Summary
I denne rapporten uthevet fordelene med organotypic kulturer og dissosiert primære kulturer av mus-avledet dorsal root Ganglion for å undersøke en rekke mekanismer knyttet Nevron-glial interaksjon, neuroplasticity, neuroinflammation, og respons på virusinfeksjon.
Abstract
Denne protokollen beskriver en ex vivo modell av mus-avledet dorsal root Ganglion (DRG) explant og i vitro DRG-avledet co kultur dissosiert sensoriske neurons og satellitt gliacellene. Dette er nyttig og allsidig modeller for å undersøke en rekke biologiske svar forbundet med fysiologiske og patologiske tilstander av det perifere nervesystemet (PNS) fra Nevron-glial interaksjon, neuroplasticity, neuroinflammation og viral infeksjon. Bruken av DRG explant er vitenskapelig fordelaktig forhold til enkle enkeltceller modeller av flere grunner. For eksempel, som en organotypic kultur innrømmer DRG explant ex vivo overføring av en hel nevrale nettverk inkludert den ekstracellulære microenvironment spiller en viktig rolle i alle neuronal og glial funksjoner. Videre kan DRG explants også vedlikeholdes ex vivo for flere dager og kultur forhold kan være opprørt som ønsket. I tillegg enzymene til høstet DRG ytterligere i en i vitro co kultur primære sensoriske neurons og satellitt gliacellene undersøke neuronal-glial interaksjon, neuritogenesis, axonal kjegle samspill med den ekstracellulære microenvironment, og mer generelt, ethvert aspekt knyttet til nevronale metabolismen. Derfor gir DRG-explant systemet mye fleksibilitet til å studere en rekke hendelser knyttet til biologiske, fysiologiske og patologiske forhold på en kostnadseffektiv måte.
Introduction
I dette manuskriptet rapportere vi en metode for å få en organotypic ex vivo modell av en musen stammer DRG modellsystem som en bevarte vev-lignende microenvironment å undersøke et bredt spekter av biologiske Svar å PNS fornærmelser fra Nevron-glial samhandling, neuroplasticity, inflammatoriske markører, viral infeksjon. Dessuten, utviklet vi ytterligere en protokoll for å skape en primær co DRG-avledet enkelt sensoriske neurons og satellitt celler.
DRG er satellitt grå-saken-enheter plassert utenfor sentralnervesystemet (CNS) langs dorsal spinal røttene spinalnerver. Den DRG, ligger i nærheten av intervertebral foramina, house pseudounipolar sensoriske neurons og satellitt gliacellene. Pseudounipolar neurons har et enkelt neurite som deles i en ekstern prosess bærer somatiske og visceral inndata fra eksterne mål til celle kroppen, og en sentral prosess som sender sensoriske informasjonen fra celle kroppen til CNS. En connective kapsel definerer og isolerer denne eksterne klyngen av neurons og gliacellene fra CNS. Ingen postnatal celle migrasjon til eller fra DRG har noensinne blitt beskrevet og en lokal stamcelleforskningen nisje er ansvarlig for neurogenic hendelser hele livet1. Denne modellen er derfor spesielt godt egnet til å studere voksen neurogenesis, axonogenesis, svar på traumatisk lesjon, og celle død2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Innen neuroregeneration, DRG høstet fra in vivo og explanted i vitro gjengir axonotmesis, en skade tilstand som axons er fullt kuttet og neuronal celle kroppen er koblet fra innervated målet10 ,11. Det er kjent at eksterne nerve skade kan føre til redusert og økt genuttrykk i DRG og mange av disse endringene er et resultat av regenererende prosesser men mange kan også være et resultat av immunrespons eller et annet svar fra ikke-neuronal celler. Ved hjelp av en ex vivo system av isolerte DRG, noen av denne kompleksiteten fjernes og mekanistisk trasé lettere kan undersøkes.
