Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/56760
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2,3, 1,4,5
1Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 2Nanomedicine Science and Technology Center, Northeastern University, 3Department of Physics, Northeastern University, 4Departments of Bioengineering, Northeastern University, 5Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine

Summary

אנו מתארים שיטה של סינתזה ביולוגית חלקיקי זהב 10 ננומטר, functionalized על ידי ציפוי פולי-אתילן גליקול על גבי המשטח. חלקיקים אלה יכולים להיות בשימוש במבחנה , ויוו להעברת הרפוי לחללים הסלולר, חוץ-תאית ננו אשר קשות לגישה עם גדלים nanoparticle קונבנציונלי.

Abstract

חלקיקי זהב (AuNPs) נעשה שימוש נרחב במחקר רפואי שלהם גודל, הביו וכתוצאה לשינוי פני השטח. משלוח מיקוד וסמים הם חלק מהיישומים של אלה AuNPs, אבל מאפייני חומת הכביסה חלקיקים ספיגת של מטריצות חוץ-תאי אנדותל. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מתארים שיטה סינתזה של חלקיקי זהב ultrasmall לשפר את משלוח כלי הדם, עם קבוצות פונקציונליות להתאמה אישית, פולימר אורכי עבור התאמות נוספות. Nm התשואות 2.5 פרוטוקול AuNPs כי הם כתרים עם tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium כלוריד (THPC). החלפת THPC עם הטרו-פונקציונלי פוליאתילן גליקול (PEG) על פני השטח של AuNP מגדילה את הרדיוס hydrodynamic 10.5 nm תוך מתן קבוצות פונקציונליות שונות על פני השטח. החלק האחרון של הפרוטוקול כולל תוספת אופציונלית של fluorophore כדי לאפשר את AuNPs להיות דמיינו תחת קרינה פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר ספיגת ננו-חלקיק. דיאליזה lyophilization שימשו כדי לטהר ולבודד את AuNPs. חלקיקים אלה פלורסנט, ניתן לאבחן בניסויים גם בתוך vitro וגם ויוו בשל מסתיימים חוקרת פג ציפוי, פלורסנט. בנוסף, הטווח גודל של חלקיקים אלה יעבד אותם מועמדת אידיאלית עבור בודק את glycocalyx מבלי לשבש את פעולת הפונקציה להערכת נורמלי, אשר עלולה לגרום למצב הרפוי והספקת שיפור.

Introduction

חלקיקים הוחלו על תרופות והדמיה ביכולתה לנווט הגוף כדי להגיע אל היעד תחומי עניין1,2. החלקיקים שנצברים בתוך גידולים דרך להערכת דולף או בתרגום איפה ליגנד היעד overexpressed, חשוף. זהב, בפרט, הפך נפוץ ננו-חלקיק חומר בגלל שלה כימיים ופיזיים מאפיינים ייחודיים המשפיעים על התחבורה ושחרור של הרפוי3. זהב הוא יעיל ננו-חלקיק חומר כי פני השטח שלו יכול להיות שונה כדי לאגד תיולים ויש לו הביו גבוהה עקב שלה רעילות נמוכה4. AuNPs מסוגל להיות נשאים של סמים גדולה למערכות ביולוגיות, היו הצלחה בתחום אספקת פפטידים, חומצות גרעין וחלבונים, ומאפשר AuNPs לטובת פילוח2,4.

למרבה הצער, יעילות משלוח סמים nanoparticle יש כבר הקשו על ידי glycocalyx טעונים שלילית, זה המעיל חוץ-תאית על קרום תאי יונקים ביותר וכולל גודל הנקבוביות ננומטר עד 75,6. זה גודל הנקבוביות הוא קטן יותר מאשר רוב נושאות הסמים ננו-חלקיק, אשר יש קטרים אופייניים הנע בין 50-200 ננומטר. בתנאים המחלה, הנקבוביות כאלו glycocalyx שיפחת עקב השפלה, הגדלת חדירות דרך אל תאי אנדותל. עם זאת, רוב חלקיקים הם עדיין גדול מדי כדי לנצל את השינוי המבני ב glycocalyx. אחת של חוסר ההתאמה הזה גודל שהרמיזה כי חלקיקים בגודל כמקובל לא אינטראקציה בחיוב עם תאי אנדותל המרפדים את כלי הדם. זה משפיע על המסירה של חלקיקים מנוהל דרך הווריד לתוך אנדותל, יכול להיות גם אמר התחבורה חלקיק דרך דם מוח מחסום7,8,9,10.

