा सहित कई न्यूरोट्रांसमीटर के लिए रिसेप्टर्स की बहुतायत12,13,14,15 न्यूरॉन्स के स्तर पर के रूप में अच्छी तरह के रूप में उत्तेजना का सबूत है कि डीआरजी संवेदी निविष्टियां16,17के परिष्कृत प्रारंभिक एकीकरण सुझाव दे सकते हैं । इन नए निष्कर्षों डीआरजी explant के लिए एक मिनी-न्यूरॉन नेटवर्क प्रणाली अन्य "मिनी मस्तिष्क" मॉडल है, जो तंत्रिका-ऊतक-विशिष्ट organoids जांच और चिकित्सीय के व्यापक प्रायोगिक क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जाता है के समान की विशेषताओं को प्रदान मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए दृष्टिकोण18,19. इन सबूतों के साथ एक साथ तथ्य यह है कि डीआरजी एक असतत और अच्छी तरह से परिभाषित एक संयोजी कैप्सूल से घिरा हुआ ऊतक के क्लस्टर है, यह एक उपयुक्त अंग बनाने के लिए पूर्व vivo ट्रांसप्लांटेशन.

संवर्धन माउस डीआरजी प्रजातियों के बीच संरचनात्मक और आनुवंशिक समानता के कारण मॉडल मानव pathophysiologies के लिए एक आकर्षक कोशिकीय विकल्प प्रस्तुत करता है । इसके अतिरिक्त, ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का एक बड़ा भंडार भविष्य यंत्रवत अध्ययन के लिए अत्यधिक अनुकूल है । Neurite विस्तार दोनों विकास के दौरान और चोट के बाद विकास शंकु और सब्सट्रेट20,21के बीच यांत्रिक बातचीत की आवश्यकता है । नैनो और सूक्ष्म नमूनों सब्सट्रेट उपकरणों के रूप में इस्तेमाल किया गया है प्रत्यक्ष neurite वृद्धि और उनकी क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए उनके microenvironments में स्थलाकृतिक सुविधाओं का जवाब । न्यूरॉन्स के लिए जीवित रहने के लिए दिखाया गया है, पालन, प्रवास, और उनके axons सब्सट्रेट्स22,23में खांचे के रूप में सतह सुविधाओं नेविगेट करने के लिए ओरिएंट. हालांकि, इन अध्ययनों से आम तौर पर प्रसंस्कृत सेल लाइनों का उपयोग किया है और यह कैसे प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं को अच्छी तरह से परिभाषित करने के लिए जवाब देगा की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है, vivo में शारीरिक cues या पूर्व vivo.

इस प्रस्ताव के लिए इस्तेमाल किया माउस डीआरजी के पूर्व vivo explant मॉडल असली सेल सेल संपर्क और जैव रासायनिक cues बढ़ती axons आसपास नकल करता है । कई अलग प्रयोगात्मक axonal पुनर्जनन, neurosphere उत्पादन, neuroinflammation से लेकर मानदंड के अलावा, डीआरजी explant मॉडल संवेदी के भीतर वायरल संक्रमण और विलंबता पहलू की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए जारी गैंग्लिया२४,२५,२६,२७.

तंत्रिका तंत्र (एनएस) सामान्य रूप से वायरल संक्रमण28,29,30के लिए लक्ष्य है । अधिकांश वायरस उपकला और endothelial सेल सतहों को संक्रमित और परिधीय तंत्रिका संवेदी और मोटर फाइबर के माध्यम से एनएस को सतह के ऊतकों से उनके रास्ते बनाते हैं । विशेष रूप से, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 1 (एचएसवी-1) उपकला कोशिकाओं में एक प्रारंभिक संक्रमण के बाद संवेदी गैंग्लिया अधिमानतः में एक जीवन भर विलंबता स्थापित करता है, पीएन के डीआरजी31,32. एचएसवी-1 neuroptropic पीएन को संक्रमित करने की क्षमता अंततः स्नायविक रोगों की ओर जाता है33.