Foruten sin sentrale rolle i å formidle sensoriske innganger til CNS overflod av reseptorer for mange nevrotransmittere inkludert GABA12,13,14,15 på nivå med neuronal soma samt bevis på interneuronal cross-eksitasjon kan foreslå at DRG er sofistikert foreløpige integratorer sensoriske innganger16,17. Disse nye funn tildele til DRG explant egenskapene til et mini-nevrale nettverk system ligner andre "mini brain" modeller, som er nervøs vev-spesifikke organoids brukes for bredere eksperimentell felt av etterforskning og terapeutiske tilnærming til nevrologiske sykdommer18,19. Disse bevisene sammen med det faktum at DRG er en diskret og veldefinert klynge av neuronal vev omgitt av en connective kapsel, gjør det til et egnet organ for ex vivo transplantasjon.
Dyrking musen DRG presenterer et attraktivt flercellet alternativ å modellere menneskelige pathophysiologies på grunn av strukturelle og genetiske likheter mellom artene. I tillegg er et stort register av transgene musen stammer svært fremmer fremtidige mekanistisk studier. Neurite forlengelsen både under utbyggingen og etter skade krever mekanisk samhandlinger mellom vekst kjegle og underlaget20,21. Nano - og mikro-mønstret underlag har blitt brukt som verktøy til å direkte neurite utvekst og demonstrere deres evne til å svare på topografiske egenskaper i deres microenvironments. Neurons har vist seg å overleve, følge, overføre og orientere sine axons å navigere overflaten funksjoner som spor i substrater22,23. Men disse studiene har vanligvis benyttet kulturperler linjer og det er vanskelig å forutsi hvordan primære neuronal celler vil svare godt definert, fysiske signaler i vivo eller ex vivo.
Explant ex vivo modell av musen DRG brukes for dette forslaget etterligner ekte celle-celle samhandling og biokjemiske indikatorer rundt voksende axons. Blant mange forskjellige eksperimentelle paradigmer mellom axonal gjenfødelse, neurosphere produksjon, neuroinflammation, DRG explant fortsetter modellen å tjene som et verdifullt verktøy for å undersøke det viral infeksjon og ventetid aspektet i Sensorisk Ganglion24,25,26,27.
Nervesystemet (NS) er generelt mål for virusinfeksjoner28,29,30. De fleste virus infisere epitel og endothelial celle overflater og komme seg fra overflaten vevet til NS via eksterne nerve sensorisk og motor fibre. Spesielt herpes simplex virus type 1 (HSV-1) etter en innledende infeksjon i epitelceller etablerer en livslang ventetid i de sensoriske Ganglion helst DRG av PNS31,32. HSV-1 neuroptropic evnen til å infisere PNS til slutt fører til nevrologiske sykdommer33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer inkludert bruk av dyrene har blitt godkjent av institusjonelle gjennomgang styret godkjent protokollene (IACUC-Midwestern University).
1. høsting DRG fra musen embryo
-
Euthanize voksen mus ved kvelning metoden (CO2) etterfulgt av halshogging. Gå rett surgically fjerner virvelsøylen.
- Utsett virvelsøylen ved å kutte ned huden laget på ryggen med fine saks. Isolere virvelsøylen ved å kutte gjennom ribbeina på hver side av kolonnen og sacrum skille virvelsøylen fra resten av dyret.
- Montere virvelsøylen (ventral side opp) på en kirurgisk mat med nåler/pins.
- Bruke fine saks gjør en dobbel klipp på begge sider av ryggvirvel organer for å utsette på ventral side av vertebral kanalen.
- Under en kirurgisk mikroskop (satt til 4 X forstørrelse), bruker du saks forsiktig flytte ryggmargen på side å avsløre kontralateral dorsal spinal røttene og finne DRG, langs dorsal røttene av eksterne nerver. Hver ganglion er delvis skjult inne i intervertebral foramina.