גישה אחת כדי להתמודד עם בעיה זו היא לנצל חלקיקים קטנים יותר לעבור הנקבוביות קטן ב glycocalyx. כאן, אנחנו יוצרים של 10.5 nm ultrasmall זהב ננו-חלקיק, אשר בדרך כלל צריך להירתע ממחסור בתחום glycocalyx תקין, בריא. ברגע glycocalyx מתחיל להיות בסכנה, ננו-חלקיק צריך לחדור בקלות התאים דרך גודל הנקבוביות גדל והולך. פרוטוקול בעיתון הזה מפרט סינתזה של ultrasmall הליבה זהב מצופה פג, אשר מגביר את הביו ומפחיתה גישה מערכתית4. פג יכול גם להכיל מספר סוגים של קבוצות פונקציונליות, פתיחת אפיקים ההטיה של מיקוד ליגנדים fluorophores, הרפוי. בעבר תוצאות שפורסם עולה כי חלקיקים ultrasmall אלה נוטים שאפשר לקחת יותר בחיוב באזורים של פונקציה glycocalyx אנדותל שיבשו גם ללא פעילות מיקוד4,11. אפשרות זו מציינת את הכדאיות ואת החשיבות של ניצול חלקיקים בגודל הנכון עבור משלוח יישומים. הפרוטוקול הבא מציג הסינתזה, טיהור, אפיון AuNPs מצופים פג (פג-AuNP), עם הדיון תפירת קבוצות פונקציונליות של ההטיות עבור יישומים אחרים.

Protocol

1. הכנה או רכישה של מניות פתרונות (לאחסן בטמפרטורת החדר או קפוא עד לשימוש)

  1. הכן פתרון 1 מ' מניות הידרוקסיד הנתרן (NaOH) על ידי המסת 400 מ"ג NaOH 10 מ"ל מים הנדסה גנטית בטמפרטורת החדר ולאחר ערבוב החומרים היטב.
    הערה: הנדסה גנטית מים מוגדר מים ללא זיהומים כגון חלקיקים, חיידקים, nucleases, יונים או עקבות של אורגניקס. מערכת טיהור משמש כדי להשיג את המים הנדסה גנטית, וכתוצאה מכך שלה resistivity של mΩ·cm עד 18.2, המציין זיהום anionic נמוכה. לא מומלץ השימוש זמינים מסחרית בקבוקי מים הנדסה גנטית. מעתה ואילך, את המים הנדסה גנטית יכונו כמו מים, אלא אם צוין אחרת.
  2. להכין פתרון מניות של NaOH M על ידי המסת 2.4 g של NaOH ב- 10 מ"ל של מים, ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
  3. להכין פתרון מניות 250 מ מ של חומצה chloroauric (HAuCl4) על ידי המסת 1g של HAuCl מיובשים4 ב- 10.16 מ ל מים. למהול 1 מ"ל של 250 מ מ HAuCl4 עם 9 מ ל מים כדי להשיג ריכוז בעבודה של 25 מ מ HAuCl4. אחסן את הפתרון4 HAuCl בטמפרטורת החדר.
  4. הכן בופר קרבונט 0.1 M ב- pH 8.8, על ידי המסת 84 מ ג נתרן ביקרבונט במים 10 מ"ל והתאמה של ה-pH ל 8.8 על-ידי הוספת 6 M NaOH מ שלב 1.2. אחסן את המאגר קרבונט בטמפרטורת החדר.
  5. מערבבים את 20 מ של tetrazolium מורכבים, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium מלח (MTS), עם סוכן המייצבת, phenazine ethosulfate (פסי) (ראה טבלה של חומרים). אחסן את התערובת MTS/PES ב- aliquots (לכל היותר 10 מחזורים ההקפאה-הפשרה) ב-20 ° C בחושך.

2. סינתזה של הליבות זהב ננו-חלקיק

  1. להכין בתמיסה מדוללת של THPC על-ידי הוספת µL 12 של 80% THPC במים עד 1 מ"ל של מים בצינור microcentrifuge בטמפרטורת החדר.
  2. לאבטח בקבוקון התחתון עגול 100-mL במהלך במרכז צלחת מערבבים מגנטי. שופכים 45 מ של מים לתוך הבקבוק ומערבבים במים במהירות של 300 סל ד באמצעות בר קטן בצורת ביצה מערבבים מגנטי. להוסיף 0.5 מ"ל של 1 M NaOH ו- 1 מ"ל של פתרון THPC מדולל. להמשיך לבחוש את התערובת התגובה נמרצות במשך 5 דקות.
  3. ממשיכים לערבב את התערובת ולהוסיף 2 מ של 25 מ מ HAuCl4 פתרון. הצבע של התערובת ישתנה מצהוב עד חום כהה בתוך שניות, המציין שהיווצרות THPC הכתיר AuNPs עם מטען שלילי. מערבבים את התערובת למשך 15 דקות נוספות לאפשר היווצרות מלאה של הליבות זהב.