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Protocol

पशुओं के उपयोग सहित सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल (IACUC-Midwestern University) से अनुमोदित कर दिया गया है ।

1. चूहा भ्रूण से कटाई डीआरजी

  1. Euthanize द्वारा वयस्क चूहों को asphyxiation विधि (CO2) के द्वारा फ़ॉलो किया decapitation । तुरंत शल्य कशेरुका कॉलम हटाने के लिए आगे बढ़ना ।
    1. नीचे त्वचा परत ठीक कैंची का उपयोग कर नीचे काटने से कशेरुका कॉलम बेनकाब । कॉलम के दोनों ओर पसलियों के माध्यम से काटने और जानवर के बाकी हिस्सों से कशेरुका कॉलम को अलग त्रिकास्थि के माध्यम से कशेरुका कॉलम को अलग ।
    2. कशेरुका कॉलम (ventral ओर ऊपर) एक शल्य सुई का उपयोग कर चटाई पर माउंट/
  2. ठीक कैंची का प्रयोग कशेरुका शरीर के दोनों ओर कशेरुका नहर के ventral पक्ष को बेनकाब करने पर एक डबल काट कर ।
  3. एक शल्य माइक्रोस्कोप के तहत (4x करने के लिए सेट बढ़ाई), कैंची का उपयोग करने के लिए धीरे पक्ष पर रीढ़ की हड्डी चाल contralateral पृष्ठीय रीढ़ की जड़ों को बेनकाब करने के लिए और डीआरजी का पता लगाने के लिए, परिधीय नसों के पृष्ठीय जड़ों के साथ. प्रत्येक नाड़ीग्रंथि आंशिक रूप से intervertebral foramina के अंदर छिपा हुआ है ।
  4. डीआरजी फसल के लिए, पृष्ठीय जड़ चुटकी (रीढ़ की हड्डी और डीआरजी के बीच) एक संदंश के साथ और धीरे से बाहर intervertebral फोरमेन से डीआरजी खींचो ।
  5. रीढ़ की हड्डी तंत्रिका परिधीय पर डीआरजी के लिए दूसरी संदंश प्लेस और रीढ़ की हड्डी तंत्रिका और रीढ़ की हड्डी के साथ एक साथ डीआरजी खींचो ।
  6. एक 35 मिमी पेट्री बर्फ के 3 मिलीलीटर ठंड सीरम मुक्त मीडिया (SFM)34युक्त पकवान में एकत्र डीआरजी प्लेस ।
  7. एक सूखी गिलास पेट्री पकवान में प्रत्येक व्यक्ति डीआरजी हस्तांतरण और, एक शल्य माइक्रोस्कोप के तहत, साफ और बंद अतिरिक्त फाइबर और संयोजी ऊतक अभी भी एक ब्लेड का उपयोग कर डीआरजी से जुड़ा ट्रिम कर दीजिए । डीआरजी आसानी से सफेद रीढ़ की हड्डी के साथ एक उभार पारदर्शी संरचना के रूप में पहचाने जाने योग्य है/ रक्त वाहिकाओं अक्सर डीआरजी आसपास पाया जाता है ।
  8. आइस-कोल्ड SFM मीडिया युक्त एक नई पेट्री डिश में जरुर डीआरजी को लगाएं ।
  9. चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ में ठंडा SFM (1:1) ।
  10. प्लेट डीआरजी 12 में पूर्व vivo -अच्छी तरह से प्लेटें पूर्व 10/20 µ चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण के एल के साथ लेपित और उंहें 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के अंदर सेट और 5% सह 30-60 मिनट के लिए2 ।
  11. धीरे की संस्कृति प्रणाली के लिए SFM के 1.5-2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पूरे explant कवर और संवर्धन शर्तों पर explants बनाए रखने (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह2).
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि डीआरजी केवल बहुलक चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण द्वारा कांच के व्यंजन के लिए लंगर डाला है । बहुलकीकरण और pipetting कौशल का समय फ्लोटिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
  12. हर 72 ज डीआरजी बढ़ती के माध्यम बदलने के लिए और डीआरजी के रूप में लंबे समय के रूप में जरूरत के लिए विकसित करते हैं ।

