Summary
这种新开发的荧光技术能够长期监测自由运动小鼠视交叉上核 (SCN) 中昼夜节律基因的转录。
Abstract
该技术将光纤介导荧光记录与重组腺相关病毒基因记者的精确交付结合在一起。这种新的和易于使用的体内荧光监测系统, 以记录的转录节律的时钟基因, Cry1, 在视交叉上核 (SCN) 的自由移动小鼠。为此, Cry1转录荧光报告器被设计和包装成腺相关病毒。纯化, 浓缩病毒注射到小鼠的 SCN, 然后插入一根光纤, 然后固定在大脑的表面上。这些动物被送回自己的笼子, 并允许1月的手术后恢复期, 以确保足够的记者表达。荧光然后记录在自由移动的小鼠通过体内监测系统, 在我们的机构建设。在体内记录系统中, 488 nm 激光与 1 x 4 光束分配器耦合, 将光分成四个同等功率的激光励磁输出。这个设置使我们能够同时记录四动物。每个发射的荧光信号都是通过光电倍增管和数据采集卡收集的。与先前的活体生物钟记录技术的生物发光相比, 这种荧光体内记录系统允许在光周期中记录生物钟基因的表达。
Introduction
在哺乳动物中, 视交叉上核 (SCN) 支配着整个身体的昼夜节律, 以协调个体对外部环境变化的反应 (如光照、温度、压力等)1。核心时钟组件由Per1-3、 Cry1-2、时钟和Bmal1组成, 在调节每个细胞的昼夜节律时起着中枢作用。每个细胞在 SCN 包含转录激活剂, CLOCK/BMAL1, 作为一个 heterodimer, 以诱导表达的每和哭。每/哭复合, 然后抑制 CLOCK/BMAL1 的功能, 形成一个转录转换反馈回路, 约24小时完成2,3。
以往对 scn 的研究主要采用了前体4、5、6的体外营养切片培养方法, 虽然这种方法提供了有价值的信息, 但它的局限性抑制了我们获取有关其他脑核对 SCN 的影响的数据, 以及外源性刺激 (如光照) 对居住在这个关键区域的细胞的影响。在 2001年, 仁冈村的组是第一个使用生物发光系统在体内监测昼夜节律基因表达的 SCN 在自由移动小鼠7。肯-本间的小组在过去几年里进一步开发了生物荧光在体内记录系统在 SCN8,9,10。这些研究共同为研究人员提供了在恒定的黑暗或光脉冲后监测生物钟的能力。然而, 由于生物发光太暗, 无法在光/暗循环期间进行连续监测, 加上光是11昼夜节律性时钟所需的主要信号, 因此有不断增加的需求, 开发的实验方法, 克服了与生物发光记录相关的限制。本报告描述了一种基于荧光的系统, 用于监测自由移动小鼠体内的 SCN 生物钟。这种易于使用的方法允许在光/暗循环期间进行连续监测, 并允许在实时和高时间分辨率下长期观察 SCN 中生物钟基因的转录。
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Protocol
本议定书的所有程序都是根据中国政府条例在北京国家生物科学研究所的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准下进行的。
1. Cry1荧光记者的构建
注: 先前的昼夜节律研究使用生物发光系统2,12,13融合一个昼夜启动器与不稳定的荧光素酶 (dLuc), 以诱导有节奏的dLuc表达。为了开发荧光记者, 不稳定的荧光素酶取代了不稳定的萤光蛋白 (dVenus), 以诱导韵律dVenus表达。P (Cry1) d金星记者的世代被描述如下, 它的结构当前被递交到 Addgene 并且将很快是可利用的为学术用途。
- 放大功能小鼠Cry1启动子 (+ 328 到-1208 Cry1基因的 bp 区域, 转录起始点被指定为 "-1")。使用 pcr 酶 (点歌加新), 引物 F1 和 R1 (见表 2), 小鼠基因组作为模板和制造商的 PCR 协议, 以放大Cry1启动子 DNA 片段。
- 放大Cry1基因的内含子 336, 这对于Cry114的昼夜节律功能是重要的。使用 pcr 酶, 引物 F2 和 R2, 小鼠基因组作为模板和制造商的 PCR 协议, 以放大内含物 336 DNA 片段。
- 放大金星。以 pcr 酶、引物 F3 和 R3、pVENUS-N1 质粒为模板, 并利用制造商的 pcr 协议放大金星DNA 片段。
- 放大 NLS-D2 DNA 片段。以 pcr 酶、引物 F4 和 R4、pcDNA3.3-d2eGFP 质粒为模板, 并利用制造商的 pcr 协议对 NLS-D2 DNA 片段进行放大。
- 合成 DNA 片段1作为外显子1。
- 将 dna 片段2合成为内含子336与金星dna 片段之间的链接器。