- For å høste DRG, knip dorsal root (mellom ryggmargen og DRG) med en tang og trekk forsiktig ut DRG fra intervertebral foramen.
- Plassere andre tang på rotere nerve eksterne til DRG og trekk DRG spinal nerve og spinal rot.
- Plass den innsamlede DRG i 35 mm Petriskål inneholder 3 mL iskald serum frie medier (SFM)34.
- Overføre hver individuelle DRG i et tørt glass Petriskål og, under en kirurgisk mikroskop, rengjør og trim av overskytende fibre og bindevev fortsatt festet til DRG med et blad. DRG er lett identifiserbare som en bulgy gjennomsiktig struktur langs hvite spinal nerve/rot. Blodkar er ofte funnet rundt DRG.
- Sett den rengjorte DRG i en ny Petriskål inneholder iskald SFM media.
- Fortynne geléaktige protein blandingen (se Tabell for materiale) i iskalde SFM (1:1).
- Den DRG ex vivo i 12-vel plater pre-belagt med 10/20 µL av geléaktige proteinet blanding og sette dem i inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i 30-60 minutter.
- Forsiktig legge til 1,5-2 mL SFM kultur-systemet til å dekke hele explant og opprettholde explants på dyrking forhold (37 ° C og 5% CO2).
Merk: Dette er et kritisk steg fordi DRG er forankret til glass retter ved polymerized geléaktige protein blandingen. Polymerisasjon og pipettering ferdigheter er avgjørende for å unngå flytende. - Endre medium for voksende DRG hver 72 h og la DRG vokse for så lenge som nødvendig.
2. isolere enkeltcelle Neurons fra DRG
- Alle DRG samlet i en 1,5 mL steril tube med 1,2 mL F12 mediet som inneholder 1,25 mg/mL collagenase IV og ruge det 37 ° C og 5% CO2 i 45 min. Gjenta dette trinnet for en annen 45 min etter den første inkubering.
- Behandle explants med 2 mL F12 mediet som inneholder trypsin (0.025%) i 30 min umiddelbart etter collagenase IV behandling på 37 ° C og 5% CO2.
- Inkuber med 2 mL F12 mediet som inneholder fosterets bovin serum (FBS, 33%) på 37 ° C og 5% CO2 i 15 min.
- Vask explants tre ganger med 2 mL F12 media og fortsette å mekanisk dissociate dem med et glass Pipetter til media blir skyet.
Merk: Denne prosedyren innebærer samling av ren/trimmet DRG fra dyret som forklart i delen tidligere. Når du utfører mekanisk avstandtagen for explants, være forsiktig og ikke bruk overdreven makt siden det kan føre til utslipp og tap av arbeidstiden materialet. - Filtrere dissosiert cellekultur gjennom et 0.22 µm filter til å fjerne alle urenheter og overflødig bindevev. Sentrifuge filtrerte cellen lysate (2500 x g) i 2 minutter.
- Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 500 µL neurobasal medietyper som inneholder supplement for neuronal kultur (1 x), antibiotika blanding (1 x), L-glutamat (0,5 mM), og nerve vekst faktor (5 µg/mL) (se Tabell for materiale).
- Plate dissosiert cellene på laminin-belagt dekke lysbilder (50 µg/mL, se Tabellen for materiale) på en foretrukket celle tetthet. Bestemme cellen tetthet med en celle teller.
Merk: Vi belagt cellene på 25.000 celler/cover lysbildet. Denne teknikken tillater av både neurons og satellitt gliacellene. Komponenten glial co kultivert med pseudounipolar neurons spiller en avgjørende rolle for neuronal overlevelse.
3. HSV-1-infeksjon av DRG Explants og DRG-avledet dissosiert celler
Merk: Dette arbeidet ble gjort av strengt følge biosikkerhet nivå-2 (BSL-2) kravene som vi har en fullt utstyrt lab som er godkjent av Midwestern University biosafety utvalget. En KOS stamme av HSV-1 ble brukt i denne studien. Vennligst ta riktige mål og forholdsregler som lokale institusjoner retningslinjene hvis arbeider med viruset stammer.