2. डीआरजी से अलग एकल कोशिका ंयूरॉंस

  1. सभी डीआरजी एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में एकत्र की 1.2 मिलीलीटर के साथ लगभग 1.25 मिलीग्राम/collagenase IV के मिलीलीटर और यह 37 ° c और 5% CO पर यह मशीन 45 मिनट के लिए एक और 45 मिनट के लिए इस कदम को दोहराने के बाद पहली मशीन ।
  2. trypsin युक्त F12 मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ explants समझो (30 मिनट के लिए ०.०२५%) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2पर collagenase IV उपचार के तुरंत बाद ।
  3. F12 मीडिया के 2 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त के साथ मशीन (FBS; 33%) 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह2 15 मिनट के लिए ।
  4. explants तीन बार F12 मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ धो और यांत्रिक उंहें एक गिलास पिपेट के साथ अलग कर देना जब तक मीडिया बादल बदल जाता है आगे बढ़ना ।
    नोट: इस प्रक्रिया के पूर्व अनुभाग में बताया गया के रूप में पशु से साफ/छंटनी डीआरजी का संग्रह शामिल है । जब explants के यांत्रिक पृथक्करण प्रदर्शन, कोमल और अत्यधिक बल का उपयोग नहीं करते क्योंकि यह छलकने और काम करने की सामग्री के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  5. किसी भी अशुद्धियों और अधिक संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए एक 0.22 µm फिल्टर के माध्यम से असंबद्ध सेल संस्कृति को फ़िल्टर । 2 मिनट के लिए (2,500 x जी) पर फ़िल्टर्ड सेल lysate केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें और neurobasal मीडिया के 500 µ L में सेल गोली reसस्पेंड, न्यूरॉन युक्त संस्कृति (1x) के लिए पूरक, एंटीबायोटिक मिश्रण (1x), एल ग्लूटामेट (0.5 मिमी), और तंत्रिका विकास कारक (5 µ g/एमएल) (देखें सामग्री की तालिका) ।
  7. असंबद्ध कोशिकाओं को laminin-कोटेड कवर स्लाइड पर प्लेट (50 µ g/mL; सामग्री की तालिकादेखें) एक पसंदीदा कोशिका घनत्व पर । सेल घनत्व एक सेल काउंटर का उपयोग कर निर्धारित करें ।
    नोट: हम 25,000 कोशिकाओं/कवर स्लाइड पर कोशिकाओं चढ़ाया । यह तकनीक न्यूरॉन्स और glial सैटेलाइट कोशिकाओं दोनों के पृथक्करण की अनुमति देता है । pseudounipolar न्यूरॉन्स के साथ glial घटक सह-कल्चरल न्यूरॉन्स के अस्तित्व के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.

3. एचएसवी-1 डीआरजी Explants और डीआरजी-व्युत्पन्न असंबद्ध कोशिकाओं का संक्रमण

नोट: यह काम कड़ाई से पालन द्वारा किया गया था-2 (बीएसएल-2) आवश्यकताओं को जो हम एक पूरी तरह से सुसज्जित प्रयोगशाला है कि Midwestern विश्वविद्यालय के लिए सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित है । इस अध्ययन में एचएसवी-1 का एक कोस का प्रयोग किया गया । कृपया स्थानीय संस्थानों के दिशा निर्देशों के अनुसार उचित माप और सुरक्षा सावधानियों ले अगर वायरस उपभेदों के साथ काम कर रहे ।