3. תוספת של פולימר בקורונה סביב חלקיקי זהב

  1. במהלך תקופת 15 דקות שמתואר בשלב 2.3, להכין יתד פתרונות על ידי המסת כל אחד מאלה במים 1 מ"ל ב- 4 mL מבחנות זכוכית: 30 מ"ג NH2-פג-SH; 7.5 מ"ג, m-פג-SH; 7.5 מ"ג COOH-פג-SH.
    הערה: הריכוזים שנוצר צריך להיות 8.8 M NH2-פג-SH, 3.75 מ' מ'-פג-SH ולאחר 3.75 מ' COOH-פג-SH.
  2. לאחר הפחתת מהירות מלהיב הפתרון ב. הבקבוק העגול התחתון כדי 100 סל"ד, הוסף שהפתרונות פג הפתרון של THPC הכתיר AuNPs dropwise. להמשיך לבחוש את התערובת בעדינות בין לילה, בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח הסרה יעילה של THPC והחלפה מאת פג.
  3. 72 ה הבא לשימוש 12-14 kDa משקל מולקולרי תאית הקיצוץ קרום כדי dialyze את התערובת מנוער נגד דלי 4 ליטרים של מים מנוער-60 סל ד. לקשור את הקצוות של הממברנות על-ידי דיאליזה קליפים ולהעביר את הפתרון באמצעות פיפטה.
    הערה: תהליך הדיאליזה זה עם קרום הקיצוץ kDa 12-14 רק מסיר פג unreacted THPC, אחרים כימית ריאגנטים, על ידי דיפוזיה לאורך מעבר הצבע ריכוז.
  4. כדי לשמור על הצבע ריכוז גבוה ולקדם דיפוזיה רציפה, להחליף את המים כל 2 h עבור ה 6 הראשון וכל 6-12 h עבור ה 66 הנותרים.
    הערה: המטרה של לוח זמנים זה שינוי מים היא להכיל פעפוע מהיר המתרחשת בהתחלה בגלל הריכוז הגבוה בתחילה בתוך המדגם. תהליך הדיאליזה שתוארו לעיל עלים הפתרון nanoparticle למחצה מטוהרים, כי חלקיקים, פוחת משקעים, אגרגטים, זיהומים גודל גדול אחרים אינם יכולים לעבור דרך הנקבוביות של 12-14 kDa הקיצוץ קרום.
  5. לסנן את הפתרון nanoparticle למחצה מטוהרים לתוך צינור חרוטי 50-mL באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm כדי להסיר את פוחת משקעים הנותרים, אגרגטים זיהומים גדולות אחרות.
  6. למקם את צינור חרוטי במקפיא-80 ° C ולאפשר את הפתרון PEGylated AuNP (פג-AuNP) מטוהרים ומקפיאים כ 5 שעות.
  7. השתמש הקפאה מייבש כדי lyophilize את פג-AuNP מטוהרים.
  8. לאחסן את יבש, מטוהרים פג-AuNP ב 4 ° C עד השימוש.

4. conjugating Fluorophores באמצעות N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר אל NH2 הקבוצות על פג-AuNP

  1. לאבטח בקבוקון תחתית עגולה 50-mL במהלך במרכז צלחת מערבבים מגנטי. למלא את הבקבוק עם 18 מיליליטר מים ומערבבים את המים ב 100 סל"ד באמצעות בר בצורת ביצה מערבבים מגנטי.
  2. שוקל 2 מ ג של פג-AuNP lyophilized צינור חרוטי 4 מ"ל, באמצעות סרגל benchtop ברמת דיוק גבוהה. להשתמש באקדח אנטי סטטי לחסל הסטטי והצמדות של האבקה פג-AuNP אל פני השטח צינור. להוסיף 2 מיליליטר מים ברכבת התחתית. שופכים 2 mL פג-AuNP פתרון לתוך הבקבוק העגול התחתון בשביל שיחזור נוסף בסכום של 20 מ ל מים. להמשיך לבחוש את התערובת על 100 סל"ד באמצעות בר בצורת ביצה מערבבים מגנטי.
  3. להוסיף 1 מ"ל של 0.1 M, pH 8.8 קרבונט מאגר 20 מ של AuNP משוקם הכלול הבקבוק העגול התחתון. המשך ערבוב.
  4. להוסיף 5 µL של 10 מ"ג/מ"ל פלורסנט NHS אסתר דימתיל סולפוקסיד.
    הערה: ניתן להשתמש בכל הפלורסנט בתהליך זה. מערבבים את פג פלורסנט בן לילה. שיהיה בטמפרטורת החדר ומכוסים בנייר כסף.
  5. 72 ה הבאה להסיר עודפי fluorophores באמצעות פרוטוקול שמתואר בשלב 3.3. בקצרה, dialyze את התערובת מנוער באמצעות דלי 4 ליטרים של מים, 12-14 kDa משקל מולקולרי תאית הקיצוץ קרום. להחליף את המים כל 2 h ל-6 הראשון h וכל 6-12 h עבור ה 66 הנותרים.
  6. להשיג 1 מ"ל של מטוהרים פלורסנט פג-AuNP הפתרון, שישמש עבור אפיון המתוארות להלן בסעיף 5. הקפאה של lyophilize הפתרון הנותרים כדי להשיג פלורסנט חלקיקים בצורת אבקת לאחסון ב 4 ° C, כמתואר בצעדים 3.5-3.7.
  7. השתמש במסנן מזרק 0.2 µm לחטא ולהסיר כל פוחת משקעים פוטנציאליים פעם מחדש עבור יישומים התרבות תאים.