- 用 mCherry 和 WPRE 酶切 pAAV-EF1a-double floxed-hChR2 (H134R)-HGHpA-MluI-EcoRI 载体质粒。使用凝胶萃取试剂盒净化较大的 DNA 片段。使用制造商的协议。
- 使用吉布森装配组合及其标准协议, 组装所有的 DNA 片段一起生产 pAAV (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA 记者。使用制造商的协议。
2. 腺相关病毒的生产15
- 制备以下质粒 DNA 储存: 31.25 µg pRV1、pH21 31.25 µg、µg 125 pFdelta6 和µg-P (pAAV) Cry1 intron336-Venus-NLS 的 62.5 D2-WPRE-HGHpA。
- 准备五15厘米293T 细胞的盘子, 等到细胞变成90% 汇合。
- 染的质粒进入297T 细胞后转染试剂协议。对于每道菜, 使用6.25 µg 的 pRV1, 6.25 µg pH21, 25 µg pFdelta6, 12.5 µg 的 pAAV P (Cry1) intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 120 µL 的转染试剂。
- 72 h 在转染后, 用吸管枪将每个盘子中的细胞分离出来;将细胞分成两个50毫升的试管。
- 将细胞以 800 x g 为10分钟, 然后丢弃上清。将20毫升磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 放入每管中冲洗细胞;将细胞以 800 x g 为10分钟, 并丢弃上清。
- 并用重悬颗粒在150毫米氯化钠和20毫米三溶液, pH 8.0;使用25毫升的溶液/管。在每管中加入1.25 毫升新鲜制备的10% 脱氧钠 (dH2O)。添加 benzonase 核酸酶到最终浓度为每毫升50单位, 并彻底混合。孵育37°c 为1小时。
- 用 3000 x g 离心15分钟, 去除细胞碎片。通过0.45 微米注射器过滤器, 进一步确保所有碎片被去除;这一步骤将有助于防止肝素柱堵塞。
- 用蠕动泵建立肝素柱;将流量设置为1毫升/分钟, 确保不会将气泡引入列中。
- 平衡柱与10毫升的150毫米氯化钠, 20 毫米三溶液, pH 值8.0。将包含病毒的解决方案添加到每一列。用20毫升的100毫米氯化钠, 20 毫米三溶液, pH 8.0 来洗涤柱。然后, 使用5毫升注射器, 用1毫升的200毫米氯化钠和20毫米三溶液 pH 值8.0 来冲洗柱, 接着是1毫升氯化钠和300毫米三溶液, pH 20。
- 使用5毫升注射器洗脱的病毒与3毫升的400毫米氯化钠, 20 毫米三溶液, pH 8.0, 其次是4毫升的一个450毫米氯化钠, 20 毫米三溶液, pH 8.0, 最后由 3 ml 的500毫米氯化钠, 20 毫米三溶液, pH 值8.0。收集提取的材料。
- 对于重组腺相关病毒 (rAAV) 浓度, 加载提取的材料, 每次4毫升, 进入离心过滤器单位的10万分子量截止。在室温下离心每4毫升样品 2000 x 克, 以5分钟的温度, 丢弃流经。
- 当所有提取的材料都经过离心过滤单元, 加入4毫升的 PBS 和离心机的混合物约 250 ul。去除 rAAVs (病毒滴度应该是大约 2-8 x 1012病毒微粒每毫升) 从离心过滤器单位, 整除并且存放在-80 °c 直到使用。在这个阶段, 病毒可以储存几个月。
3. rAAV 注射和光纤插入成年小鼠 SCN
- rAAVs 的昼夜荧光报告携带者注射入 SCN
- 负载5µL 的 rAAV (病毒滴度是大约 2-8 x 1012病毒粒子每毫升) 成一个微型注射器。
- 麻醉一只成年老鼠 (2-5 月大, C57BL/6 背景) 与戊巴比妥 (80 毫克/千克) 通过腹腔注射。检查是否有足够的麻醉深度, 因为没有脚趾捏的反应。
- 使用剪刀从鼠标头上取出皮毛, 然后将鼠标装入立体定向设备。通过循环热水毯或另一种加热装置, 为麻醉动物提供热源。
注: 或者, 使用脱毛奶油或电剪剪去去除毛皮。 - 用适当的消毒剂清洁手术部位。例如, 这可能包括无菌水或酒精和碘, betadine, 或稀释洗必泰在交替磨砂。重复至少3次。把手术部位悬垂起来。
- 用剪刀在头皮上做个切口, 露出头骨。
- 调整立体定向装置, 使 bregma 和 lambda 在同一水平平面上;将两个对称点 bregma 在同一水平平面上。
- 用不育的棉签浸泡在4% 小时2o2/小时2o 腐蚀脑骨膜。然后使用干净, 不育的棉签清除和干燥头骨表面。