  1. निर्धारित करें और SFM मीडिया में सही कमजोर पड़ने में वायरस मॉडल को संक्रमित करने के लिए तैयार करते हैं । इस अध्ययन में इस्तेमाल किया वायरस एचएसवी-1 के कोस तनाव था । डीआरजी-व्युत्पन्न असंबद्ध कोशिकाओं के साथ काम करते समय, संक्रमण के लिए संक्रमण (MOI) की बहुलता की 1 इकाई का उपयोग करें, जो वायरस की संख्या के बराबर कोशिकाओं की संख्या का मतलब है.
  2. यदि डीआरजी explants को संक्रमित करते हैं, तो virions (उदा., 10,000 virions) की संख्या का उपयोग करें क्योंकि किसी explant में कक्षों की सही संख्या निर्धारित नहीं की जा सकती ।
  3. explant/कोशिकाओं को एक बाँझ सेल प्लेट या SFM मीडिया और वायरस का एक मिश्रण युक्त ट्यूब में वायरस से संक्रमित होने के लिए जगह है ।
    नोट: हम 25,000 कोशिकाओं (1 MOI) युक्त कवर स्लाइड के लिए 25,000 virions का इस्तेमाल किया । एक explant को संक्रमित करने के लिए, हम 10,000 virions का उपयोग करें ।
  4. जगह लेने के लिए संक्रमण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल प्लेट या ट्यूब प्लेस; वायरल जोखिम के समय वायरल infectivity के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
    नोट: वायरल प्रविष्टि ऑर्थो-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) और 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-डी-galactopyranoside (एक्स-gal) परख26का उपयोग करके पुष्टि की गई थी ।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में तैयार 4% formalin में explants और सिंगल सेल नमूने को ठीक करें । धो नमूने 10 मिनट के लिए प्रत्येक पंजाब में 3 बार ।
  2. वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों की मशीन (एंटी β-tubulin, एंटी-peripherin, एंटी-heparan सल्फेट (HS), और/या एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन डी (gD) एंटीबॉडी; कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें) के साथ पंजाबियों बफर में पतला 0.3% ट्राइटन-X (PBST) और 10 % सामांय बकरी सीरम । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूनों की दुकान ।
  3. 10 मिनट के लिए प्रत्येक पंजाबियों के साथ नमूने 3 बार धो लें । उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी में 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन नमूने (488 और/Cy3; कम करने के लिए सामग्री की तालिका देखें) पंजाबियों में पतला ।
  4. 10 मिनट के लिए प्रत्येक पंजाबियों के साथ नमूने 3 बार धो लें । बढ़ते कदम से पहले 20 मिनट के लिए पंजाब में Hoechst डाई (1.5 µ m) के साथ नमूनों की मशीन ।
  5. एक प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम और coverslip का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर नमूने माउंट ।

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Representative Results

neuroplasticity और ंयूरॉन के कई पहलुओं-पर्यावरण संपर्क डीआरजी और एक एकल असंबद्ध सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग कर जांच की जा सकती है । हम एक डीआरजी explant और डीआरजी-व्युत्पंन असंबद्ध कोशिकाओं के रूप में योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1में प्रतिनिधित्व अलग से अध्ययन शुरू किया । दोनों ऊतक और एकल कोशिकाओं के मॉडल ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में आणविक तकनीकों की एक किस्म का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता, पश्चिमी दाग, जीनोमिक परख, और अंय विश्लेषणात्मक तकनीक प्रयोगात्मक डिजाइन और उद्देश्य की प्रकृति पर निर्भर करता है । सबसे पहले, हम axonal वृद्धि (चित्रा 2) पर जैव रासायनिक cues के प्रभाव की जांच करने के लिए हमारे डीआरजी explant मॉडल का इस्तेमाल किया । दोहरे या तिहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस में, peripherin की विभेदक अभिव्यक्ति (चित्र 2a, B; red) और β-tubulin (चित्र 2a, b; green) दोनों के भीतर न्यूरॉन कोशिका निकायों और परिधीय neurite अंकुरित होने की पुष्टि की गई. Hoechst दाग (चित्र 2a; नीला) के साथ कक्ष नाभिक की पहचान की गई । उपर्युक्त मार्करों की अभिव्यक्ति को 4% paraformaldehyde और microtome-सेक्शनिंग (चित्रा 3ए) में निर्धारण के बाद संपूर्ण डीआरजी explant में आगे विश्लेषण किया गया. हमारे परिणामों की पुष्टि की है कि peripherin और β-tubulin चुनिंदा ganglionic न्यूरॉन्स के दो उपक्रमों में व्यक्त की जा रही peripherin के साथ "छोटे, प्रकाश" और β-tubulin में व्यक्त किया जा रहा है "बड़े, अंधेरे" न्यूरॉन्स की उपआबादी, क्रमशः. या तो संवेदी न्यूरॉन्स से उभर मार्कर के साथ neurites immunolabeled परिधि में बाहर निकलने से पहले पूरे नाड़ीग्रंथि के माध्यम से दौड़ पाया गया. Hoechst दाग ज्यादातर नाड़ीग्रंथि के भीतर glial उपग्रह नाभिक की स्थिति की पहचान की । के रूप में चित्र बीमें संकेत दिया, ंयूरॉन-उपग्रह सेल बातचीत बेहतर पूर्ण सेल पृथक्करण तकनीक के बाद visualized किया जा सकता है । नीले दाग उपग्रह कोशिका नाभिक एक β-tubulin-सकारात्मक संवेदी ंयूरॉंस सोमा और उसके व्यापक neurites आसपास देखा गया ।