5. אפיון של חלקיקי זהב PEGylated פלורסנט

  1. שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי להמחיש את ליבת nanoparticle זהב ולכמת את הגדלים
    1. ירידה µL 10 של הפתרון פג-AuNP פלורסנט מטוהרת על גבי רשת TEM פחמן מצופה רשת.
    2. לאחר 5 דקות, להשתמש פיסת נייר סינון כדי בקפידה לפתיל משם עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת TEM עד סרט המכיל את פלורסנט שפג-AuNPs נשאר מאחור.
    3. הצג את פג-AuNPs פלורסנט 80 kV, בהגדלה גדולה של 50,000-150, 000. צלם תמונות דיגיטליות.
      הערה: רק את הליבה זהב יהיה גלוי כי המקל אינה צפופה על TEM אלקטרון.
    4. באמצעות תוכנת מדידה, לקבוע קנה המידה מתאם לבר בקנה מידה. לחשב על הקוטר של ליבות זהב כ-20 ולאחר מכן לקבוע את קוטר ממוצע הליבה זהב.
      הערה: מערכת ההדמייה TEM באופן אוטומטי ממקם בר בקנה מידה תמונות דיגיטליות.
  2. מדידה של גודל ננו-חלקיק hydrodynamic באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS)
    1. העברת 1 מ ג של AuNPs מצופים THPC lyophilized לתוך צינור microcentrifuge באמצעות גישה שמתואר בשלב 4.2. העברת 1 מ ג של lyophilized פג-AuNP בשפופרת נפרדים. להוסיף 1 מ"ל של מים כל שפופרת ולהעביר כל פתרון AuNP 1 מ"ל פלסטיק שקוף.
    2. למקם את cuvette מכשיר DLS ומדידת כדורית קטרים hydrodynamic באמצעות תוכנה מנתח חלקיק זה מובנה בתוך המערכת DLS.
    3. העלילה על הקוטר hydrodynamic נמדד באמצעות תבנית היסטוגרמה.
      הערה: ההיסטוגרמה יקבץ חלקיקים לפי גודל. הקבוצה הגדולה ביותר של חלקיקים נבאר את הקוטר המתארת בצורה הטובה ביותר לגודל AuNPs מסונתז פרוטוקול זה.
  3. אישור fluorometric קרינה פלואורסצנטית
    הערה: המדגם אותו ואת cuvette מהשלב 5.2 יכול לשמש כדי למדוד את האות פלורסנט.
    1. להסיר את cuvette DLS והכנס לתוך מצלמות-דיגיטליות. קבע אורך הגל של עירור 633 ננומטר, לקריאה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט אותות לאורך טווח אורך הגל של 650-800 ננומטר.
    2. מאשרים כי השיא הוא כ 665 ננומטר, לאפקטים הפסגה פליטה עבור NHS.
      הערה: להתאים את אורכי הגל עירור, פליטה לפי fluorophore המשמשים בתהליך.
  4. MTS assay11 כדי להעריך את הביו
    1. בתרבות התחתון 96-ובכן ברור סטרילי רקמות טיפול צלחת, פיפטה µL 100 ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM; בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ו- 3.2 x 103 תאים בכל טוב.
      הערה: במחקר זה, תאי אנדותל fat pad עכברים משמשים. סך של 21 הבארות משמשים כדי לאפשר משכפל 3 עבור כל אחד הריכוזים nanoparticle שונים 7 (ראה שלב 5.4.3 ריכוזי עניין ספציפי).
    2. מאפשרים לתאים לגדול confluency ב לחות ו-5% CO2 נשלט חממות ב 37 ° C11.
    3. . הכן טורפדו microcentrifuge נפרדים, שכל אחד מהם מכיל 300 µL של DMEM עם חלקיקים של ריכוזים שונים. מחקר זה דורש 7 צינורות שונים של DMEM עם ריכוז פג-AuNP הבאים: 0 µg/mL 10 µg/mL, µg 50/mL, µg 100/mL, µg 250/mL, 500 µg/mL, 1,000 µg/mL.
    4. מחוק לגמרי את DMEM באמצעות הרכבת התחתית. למלא את בארות שהפקידים 100 µL של התקשורת DMEM המכיל 0, 10, 50, 100, 250, 500 או 1000 µg/mL של AuNP.
    5. לאפשר את התאים ואת חלקיקים כדי שיתוף תקופת דגירה של אורך זמן, אני פה בשביל 16 h שנקבע מראש.
    6. לקראת סוף תקופת הדגירה, להפשיר את התערובת MTS/PES מהשלב 1.5.