- 使用微钻, 使一个孔约1毫米直径0.46 毫米后, 0.25 毫米侧向 bregma。
- fi使用干净的棉花消毒拭子与生理盐水溶液清除骨碎片从暴露的表面的大脑。
- 将微型注射器插入大脑, 确保微注射器的尖端是0.46 毫米后部和0.25 毫米侧向 bregma, 5.7 毫米深的头骨表面。
- 注入 500 rAAV (50 nl 分钟-1) 进入 SCN, 留下微注射器到位10分钟后注射, 以确保完全扩散的 rAAV。
- 慢慢地取出微注射器。
- 将光纤插入 SCN 区域。
- 使用光纤刀, 在长度上切割17毫米光纤, 确保光纤的每一侧都是平滑的。
- 将光纤插入陶瓷插针中, 并将光纤固定在带有甲基乙基酮过氧化物 (AB 胶) 的陶瓷箍上, 确保光纤和陶瓷插针的表面是冲洗的。
- 用冷消毒剂溶液或环氧乙烷清洗纤维。
- rAAV 注射 (步骤 3.1.11) 后, 将陶瓷插箍光纤插入 SCN。
- 用牙科树脂将陶瓷插针和光纤固定在头骨上, 使其干燥。
- 用后指甲油涂抹牙科树脂的表面。重复3.1.2 中概述的步骤 3.2.5, 省略实际注入 rAAV 控制。
- 术后护理
- 为小鼠提供术后镇痛药, 如丁丙诺啡2毫克/千克体重, 一天两次。
- 把老鼠放在康复笼里, 当他们从麻醉中出来的时候。
- 小鼠单独在12小时的光/暗条件下 (光强度约100莱克丝在笼子底部) 与食物/水可用的广告随意。在进一步试验前, 应分配八天时间, 以便能有足够的恢复期, 并确保最佳荧光报告的表达。
4.体内荧光信号监测和数据采集
- 手术后八天, 用荧光信号监测器将鼠标头上的纤维连接起来(例如, 基因观察者)。检查控制鼠的 SCN 中的荧光信号, 建立背景信号。利用荧光信号监测仪对该信号进行观测和测量。
- 用控制鼠标的相同操作对实验小鼠的荧光信号进行评价。排除已接收病毒载体但只显示分析背景信号的老鼠, 因为这可能表明光纤的尖端已经错过了 SCN。在这些初步措施之后, 把老鼠送回自己的笼子3周, 让荧光信号稳定下来。
- 3周后, 用荧光信号监测器将小鼠连接起来。每10分钟测量荧光量为十五年代, 频率为100赫兹。在这些测量过程中, 老鼠可以自由地在笼子里移动, 食物/水可用的广告随意。使用100莱克丝的笼子底部的光强度, 并在光纤尖端的激光功率在 15-20 µW 之间。
- 所有录音完成后, 灌注小鼠与4% 多聚甲醛, 并删除和切片的大脑检查放置的光纤。排除小鼠的分析, 如果光纤尖端没有正确植入的 SCN。
5. 数据分析和介绍
- 测量荧光信号每10分钟为十五年代, 频率为100赫兹, 产生1500个数据点。这1500点的平均值在任何给定的时间点转换为荧光信号。随着时间的推移, 绘制多个平均值会产生一个信号-时间曲线, 它对应于自由移动小鼠的Cry1下的控制光条件下的转录节律。
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Representative Results
图 1A显示了Cry1的荧光记者设计。使用上述方法, 500 rAAV (Cry1) intron336-Venus-NLS-D2 成功地注入成年鼠的 SCN, 并表现出强健的金星表达 (图 1B, 1C)。在12小时/12 小时的光/暗 (LD) 和暗/暗 (DD) 条件下记录的荧光信号 (图 2) 在两种情况下产生了强健的昼夜节律。最后, 将荧光信号记录在长周期和短光照条件下 (图 3)。
图1。荧光报告器的设计及其在 SCN 中的表达
(A) Cry1的荧光记者设计。(B) 显微照片鼠脑显示8天后病毒注射后的表现。(C) 在 (B) 所示的显微照片上以红色包装的区域的放大倍数。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。LD 和 DD 条件下的 SCN体内荧光记录
(A) 在 LD 和 DD 条件下, 在 SCN 的背景荧光显示没有可检测的节律。白色和灰色区域分别表示光和光的周期。(B) P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2 的表达在7天的过程中, 在 12-12 LD 条件和7天的 DD 条件。(C) 分析 LD 情况下的昼夜节律 (24.4 小时);红线表示正弦曲线中的会聚拟合 (匹配的结果显示在左面板中)。(D) 分析 DD 条件下的昼夜节律 (~ 23.25 小时);红线表示正弦曲线中的会聚拟合 (匹配的结果显示在左面板中)。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。在体内荧光记录在20-4 长和4-20 短光周期条件下的 SCN