हम आगे डीआरजी-व्युत्पंन असंबद्ध कोशिकाओं एचएसवी-1 संक्रमण और जुड़े संवेदी ंयूरॉंस के भीतर भड़काऊ प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए उपयोग (चित्रा 4) । पोस्ट संक्रमण (p.i.) के केवल 1 घंटे के बाद, एचएसवी-1 प्रविष्टि एंटी-एचएसवी-1 gD एंटीबॉडी दोनों glial कोशिकाओं में (चित्र 4a) और डीआरजी न्यूरॉन्स (चित्रा 4B) का उपयोग करके पाया गया । इसके अलावा, एच एस धुंधला आगे बाहर किया गया था के बाद से एच एस वायरस लगाव या मेजबान सेल के लिए बाध्यकारी के लिए एक डॉकिंग साइटों प्रदान करता है । HS बहु-कार्यात्मक extracellular मैट्रिक्स (ECM) के एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में जाना जाता है और बड़े पैमाने पर सेल आसंजन में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए प्रलेखित किया गया है, सेल-टू-सेल संकेतन, और घाव भरने के दौरान ECM remodeling, भ्रूण विकास, कैंसर आक्रमण, फाइब्रोसिस, और neuroinflammation में35,36। दिलचस्प है, हम microenvironment है कि axonal वृद्धि (चित्र 4c) के लिए अनुमति देता है में अपनी क्षमता की भूमिका का सुझाव ECM में दाग एच एस देखा. अंत में, β-tubulin धुंधला हम neurites के लिए एक सकारात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल के लिए ंयूरॉंस की अखंडता की पुष्टि के लिए ।