    7. לאחר דגירה, וארוקן את DMEM, על תנאי, מצורף באופן רופף חלקיקים מן הבארות. להוסיף 100 µL של DMEM טריים יחד עם 20 µL של MTS/PES פתרון כדי לקבל 1:5 MTS/PES ליחס DMEM לפי הפרוטוקול של היצרן. דגירה התאים עם MTS/PES ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      הערה: זה זמן הדגירה 2 h נקבעת על-ידי פעילות חילוף החומרים של תאי אנדותל, ניתן להגדיל עד עד 4 שעות עבור סוגי תאים אחרים. בתוך תקופת 2 h, MTS עובר מטבוליזם על ידי תאי אנדותל לתוך צבעוניים formazan זה מתערבב עם DMEM. התאימות של פג-AuNP ועל הסבירות תא הכדאיות תודגמנה עם formazan יותר צבעוניים. רעילות של פג-AuNP, את הסיכוי כי התאים מתים יוצגו בצבע פחות אינטנסיבי.
    8. לבצע ניתוח ערכי צבע מוחלטים של כל טוב על-ידי קריאת ספיגת-492 nm בקורא צלחת תואמת.
    9. עבור כל ריכוז ננו-חלקיק, לחשב את ספיגת הממוצע של ספיגת triplicate ערכים. לחלק את ספיגת ממוצע לפי הערך המתקבל ממוצע של ספיגת בבארות המכיל חלקיקים µg/mL 0.
      הערה: הבארות הללו מכילים AuNPs אין לשמש פקדי חישוב אחוז הכדאיות תא בתגובה nanoparticle טיפול מנוהל בבארות אחרים.
  5. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הערכה של ספיגת ננו-חלקיק בתאי האנדותל חסיד עם glycocalyx תקין או לקוי11
    1. זרע 1.0 x 104 תאים/cm2 עכברוש שמן פאד תאי אנדותל על coverslips זכוכית סטריליים 12 מ"מ דקה ולהאכיל תאים עם DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. מאפשרים לתאים לגדול confluency מלא לחות ו CO2 נשלט חממות ב 37 מעלות צלזיוס, במשך כ- 3 ימים.
    2. להוסיף טיפולים כדי לשנות את glycocalyx, אם הדבר ישים. לדוגמה, טיפול h 2 תאי אנדותל תרבותי עם 2.5 x 10-6 IU heparinase השלישי אנזים מבזה את glycocalyx באמצעות רכיב סולפט שלה הפאראן בבועיות במיוחד.
      הערה: שניתן למדל glycocalyx בריא על ידי גידול תאי אנדותל כפי שמתואר בשלב 5.5.1 ללא התוספת של אנזימים השפלה.
    3. עם glycocalyx אנדותל נותר שלם או עיבוד לקוי, דגירה תאי אנדותל עם פלורסנט AuNPs µg 550/mL עבור 16 h או אחרים הזמן הרצויים.
    4. לשטוף בעדינות את התאים עם 2 מ של 37 ° C 1% שור אלבומין בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS; המכיל 100 מ ג/ליטר סידן ומגנזיום 100 mg/L). להטביע התאים 2 מ של paraformaldehyde 2% ו- 0.1% גלוטראלדהיד ב- PBS, ולאפשר את התאים לתקן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. להסיר את הפתרון תיקון אלדהיד ולשטוף את התאים עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 5-מין.
    6. לפני יישום נוגדן ראשוני, לחשוף תאי אנדותל כדי סרום עז 2% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים. תאים חייב להיות מכוסה לגמרי לפי הפתרון חסימה.
    7. דגירה תאי אנדותל בין לילה עם 1% אנטי-הפאראן גופרתי העיקרי נוגדנים בסרום עז 2% ב- PBS ב 4 ° C כדי להדביק תווית הרכיב הפאראן גופרתי glycocalyx. ודא התאים קבוע מלא בקשר עם הפתרון נוגדן.
    8. למחרת, לשטוף הנוגדן עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 10 דקות.
    9. דגירה תאי אנדותל עם 1:1,000 דילול של הנוגדן המתאים משני פלורסנט למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כהה או מכוסה ברדיד אלומיניום.
    10. לשטוף את הנוגדן משני עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 10 דקות.
    11. לטעון את coverslip על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות של אנטי-עמעום הרכבה בינונית המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי) עבור גרעינים מכתים. לאטום את הקצוות של coverslip באמצעות לק.
    12. התמונה תא אנדותל immunostained פלורסנט דוגם עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות ערוצי כחול, ירוק ואדום רחוק כדי להמחיש את הגרעינים הפאראן גופרתי glycocalyx, חלקיקים, בהתאמה.