荧光记录 P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2 表达在7天在 12-12 LD 条件下, 其次是7天在20-4 长光周期条件下, 3 天在 DD 条件下, 3 天在 12-12 LD 情况下, 和然后在4-20 短光周期条件下7天。白色和灰色区域分别表示光照和光的周期。请单击此处查看此图的较大版本.
表1。协议所需的特定试剂(见材料表)
| 底漆名称 | 序列 | ||
| 底漆 F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| 底漆 R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| 底漆 F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| 底漆 R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| 底漆 F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| 底漆 R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| 底漆 F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| 底漆 R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
表2。协议中使用的底漆
表3。在协议中使用的 DNA 序列请单击此处下载此文件.
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Discussion
与前体方法相比, 如切片培养4,5, rt-pcr16,原位杂交17, 这要求动物被杀死,体内记录方法允许研究者们研究活着的动物的昼夜节律基因表达。因此, 这种技术提供了评估不同物理扰动 (如睡眠剥夺、压力、食物摄入等) 对神经昼夜节律的影响的能力。与体内生物发光7、8、10方法相比, 只能在恒定的暗条件下工作, 荧光在体内记录方法可以在光下应用。情况-技术的一个关键的好处作为光信号再夹带 SCN 昼夜节律时钟18。虽然这种方法可以检测到相对恒定、健壮的昼夜节律, 但应该提到, 记者技术并没有提供定量信息, 因此不能用于测量基因转录水平和翻译。
该协议有许多关键步骤。浓缩 rAAV 滴度应高达 2-8x 1012病毒粒子每毫升;较低的病毒滴度会发出暗淡甚至无法察觉的荧光信号。当将鼠标头固定到立体定向装置中时, 确保头骨水平, 以保证病毒注射和光纤植入的准确定位。注射的病毒应该慢慢做 (≤50-1), 以确保病毒仍然在 SCN。陶瓷插针和光纤应牢固固定在颅骨上, 牙科树脂不应与皮肤接触。如果陶瓷插针和光纤没有足够的固定, 它们会逐渐从鼠标头上分离出来。
这种技术可以推广到包括其他基因记者 (例如, Per2, Bmal1, c-fos, Pomc等) 通过改变启动子和相应的内含19。该技术通过反转两个反转液氧序列的 flag-inton336-Venus-NLS-D2 盒, 并将该报告器与一只小鼠线相结合, 可用于记录特定神经元的活动。例如, 将这种方法与 Vip 的小鼠线结合在一起, 可以记录Cry1转录节律在血管活性肠肽表达神经元的 SCN。此方法还可以使用 GCaMP6 作为 ca2 +指示器记录 ca2 +昼夜节律的大脑。
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Disclosures
作者没有披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢张实验室的各位成员提供了激动人心的讨论, 以及站内实验室的成员提供技术援助。这项研究由中国国家自然科学基金、2012CB837700 (E.E.Z. 和霍山) 资助的 31500860 (到霍山) 的973个项目中的 m.o.s. T, 并由北京市政府提供资金支持。E.E.Z. 得到中国 "全球青年专家招募计划" 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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