- Finne og forberede viruset i de riktige fortynninger i SFM media å infisere modellen. Viruset brukt i denne studien var KOS stamme av HSV-1. Når du arbeider med DRG-avledet dissosiert celler, bruk 1 enhet av mangfoldet av infeksjon (MOI) for infeksjon, som betyr hvor mange virus lik antall celler.
- Hvis infisere DRG explants, bruke antallet virions (f.eks, 10.000 virions) fordi et nøyaktig antall celler i et explant ikke kan bestemmes.
- Plass explant/cellene er infisert av virus i et sterilt celle plate eller rør som inneholder en blanding av SFM medier og virus.
Merk: Vi brukte 25.000 virions for et dekke lysbilde som inneholder 25.000 celler (1 MOI). For å infisere en explant, bruker vi 10 000 virions. - Plass celle plate eller rør på 37 ° C for infeksjon å skje; viral eksponering kan variere avhengig av viral infectivity.
Merk: Viral oppføringen ble bekreftet ved hjelp av Orto-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) og 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) analyser26.
4. immunofluorescence
- Fikse explants og enkelt celle eksempler på 4% formalin i fosfat bufret saltvann (PBS). Vask prøver 3 ganger for 10 min hver i PBS.
- Inkuber prøvene med ønsket primære antistoffer (anti-β-tubulin, anti-peripherin, anti-heparan sulfate (HS), og/eller anti-glykoprotein D (gD) antistoff, se Tabellen for materiale fortynninger) fortynnet i PBS buffer med 0,3% Triton-X (PBST) og 10 % normal geit serum. Lagre prøver på 4 ° C over natten.
- Vask prøvene 3 ganger i 10 min hver med PBS. Inkuber samples ved romtemperatur 1t i riktig sekundære antistoffer (488 og/eller Cy3, se Tabellen for materiale for fortynninger) fortynnet i PBS.
- Vask prøvene 3 ganger i 10 min hver med PBS. Inkuber prøvene med Hoechst fargestoff (1,5 µM) i PBS for 20 min før montering trinn.
- Montere prøvene på glass lysbilder bruker fluorescens montering medium og dekkglassvæske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere aspekter av neuroplasticity og Nevron-miljø samspill kan undersøkes DRG og en enkeltcelle dissosiert kultur modell. Vi begynte studiene ved å isolere en DRG explant og DRG-avledet dissosiert celler som skjematisk representert i figur 1. Både vev og enkeltceller modeller kan analyseres ved hjelp av en rekke molekylær teknikker som immunofluorescence, Western blot, genomisk analyser og andre analytiske teknikker avhengig av eksperimentell design og mål. Først brukte vi vår DRG explant modell for å undersøke effekten av biokjemiske indikatorer på axonal vekst (figur 2). I dobbel eller trippel immunofluorescence, differensial uttrykk for peripherin (figur 2A, B, rød) og β-tubulin (figur 2A, B, grønn) ble bekreftet både de neuronal cellen legemer og eksterne neurite spirer. Cellen kjerner ble identifisert med Hoechst flekk (figur 2A, blå). Uttrykk for de nevnte merkene ble ytterligere analysert i hele DRG explant etter fiksering på 4% paraformaldehyde og mikrotomen-snitting (figur 3A). Resultatene bekrefter at peripherin og β-tubulin selektivt uttrykkes i to subpopulasjoner av ganglionic neurons med peripherin uttrykt i den "små, lette" og β-tubulin i de "store, mørke" subpopulasjoner av neurons, henholdsvis. Neurites immunolabeled med enten merket fremvoksende fra sensoriske neurons fant løpe gjennom hele ganglion før du avslutter i periferien. Hoechst flekken identifisert hovedsakelig posisjon i glial satellitt kjerner innenfor ganglion. Som vist i figur 3B, kan Nevron satellitt celle samspillet visualiseres bedre etter full celle dissosiasjon teknikken. Blå-farget satellitt celle kjerner ble sett rundt en β-tubulin-positiv sensoriske neuronal soma og dens omfattende neurites.