Representative Results

AuNPs מסונתז, מצופה THPC או PEG (איור 1A ו איור 1B, בהתאמה), הם צילמו TEM, החלקיקים גדלים נמדדים באמצעות TEM DLS כדי להבטיח הפצה גודל nanoparticle נאותה. איור 2 מציג את תמונת TEM של מדגם THPC-AuNP-80 kV והגדלה x 150,000. הקוטר של הטווח חלקיקים THPC-AuNP מ- 2-3 ננומטר, בהתבסס על הבר כיול בתמונות TEM. גודל THPC-AuNP זה מתבטא גם DLS גודל מדידה היסטוגרמה המוצגת באיור2, בעוד אשר מצופה THPC AuNP זה הראו שיש לשיא על 2.5 ננומטר. PEGylation אינה מוצגת תחת TEM פולימרים אינם אלקטרון צפופה. TEM הדמיה של דגימות פג-AuNP פשוט מאשרת את הנוכחות של חלקיקים התפזרו בודדים, אשר צפוי כי פג פולימר בקורונה סביב חלקיקים לסייע במניעה של מצבור. לדוגמאות האלה פג-AuNP ', ההיסטוגרמה מדידה גודל DLS מציגה משמרת בהפסגה, כדי כ 10.5 ננומטר על DLS. קבצים מצורפים של ליגנדים או הסמים אל קבוצות פונקציונליות נוספת תשפיע על גודל ננו-חלקיק גם כן, צריכים להילקח בחשבון כאשר מודדים את הקוטר.

תוספת fluorophore (איור 1C) אושר על ידי שימוש fluorometer כדי למדוד קרינה פלואורסצנטית אות מתוך מדגם של חלקיקים, כפי שמוצג באיור3. כשהוא מתרגש עם אורך גל של 633 ננומטר, הפליטה נמדד יש לכל היותר בין nm 660, 672, אשר תואם את מידע המוצר של היצרן של פליטת מרבית-665 ננומטר. מצורף של הגששים פלורסנט אחרים צריך להיבדק באופן דומה כדי להבטיח תגובה פלורסנט.

התאימות של חלקיקים, הכדאיות תא קשורים הם העריכו באמצעות וזמינותו MTS כדי לבדוק את מטבוליזם התא היחסי של MTS לאחר דגירה 16 h עם ריכוזים שונים של חלקיקים. Fluorophore PEGylated AuNPs מצומדת מראה לא רעילות משמעותית, כפי שמציין את רמות דומות של התא הכדאיות בריכוזים כל עד 1 מ"ג/מ"ל (איור 4A). הביו זו עשויים להשתנות בהתאם את טיפולית או של ליגנד המצורפת של קבוצות פונקציונליות הנותרים להמשיך ולהתאים אישית את החלקיקים. קבצים מצורפים סמים נוטות להגביר רעילות, אך בהתאם ריכוז העבודה, היא לא משפיעה על הכדאיות באופן משמעותי.

ספיגת של פלורסנט, PEGylated AuNPs (איור 1C) על ידי תאים חסיד מוערך באמצעות fat pad עכברוש בתרבית תאי אנדותל עם glycocalyx תקין או לקוי (איור 4B). התנאים glycocalyx לקוי מושגות על ידי הוספת האנזים השלישי heparinase לתרבות, וכתוצאה מכך הפירוק של הרכיב glycocalyx הפאראן גופרתי להתפשר על מטריצה12. איור 4B מראה רמות שונות של ספיגת של פג-AuNPs, כמו נקודות אדומות על תצוגת חתך הרוחב של תאי אנדותל נציג. Glycocalyx בריא מרתיעה קליטת חלקיקי זהב אלה, אך משמעותית נוצרת כאשר האנזים הוא מועסק11. תוצאה זו מדגיש את הפוטנציאל של חלקיקים ultrasmall הללו כדי לספק הרפוי לתאי אנדותל באופן מבוקר על ידי אינטראקציות שונות המבוססות על בריאות glycocalyx.