Figure 1
चित्र 1 . प्रयोगात्मक डीआरजी और एकल सेल संस्कृति मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । डीआरजी वयस्क NIH/स्विस चूहों से अलग किया गया, अत्यधिक संपुटी संयोजी ऊतक से साफ है, और या तो explanted पूर्व vivo एक पूरी explant के रूप में या संवेदी ंयूरॉंस और उपग्रह कोशिकाओं की प्राथमिक सह संस्कृतियों में असंबद्ध । दोनों मॉडलों को कई विश्लेषणात्मक तकनीकों के साथ आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . axonal विकास की जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में डीआरजी organotypic संस्कृति का विकास । डीआरजी 6 दिनों के लिए पूर्व विवो explant से अंकुरित axonal जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा दिखाने के लिए कैसे अलग जैव रासायनिक स्थितियों फाइबर अंकुरित के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं: बेतरतीब ढंग से बढ़ रही है और अव्यवस्थित (एक) एक और अधिक रैखिक और संगठित फैशन (बी) की तुलना में । explants विरोधी β-Tubulin (हरा) और विरोधी peripherin (लाल) के साथ लेबल कर रहे हैं । सेल नाभिक Hoechst दाग (नीला) से सना है । स्केल बार्स = 100 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . पृथक ंयूरॉन संस्कृति मॉडल के आणविक लक्षण वर्णन । पूरे डीआरजी के वर्गों peripherin और β-tubulin ganglionic ंयूरॉंस की दो उपआबादी में दो मार्करों के चयनात्मक अभिव्यक्ति दिखा के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled थे । Peripherin (लाल) में व्यक्त किया जाता है "छोटे, प्रकाश" न्यूरॉन्स और β-tubulin (हरा) में व्यक्त किया जाता है "बड़े, अंधेरे" न्यूरॉन्स. Hoechst दाग ज्यादातर नाड़ीग्रंथि (ए) के भीतर glial सैटेलाइट नाभिक की स्थिति की पहचान की । न्यूरॉन-सैटेलाइट सेल इंटरेक्शन पूर्ण सेल पृथक्करण तकनीक (बी) के बाद बेहतर visualized किया जा सकता है । यहां हम एक β-tubulin-सकारात्मक संवेदी ंयूरॉन शरीर और उसके neurites उपग्रह glial कोशिकाओं (Hoechst: नाभिक, नीला) से घिरा दिखा । स्केल बार्स, A = 100 µm; B = 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . डीआरजी-व्युत्पंन असंबद्ध कोशिकाओं में एचएसवी-1 प्रविष्टि मॉडल की जांच । एचएसवी-1 असंबद्ध सैटेलाइट कोशिकाओं के संक्रमण β-tubulin-पॉजिटिव neurites (हरा) के साथ चित्रित एक विरोधी वायरल gD एंटीबॉडी (लाल) का उपयोग कर पता चला है । उपग्रह glial कोशिकाओं नाभिक Hoechst (ए) के साथ नीले दाग रहे हैं । इसी एंटीबॉडी से असंबद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स (बी) में वायरल एंट्री का पता चलता है । कक्ष heparan सल्फेट (एच एस, ग्रीन) कोशिका झिल्ली पर व्यक्त के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ सह-लेबल कर रहे हैं । HS भी extracellular मैट्रिक्स (हरा) का एक घटक है और axonal वृद्धि (सी) के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । न्यूरॉन्स peripherin (लाल) के साथ लेबल कर रहे हैं, जबकि Hoechst नीले उपग्रह कोशिका के नाभिक की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. स्केल पट्टियां = 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पूर्व vivo डीआरजी मॉडल अत्यंत ंयूरॉन glia बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों पर microenvironment के प्रभाव के रूप में की घटनाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की जांच उपयोगी है और glial चयापचय37। इसके अलावा, डीआरजी मॉडल एक लागत प्रभावी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है रोगजनक तंत्र और संक्रमण के तीव्र जीर्ण और अव्यक्त चरण या किसी दिए गए रोग के लिए पूर्व vivo सिस्टम के विकास के द्वारा संबद्ध मार्करों के बारे में प्रासंगिक प्रश्नों का पता करने के लिए । इसके अलावा, डीआरजी explants में छोटे अणुओं की एक स्क्रीनिंग पुस्तकालय दवा के विकास के लिए इस explant मॉडल का दोहन कर सकता है । इन विट्रो मॉडल, विशेष रूप से एकल सेल सिस्टम, अक्सर भी शारीरिक रूप से प्रासंगिक घटनाओं के लिए सहसंबंधी करने के लिए सरलीकृत कर रहे हैं; जबकि vivo में मॉडल ठीक हेरफेर करने के लिए चुनौती दे रहे हैं, आंशिक रूप से चोट करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण, glial scarring, और वित्तीय खर्च के साथ साथ आसपास के ECM की जटिलता । इसके विपरीत, डीआरजी explant एक organotypic संस्कृति है कि एक ंयूरॉंस नेटवर्क की जटिलता के साथ एक पूरे अंग के हस्तांतरण की अनुमति देता है, extracellular microenvironment है कि सभी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और न्यूरॉन glial सहित कार्यों. हालांकि, एक पूर्व vivo मॉडल की जनरेशन केवल समान लेकिन पूरी तरह से vivo मेंपाया शर्तों विनिमय नहीं कर सकते हैं । दो महत्वपूर्ण सीमाओं को ध्यान में रखने के लिए जब इस मॉडल का उपयोग कर समय और प्रणालीगत फीडबैक है, जो केवल वास्तव में vivo मेंप्रतिनिधित्व किया जा सकता है की अनुपस्थिति हैं । सीमित समय है कि डीआरजी महत्वपूर्ण पूर्व vivo बनाए रखा जा सकता है इस मॉडल तीव्र स्थितियों की जांच के लिए और अधिक उपयुक्त बनाता है और इस प्रकार पुरानी स्थितियों के लिए एक बहुत ही विश्वसनीय मॉडल नहीं है । इसी तरह, पूर्व vivo मॉडल अध्ययन है कि अंय अंगों या प्रणालियों (जैसे, प्रतिरक्षा प्रणाली) से प्रतिक्रियाओं के अभाव से प्रभावित हो सकता है के लिए आदर्श नहीं है ।

हम सफलतापूर्वक दोनों वयस्क और भ्रूण चूहों और चूहों से explant पूर्व vivo डीआरजी को अलग करने में सक्षम थे और इस मॉडल का उपयोग करने के लिए एचएसवी-1 संक्रमण की जांच के साथ ही neuroplasticity के कई अन्य पहलुओं और अनुवाद चिकित्सा पर इसके प्रभाव. संवेदी तंतुओं explant बाहर बढ़ने की अनुमति देने के लिए, संयोजी आसपास के कैप्सूल आंशिक रूप से1हटा दिया गया था ।