Vi ytterligere utnyttet DRG-avledet dissosiert cellene for å undersøke HSV-1-infeksjon og tilhørende betennelsesreaksjon i sensoriske neurons (Figur 4). Etter bare 1 h av stolpe infeksjon (pi), ble HSV-1 oppføring oppdaget ved hjelp av anti-HSV-1 gD antistoff både gliacellene (figur 4A) og DRG neurons (figur 4B). I tillegg ble HS flekker ytterligere gjennomført siden HS gir en docking nettsteder for virusvedlegg eller binding til verten celle. HS er kjent som en kritisk komponent i multifunksjonelle ekstracellulær matrix (ECM) og grundig dokumentert for å spille en viktig rolle i celleadhesjon celle til celle signalisering og ECM remodeling under sårheling, embryonale utvikling, kreft invasjon, fibrosis, og i neuroinflammation35,36. Interessant, observerte vi HS farging i ECM foreslå dens potensielle rolle i microenvironment som tillater axonal vekst (figur 4C). Til slutt, til β-tubulin farging vi brukte som en positiv markør for neurites å bekrefte integriteten til neurons.
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av det eksperimentelle DRG og enkelt celle kultur modeller. DRG ble isolert fra voksen NIH-SVEITSISKE mus, renset fra overdreven capsular bindevev, og enten explanted ex vivo som en hel explant eller avstand i primære co kulturer av sensoriske neurons og satellitt celler. Begge modellene kan brukes for videre analyser med flere analytiske teknikker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Utvikling av DRG organotypic kultur som en modell å undersøke axonal vekst. DRG vokst for 6 dager ex vivo ble brukt til å undersøke axonal spirende fra explant. Vi viser av immunofluorescence hvordan ulike biokjemiske forhold kan påvirke fordelingen av fiber spirer: voksende tilfeldig og uorganisert (A) sammenlignet med en mer lineær og velorganisert måte (B). Explants er merket med anti-β-Tubulin (grønn) og anti-peripherin (rød). Cellen kjerner er farget med Hoechst beis (blå). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Molekylær karakterisering av isolerte neuronal kultur modellen. Deler av det hele DRG var immunolabeled med antistoffer mot peripherin og β-tubulin viser selektiv uttrykk for de to markørene i to subpopulasjoner av ganglionic neurons. Peripherin (rød) er uttrykt i "små, lette" neurons og β-tubulin (grønn) er uttrykt i "store, mørke" neurons. Hoechst flekken identifisert hovedsakelig posisjon i glial satellitt kjerner innenfor ganglion (A). Nevron satellitt celle samspillet kan visualiseres bedre etter full cellen dissosiasjon teknikk (B). Her viser vi en β-tubulin-positiv sensoriske neuronal kropp og dens neurites omgitt av satellitt gliacellene (Hoechst: kjerner, blå). Skalere barer, A = 100 µm; B = 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Undersøkelse av HSV-1 oppføringen modellen i DRG-avledet dissosiert celler. HSV-1-infeksjon dissosiert satellitt celler avbildet langs β-tubulin-positiv neurites (grønn) avsløres med en anti-virus gD antistoff (rød). Satellitt gliacellene kjerner er farget blå med Hoechst (A). Samme antistoffer avslører viral oppføring i dissosiert DRG neurons (B). Cellene er co merket med et antistoff mot heparan sulfate (HS, grønn) uttrykt på cellemembranen. HS er også en del av den ekstracellulære matrisen (grønn) og spiller en viktig rolle for axonal vekst (C). Neurons er merket med peripherin (rød) mens Hoechst blå brukes til å identifisere satellitt cellens kjerner. Skalere barer = 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo DRG modellen er svært nyttig å undersøke et bredt spekter av hendelser som Nevron-glia interaksjon og effekten av microenvironment på begge