Figure 1
איור 1: שרטוט nanoparticle זהב- THPC (א) מצופה AuNP nanosphere לפני החלפת פג. PEGylated AuNP (B) עם 3 סוגים של הפסקות פג, כולל COOH, NH2ו- CH3. גלים כחולים מייצגים הפולימר. (ג) מצומדת חלקיקים עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה. כוכבים אדומים מראים את fluorophores מצומדת כדי NH2 קבוצות פונקציונליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גודל המידות של חלקיקי זהב- משמאל: TEM של חלקיקי זהב לפני תוספת של פג 80 kV, 150,000 X הגדלה, עם סרגל קנה מידה המוצג. מימין: היסטוגרמה של גודל ננו-חלקיק נמדדת DLS בעבר (AuNP) ואחרי (פג-AuNP) THPC החלפת עם פג. תוצאות DLS מצופים THPC AuNP לכמת מה הוא מדמיין מאת TEM. התוצאות מצופים DLS פג AuNP להתגבר על האתגר של חוסר היכולת לדמיין פג על ידי TEM עקב פולימרים לא להיות אלקטרונים צפופה. TEM של פג-AuNP יציג רק את הליבה זהב חלקיקים, נראה כמו AuNP THPC הכתיר אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נתוני קרינה פלואורסצנטית של פלורסנט פג-AuNP. הפסגה פלורסצנטיות במגרש nm 667 הפליטה של fluorophore מצומדת כדי פג-AuNP. א א: יחידות שרירותיות.

Figure 4
איור 4: תא אינטראקציות עם פלורסנט פג-AuNP. (א) תא הכדאיות (MTS מטבוליזם) העלילה עכברוש שמן. פאד תאי אנדותל לאחר דגירה שיתוף 16 h עם פג פלורסנט-AuNP. (B) תמונות חתך הרוחב קונאפוקלית של עכברוש קבוע שומן פאד תאי אנדותל צבעונית עם דאפי גרעינים (כחול), נוגדנים נגד הפאראן גופרתי, רכיב glycocalyx (ירוק). תמונה עליונה glycocalyx בריא והוא התחתון שכבה מפורק glycocalyx; יש יותר משמעותית פלואורסצנטי אדום של חלקיקים במדגם עם glycocalyx מפורק. סולם בר הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

טכניקה זו היא שיטה יעילה עבור סינתזה להתאמה אישית, שפג ultrasmall מצופה AuNPs. חלק חשוב של הליך זה הוא שהיווצרות ראשונית של THPC הכתיר זהב חלקיקים, אשר יכול להיות מאושרות על ידי שינוי הצבע של צהוב חום זה יתרחש לאחר HAuCl4 נוספה מתוכן הבקבוק העגול התחתון (פרוטוקול שלב 2.3). אין שינוי צבע מציין כי ישנם חלקיקים לא נוצר, כי השלבים הראשונים צריך להיות בדק וחזר לפני שתמשיך. במקרה שהצבע משתנה למשהו שאינו חום כגון יין אדום או אפור, חלקיקי שנוצר כנראה לא אהיה בסביבה. יעד 2.5 ננומטר, אוסף חדש צריך להיות עשוי גם כן.

לאחר היווצרות הליבה זהב, חילופי THPC פג, ההליכים טיהור להכיל מספר שלבים מרכזיים על סיומו המוצלח של הפרוטוקול. ערבוב בין לילה מאפשרת התגובה החלפת ללכת עד לסיומו. טיהור שנכשל יכול להתרחש אם המים דיאליזה לא משתנה עם התדירות שנקבעה. צבירת והמשקעים של חלקיקי יכול להתרחש גם אם החלקיקים נותרו בדיאליזה עבור יותר מ- 72 h. בעיות פוטנציאליות אחרות יכול להיות שנצפו במהלך להקפיא ייבוש. אם המקל ultrasmall מצופה AuNP פתרון לא הוקפא לגמרי או אם איזה שהוא לופילייזר לא הוגדר כראוי, דגימות יאבדו. עיין במדריך איזה שהוא לופילייזר, כמו ציוד מחייבים הכנות דגימה שונים.

הקלות של סינתזה, את התאימות של חלקיקי שנוצר מייצגים יתרונות לשימוש האלה פג-AuNPs. בנוסף, חלקיקים אלה יש את היתרון של להיות מסוגל לקיים אינטראקציה עם מבנים הסלולר הננומטרי כפי שמתואר על ידי היכולת לזהות glycocalyx מפורק על ידי ספיגת של חלקיקים אלה. יתרון זה, ניתן למנף לפיתוח טיפולים חדשים טרשת עורקים, אמצעי מניעה מעבר מה אנחנו here, יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי זה מאפשר התאמה אישית נרחבת של החלקיקים וכן גוברות יציבות ויכולות אחסון על-ידי הצמדת תיול המכיל פג על גבי חלקיקי זהב4. בקצה השני של הרשת פג יכול להכיל כל קבוצה פונקציונלית, מספר עצום של מולקולות יכול להיות מצומדת לקבוצות אלו. ב פרוטוקול זה, מחוברים כל קבוצות פונקציונליות שלושה נפוצים (מתיל, carboxyl, ואמינו). היחס של המקל הוא נבחר כדי לקבוע עדיפויות זיהוי פלורסנט תחילה, ולאחר מכן את היכולת לשלב moiety מיקוד משנית עם שימוש בקבוצה חומצה קרבוקסילית. היחס של קבוצות אלה יכולים להיות צבט מבוססת על היישום, אורכי והצורות של פולימרים יכול להיות מותאם גם כן.