माना जाता है, चिपचिपा प्रोटीन Engelbreth से निकाले मिश्रण-होल्म-झुंड (ईएचएस) माउस isrich प्रोटीन में ECM, कोलेजन चतुर्थ, laminin सल्फेट हेपरिन (proteoglycans) के रूप में सरकों HSPG, और विकास कारकों की संख्या38। इस प्रोटोकॉल में, चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण संस्कृति माध्यम के साथ 1:1 पतला है और मध्यम की अंतिम मात्रा जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए polymerize करने की अनुमति दी । कमरे के तापमान पर चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण polymerizes; इसलिए, यह मिश्रण प्रशीतित करने के लिए सुझाव दिया है जब तक explants चढ़ाया और ठंड पिपेट युक्तियों का उपयोग करने के लिए 12-अच्छी तरह से बर्तन पर 10-20 µ एल बूंदें वितरित कर रहे हैं । समय संस्कृति प्रक्रिया की अंतिम दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है और प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते है (और निर्माण) जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण का इस्तेमाल किया । यदि जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण पूरी तरह से बहुलक नहीं है या यह पहले से ही जम गया है, explant फ्लोट या असफल विकास के लिए अग्रणी बाहर शुष्क कर सकते हैं । हम एक सफल मॉडल के लिए उपयुक्त तापमान, समय, और चिपचिपा प्रोटीन मिश्रण कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ताओं को प्रोत्साहित empirically । हम डीआरजी explants के सफल विकास की एक 55-70% दक्षता तक पहुंच 7-10 दिनों के लिए पूर्व vivo बनाए रखा । explant आगे डीआरजी-व्युत्पंन प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स और उपग्रह कोशिकाओं सह संस्कृति में असंबद्ध जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कुछ भी प्रकटीकरण नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से Midwestern विश्वविद्यालय (MWU) में इमेजिंग कोर सुविधा का धंयवाद और छात्रों के समूह [Chanmoly सेंग, क्रिस्टोफर Dipollina, डैरिल Giambalvo, और केसी Sigerson] सेल संस्कृति और इमेजिंग काम में उनके योगदान के लिए । इस शोध कार्य को MWU की अंदर ग्रांट फंडिंग द्वारा M.F. और रिसर्च स्टार्ट-अप फंड को V.T. करने का समर्थन किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mice NIH/Swiss Harlan Laboratories
35mm petri dish Cell Treat 229635
Matrigel ECM Sigma-Aldrich E1270 gelatinous protein mixture
F12 Media Gibco 11765-054 *Part of SFM media
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
Trypsin Sigma-Aldrich 25200-056
FBS Sigma-Aldrich F6178
0.22um filter BD Falcon 352350
Neurobasal media Gibco 10888-022
B27 supplement Gibco 17504-044 Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics Gibco 15640-055 *Part of SFM media
Antibiotic mixture
L-glutamate Sigma-Aldrich G7513 *Part of SFM media
NGF Alomone Labs N-100 Nerve growth factor
Laminin coated coverslide Neuvitro GG-14-Laminin
ONPG subtrate Pierce 34055
X-gal Invitrogen 15520034
Antibody anti-B-tubulin Sigma-Aldrich T8328 1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin Millipore AB1530 1:1000 dilution
Hoechst dye Thermo Fisher 62249 1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate US Biological H1890-10 0.180555556
Anti gD antibody Virostat 196 1:10 dilution
BSA  Sigma-Aldrich A2153-100G *Part of SFM media
BME Gibco 21010-046 *Part of SFM media
Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG *Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) Gibco 51300-044 *Part of SFM media
Vitamin-C Sigma-Aldrich A4403 *Part of SFM media
Putrescine Sigma-Aldrich P7505 *Part of SFM media
488 (goat anti-mouse) Life Technologies A11029
Cy3 (goat anti-rabbit) Jackson Immunoresearch laboratories 111-165-003
Normal Goat serum  Vector S-1000
Formalin Solution Sigma-Aldrich HT5014-120ML
PBS Gibco 10010-031
Triton-X Sigma-Aldrich T9284-500ML
VectaShield Vector H-1500 Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides Globe Scientific 1380-20

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Fornaro, M., Sharthiya, H., Tiwari, V. Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection. J. Vis. Exp. (133), e56757, doi:10.3791/56757 (2018).

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