neuronal og glial metabolisme37. Videre kan DRG-modellen brukes som et kostnadseffektivt verktøy for å løse spørsmål angående patogene mekanisme og tilknyttede indikatorer ved å utvikle ex vivo systemer for akutt kronisk og latente fasen av infeksjon eller i en bestemt sykdom. I tillegg utnytte en screening bibliotek av små molekyler i DRG explants denne explant modell for narkotika utvikling. In vitro modeller, spesielt encellede systemer, er ofte for enkelt å relatere til fysiologisk aktuelle hendelser; mens i vivo modeller er vanskelig å nøyaktig manipulere, delvis på grunn av immunforsvaret til skade, gliøst og kompleksiteten i omkringliggende ECM sammen med finansielle bekostning. Den DRG explant er derimot en organotypic kultur som lar ex vivo overføring av et hele organ med kompleksiteten i et nevrale nettverk, inkludert den ekstracellulære microenvironment som spiller en betydelig rolle i alle neuronal og glial funksjoner. Generering av en ex vivo modell kan bare ligner men ikke gjengjelde alle betingelser funnet i vivo. To viktige begrensninger å huske på når du bruker denne modellen er tidspunktet fravær av systemisk tilbakemeldinger, som kan bare virkelig representert i vivo. Den begrensede tiden som DRG kan opprettholdes viktig ex vivo gjør denne modellen mer egnet for akutt forhold og dermed ikke en veldig pålitelig modell for kroniske tilstander. Tilsvarende er ex vivo modellen ikke ideelt for studier som kan bli berørt av fravær av svar fra andre organer eller systemer (f.eks, immunsystemet).
Vi var med hell isolere den explant ex vivo DRG fra både voksne og embryo mus og rotter og bruke denne modellen undersøke HSV-1-infeksjon, samt flere andre aspekter av neuroplasticity og dens virkning på translasjonsforskning medisin. For å tillate sensoriske fibre å vokse utenfor explant, var connective omkringliggende kapselen delvis fjernet1.
For å bli vurdert, geléaktige protein blandingen utvunnet fra Engelbreth-Holm-sverm (EHS) musen sarcom isrich i ECM proteiner som laminin, kollagen IV, heparin sulfate proteoglycans (HSPG) og en rekke vekstfaktorer38. I denne protokollen, geléaktige protein blandingen fortynnes 1:1 med kultur medium og kunne danner for 30-60 minutter til 37 ° C før du legger det siste bindet av medium. Geléaktige protein blandingen polymerizes ved romtemperatur; Derfor er det foreslått for å avkjøle blandingen helt til explants er belagt og bruk kaldt pipette-spisser for å distribuere 10-20 µL faller på 12-vel retter. Timing er avgjørende for den endelige effektiviteten av kulturen prosedyren og kan variere avhengig av type (og produksjon) av geléaktige protein blandingen brukes. Hvis geléaktige protein blandingen ikke er fullt polymerized eller det er allerede styrket, kan explant flyte eller tørke ut fører til mislykket vekst. Vi oppfordrer etterforskerne å empirisk angir passende temperatur, tid og geléaktige protein blanding fortynning for en vellykket modell. Vi nådde en 55-70% effektivitet av vellykket vekst av DRG explants opprettholdt ex vivo for opp til 7-10 dager. Explant kan bli ytterligere atskilt i DRG-avledet primære sensoriske neurons og satellitt celler co kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke til avsløring.
Acknowledgments
Vi takker hjertelig Imaging core-anlegget på Midwestern University (MWU) og gruppen av elever [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo og Casey Sigerson] for deres bidrag i cellekultur og tenkelig arbeid. Dette forskningsarbeidet ble støttet av MWU'S Intramural gi finansiering MF og forskning oppstart penger til V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