כדי למדוד חלקיק ספיגת, אנחנו מצומדת בדיקה פלורסנט לאחת הקבוצות פונקציונלית. יצוין, כי כל נטיה מעבר מה שתיארנו וכתוצאה מכך שינוי של מאפייני משטח של ננו-חלקיק. בכל איטרציה של חלקיקים לגבי רכיבים נוספים ותגובות ההטיה צריך להיבדק את המאפיינים הרצויים.

שיטה זו מייצרת ultrasmall חלקיקי זהב שנועדו להתגבר על מאפייני חומת glycocalyx חוץ-תאי אנדותל, ומחבלים ספיגת של חלקיקים בגודל כמקובל. עם זאת, גודל קטן משאיל הקושי הדמיה והן סמים טעינת היבט. החלקיקים קטנים משמעותית הטווח בגודל ננו-חלקיק טיפוסי, כתוצאה מכך שטח זמין עבור קבצים מצורפים של הרפוי והיעדים moieties הוא קטן באופן משמעותי. זה עלול להוביל קושי קולט אותות נפרדים בהדמיה יישומים, למרות אשכולות של חלקיקים עדיין ניתן בקלות לזהות, כפי שמוצג בתמונות קונפוקלי. פני השטח מופחת עבור קבצים מצורפים של מיקוד הרפוי של ליגנדים עשויים לדרוש יותר חלקיקים כדי להיות מנוהל על מנת להשיג יעד המינון דרישות. עם זאת, החלקיקים קטן יותר יהיה יעיל יותר במשלוח כאשר לוקחים את glycocalyx בחשבון.

חלקיקי ultrasmall הרומן האלה מסוגלים משלוח לתוך קשה הננומטרי אזורים בתוך הגוף, עם הפרעה מזערית של microenvironment. התוספת של יתדות מאפשר הביו מוגברת ומציע קבוצות פונקציונליות עבור התאמה אישית כבד של החלקיקים לאפליקציות מגוונות. גודל קטן יותר בהשוואה חלקיקים טיפוסי מגיע עם כמה חסרונות, אבל אם פיתח אסטרטגית, החלקיק ultrasmall בגישה מבטיח אירוח הקשים לחדור, glycocalyx הסבוך, שברירית בתוך כלי הדם משלוח מיקוד וסמים.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה ע י מחלקת הנדסה כימית באוניברסיטת הצפוני-מזרחי, ראשונית, מענק לימודים מהשכבה טייס 1 מן Office הצפון־מזרחי של פרווסט אוניברסיטת, NIH K01 HL125499, אכ מ- IGERT הענק NSF/DGE-096843. המחברים רוצה גם להודות תומאס ג'יי וובסטר והחבר שלו מעבדה עבור סיוע שלהם וכן ננו-רפואה, מדע, טכנולוגיה במרכז, פרמצבטיקה ומדעים פלנטריים אוניברסיטת נורת'איסטרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) Sigma Aldrich 520918
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride Sigma Aldrich 404861
Mono-functional mPEG-thiol Layson Bio Inc. MPEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol Layson Bio Inc. NH2-PEG-SH-3400-1g Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol Layson Bio Inc. CM-PEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) Sigma Aldrich D9777
Zerostat anti-static instrument Sigma Aldrich Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester Fisher A20006 Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade Thermo Fisher Scientific 09-801-B
Transmission electron microscopy JEOL USA JEOL JEM-1000 TEM
Dynamic Light Scattering Brookhaven Instruments Corporation Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer DLS
Fluorometer Horiba Scientific Jobin Yvon Fluromax 4 Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582 MTS
Plate reader Molecular Devices SpectraMax M4 Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) Amsbio 370255 Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) Thermo Fisher Scientific R37120 Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1000 With DAPI
Confocal Microscope Carl Zeiss Meditex AG Zeiss LSM 700 Confocol microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
  2. Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
  3. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  4. Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
  5. Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
  6. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
  7. Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
  8. Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
  9. Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
  10. Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
  11. Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
  12. Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).

Tags

Bioengineering גיליון 131 חלקיקי זהב ultrasmall PEGylation ההטיה משטח glycocalyx משלוח סמים תאי אנדותל
סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, M. J., Prabakaran, P., Kumar, … More

Cheng, M. J., Prabakaran, P., Kumar, R., Sridhar, S., Ebong, E. E. Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery. J. Vis. Exp. (131), e56760, doi:10.3791/56760 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter