Summary
Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.
Abstract
Diese Technik verbindet optische Faser vermittelt Fluoreszenz Aufnahmen mit der präzise Lieferung von recombinant Adeno-assoziierten Virus basierte gen Reporter. Dieses neue und einfach zu bedienen in Vivo Fluoreszenz monitoring-System wurde entwickelt, um die transkriptionelle Rhythmus des Gens Uhr Cry1, im suprachiasmatischen Kern (SCN) frei beweglichen Mäuse aufzeichnen. Hierzu wurde ein Cry1 Transkription Fluoreszenz Reporter entworfen und verpackt in Adeno-assoziierten Virus. Gereinigtes, konzentrierter Virus injiziert wurde, in die Maus SCN, gefolgt durch die Einfügung einer Glasfaser, die dann auf die Oberfläche des Gehirns behoben wurde. Die Tiere waren kehrte in ihre Heimat Käfige und erlaubt eine 1 Monat postoperativen Erholungsphase ausreichend Reporter Ausdruck sicherzustellen. Fluoreszenz verzeichnete dann frei beweglichen Mäuse über einen in-Vivo monitoring-System, das in unserer Einrichtung erstellt wurde. Für die in Vivo recording-System wurde 488 nm Laser mit einem Strahlteiler 1 × 4 gekoppelt, die das Licht in vier Erregung Laserleistungen gleicher Leistung unterteilt. Diese Einrichtung konnten wir aus vier Tiere gleichzeitig aufnehmen. Jedes der emittierte Fluoreszenz Signale wurde über einen Photomultiplier Röhre und einer Datenkarte Erwerb gesammelt. Im Gegensatz dazu erlaubt, die früheren Biolumineszenz in Vivo circadianen Uhr Aufnahmetechnik, diese Fluoreszenz in Vivo recording-System die Aufzeichnung der circadianen Uhr gen-Expression in den Licht-Zyklus.
Introduction
Bei Säugetieren regelt der suprachiasmatischen Kern (SCN) den ganzen Körper zirkadianen Rhythmus um eine individuelle Reaktion auf exogene Veränderungen der Umwelt (z.B., Licht, Temperatur, Druck usw.)1zu koordinieren. Uhr Kernkomponenten bestehen aus Per1-3, Cry1-2, Uhrund Bmal1und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der circadianen Uhr jeder Zelle. Jede Zelle in der SCN enthält den transcriptional Aktivator, CLOCK/BMAL1, fungiert als ein Heterodimer induzieren die Expression von v. und Weinen. Das KGV / Schrei-Komplex hemmt dann die Funktion der Uhr/BMAL1, eine Transkription-Übersetzung-Feedback-Schleife zu bilden, das dauert etwa 24 h komplett2,3.
Frühere Studien über die SCN haben vor allem die ex Vivo SCN Stück Kultur Methode4,5,6 eingesetzt und während dieser Ansatz wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt hat, haben seine Grenzen unserer Fähigkeit, gehemmt Daten über den Einfluss der anderen Gehirn-Kerne auf der SCN sowie die Wirkung von exogenen Reize (z.B.Licht) auf Zellen, die ihren Wohnsitz in diesem kritischen Bereich zu erhalten. Im Jahr 2001 erstmals Hitoshi Okamuras Gruppe der Biolumineszenz-System zur in-Vivo Genexpression Monitor circadianen Uhr im SCN in frei beweglichen Mäuse7verwenden. Ken-Ichi Honma Gruppe verbrachte die letzten Jahren Weiterentwicklung der Biolumineszenz in Vivo recording-System in der SCN8,9,10. Zusammen haben diese Studien Forscher mit der Fähigkeit der circadiane Uhr in ständiger Dunkelheit oder nach einem Lichtimpuls zu überwachen zur Verfügung gestellt. Jedoch da Biolumineszenz zu schwach ist für kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus, gepaart mit der Tatsache, dass Licht das vorherrschende Signal für die SCN-vermittelten Entrainment ZIRKADIANE Uhren11erforderlich ist es gibt steigende Nachfrage für die Entwicklung von experimentellen Methoden, die Überwindung der Grenzen Biolumineszenz Aufnahme zugeordnet. Der vorliegende Bericht beschreibt ein Fluoreszenz-basiertes System, das errichtet wurde, um die innere Uhr des SCN in Vivo in Mäusen frei beweglich zu überwachen. Diese einfach zu bedienende Methode ermöglicht kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus und ermöglicht die langfristige Beobachtung der Transkription von Genen der circadianen Uhr im SCN in Echtzeit und in hoher zeitlicher Auflösung.
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Protocol
Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des National Institute of Biological Sciences, Peking, im Einklang mit der staatlichen Regelungen des China durchgeführt.
1. Bau der Cry1 -Fluoreszenz-Reporter
Hinweis: Frühere circadiane Studien mit Biolumineszenz System2,12,13 Sicherung circadiane Förderer mit einer destabilisierten Luciferase (dLuc), rhythmische dLuc Ausdruck zu induzieren. Um ein Fluoreszenz-Reporter zu entwickeln, wurde destabilisiert Luciferase mit destabilisiert Fluoreszenz Protein (dVenus) induzieren rhythmische dVenus Ausdruck ersetzt. Die Generation der P (Cry1)-dVenus Reporter ist weiter unten beschrieben, das Konstrukt ist derzeit Addgene übermittelt und werden bald für den akademischen Gebrauch zur Verfügung stehen.
- Den funktionale Maus Cry1 Projektträger (+328-1208 bp Region des Gens Cry1 , Transkription Startsite als '' -1 '' bezeichnet) zu verstärken. Verwenden Sie die PCR-Enzym (KOD Plus Neo), Primer F1 und R1 (siehe Tabelle 2), Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, um das Cry1 Förderer DNA-Fragment zu verstärken.
- Intron 336 des Cry1 -Gens, die wichtig für die Funktion der circadianen Uhr Cry114zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F2 und R2, Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, das Intron 336 DNA-Fragment zu verstärken.
- Venuszu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F3 und R3, pVENUS-N1 Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die Venus DNA-Fragment zu verstärken.
- Das NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F4 und R4, pcDNA3.3-d2eGFP-Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken.
- Synthetisieren Sie DNA-Fragment 1 als Exon 1.
- DNA-Fragment 2 als Linker zwischen Intron 336 und die Venus -DNA-Fragment zu synthetisieren.
- Schneiden Sie die pAAV-EF1a-Doppel-Floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA-Vektor-Plasmid mit den Enzymen, MluI und EcoRI. Verwenden Sie das Gel Extraction Kit, um das größere DNA-Fragment zu reinigen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.
- Mit einem Gibson-Montage-Mix und seine standard-Protokoll, montieren Sie alle DNA-Fragmente zusammen, um die pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA Reporter zu produzieren. Protokoll des Herstellers zu verwenden.
2. Herstellung von Adeno-assoziierten Virus15
- Vorbereitung der folgenden Plasmid DNA-Aktien: 31,25 µg von pRV1, 31,25 µg pH21 und 125 µg pFdelta6 62,5 µg pAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
- Bereiten Sie fünf 15 cm Gerichte der 293T Zellen und warten Sie, bis die Zellen 90 % Zusammenfluss werden.
- Transfizieren Sie Plasmide in den 297T Zellen nach der Transfektion Reagenz-Protokolls. Für jedes Gericht verwenden, 6,25 µg von pRV1, 6,25 µg pH21, 25 µg pFdelta6, 12,5 µg pAAV-p (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA und 120 µL Transfection Reagens.
- 72 h nach Transfektion, lösen die Zellen von jeder Platte mit einer Pipette Waffe; Ernten Sie die Zellen in zwei 50 mL Röhrchen.
- Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min und den überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen, indem man 20 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jedes Rohr; Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min, und den überstand verwerfen.
- Aufschwemmen Sie Pellets in 150 mM NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0; Verwenden Sie 25 mL der Lösung/Schlauch. Jedes Rohr 1,25 mL frisch zubereitete 10 % Natrium-Deoxycholate (in dH2O) hinzufügen. Eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro mL Benzonase Nuklease hinzufügen und gut durchmischen. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
- Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 3000 X g für 15 min entfernt. Weiter zu gewährleisten, dass alle Verschmutzungen entfernt worden ist, indem man die Mischung durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter; Dieser Schritt hilft Heparin Spalten verhindert.
- Einrichten von Heparin Spalten mithilfe einer peristaltischen Pumpe; Einstellen der Durchflussmenge bis 1 mL/min, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spalten eingeführt werden.
- Equilibrate der Spalten mit 10 mL eines 150 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Fügen Sie die Lösung mit dem Virus zu jeder Spalte hinzu. Waschen Sie die Spalten mit 20 mL einer 100 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Dann, mit einer 5 mL Spritze, die Spalten mit 1 mL einer 200 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung pH 8.0, gefolgt von 1 mL einer 300 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0 waschen.
- Eine 5 mL Spritze um das Virus mit 3 mL eines 400 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, gefolgt von 4 mL 450 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, eluieren verwenden und schließlich durch eine 3 mL eines 500 mm NaCl , 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Die extrahierten Materialien zu sammeln.
- Laden Sie für rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Konzentration des geförderten Materials, 4 mL in einer Zeit, in zentrifugale Filtereinheiten mit einem 100.000 Molekulargewicht cutoff. Zentrifugieren Sie jede 4-mL-Probe bei 2000 X g für 5 min bei Raumtemperatur, verwerfen die Durchströmung.
- Wenn alle geförderten Materials durch die zentrifugale Filtereinheiten ausgeführt wurden, fügen Sie 4 mL PBS und Zentrifugieren Sie die Mischung in rund 250 μL. RAAVs zu entfernen (virale Titer sollte über 2-8 x 1012 Viruspartikel pro mL) im zentrifugalen Filtereinheiten, aliquoten und Store bei-80 ° C bis zur Verwendung. In diesem Stadium kann das Virus für mehrere Monate gespeichert werden.
(3) rAAV Injektion und optische Faser Einlegen in der Erwachsenen Maus SCN
- Injektion von zirkadianen Fluoreszenz Reporter-tragenden rAAVs in der SCN
- 5 µL rAAV zu laden (der Virustiter geht es um 2 bis 8 x 1012 Viruspartikel pro mL) in eine Mikro-Spritze.
- Betäuben Sie Erwachsenen Mäuse (2, 5-Monate alten, C57BL/6 Hintergrund) mit Nembutal (80 mg/kg), über intraperitoneale Injektion. Suchen Sie nach ausreichender Tiefe der Narkose durch das Fehlen einer Zehe-Prise Antwort.
- Mit einer Schere den Kopf der Maus Fell entfernen und montieren Sie dann die Maus in einer stereotaktischen Apparat. Bieten Sie eine Wärmequelle zu betäubten Tiere über einer zirkulierenden Warmwasser Decke oder ein anderes Heizgerät.
Hinweis: Verwenden Sie alternativ enthaarende Creme oder elektrischen Haarschneidemaschinen, um das Fell zu entfernen. - Reinigen Sie der Operationsstelle mit geeigneten Desinfektionsmitteln. Beispielsweise könnte dies gehören sterilem Wasser oder Alkohol und Jod, Betadine oder Chlorhexidin in wechselnden Peelings zu verdünnen. Wiederholen Sie mindestens 3 Mal. Drapieren Sie der Operationsstelle.
- Verwenden Sie die Schere, machen einen Schnitt in der Kopfhaut und setzen den Schädel.
- Einstellen Sie das stereotaktischen Gerät so, dass Bregma und Lambda in der gleichen horizontalen Ebene sind; machen Sie zwei symmetrische Punkte von Bregma, in der gleichen horizontalen Ebene.
- Verwendung eines sterilen Wattetupfer getränkt in 4 % H2O2/h2O, um das Gehirn Periost korrodieren. Dann verwenden Sie ein sauberes, steriles Wattestäbchen und trocknen Sie die Oberfläche des Schädels.
- Mit einem Mikro Bohrer, machen Sie ein Loch von ca. 1 mm im Durchmesser posterior 0,46 mm und 0,25 mm seitliche, Bregma.
- fi Verwenden Sie einen sauberen sterilen Wattestäbchen mit physiologischer Kochsalzlösung, um Knochenfragmente von der sichtbaren Oberfläche des Gehirns zu löschen.
- Legen Sie eine Mikro-Spritze in das Gehirn, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikro-Spritze 0,46 mm posterior ist und 0,25 mm seitliche Bregma und 5,7 mm tief von der Oberfläche des Schädels.
- Injizieren 500 nL rAAV (50 nL min-1) in der SCN, verlassen die Mikro-Spritze in Ort für 10 min nach der Injektion um komplette Diffusion von rAAV sicherzustellen.
- Ziehen Sie langsam die Mikro-Spritze.
- Legen Sie die optische Faser in den SCN-Bereich.
- Schneiden Sie mit einem Glasfaser-Messer eine Faser 17-mm in der Länge, um sicherzustellen, dass jede Seite der optischen Faser glatt ist.
- Die Glasfaser in die Keramik Ferrule und befestigen Sie der Glasfaser, Keramik Ferrule mit Methyl-Ethyl-Keton-Peroxid (AB Kleber), um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Glasfaser und Keramik Ferrule bündig sind.
- Reinigen Sie die Faser mit einer kalten sterilisiermittel Lösung oder Ethylen oxid.
- Nach rAAV Injektion (Schritt 3.1.11) einfügen der Keramik Ferrule-haltigen Glasfaser in der SCN.
- Befestigen Sie den Keramik-Ferrule und optische Faser auf den Schädel mit dental Harz und trocknen lassen.
- Schmieren Sie die Oberfläche des zahnärztlichen Harzes mit hinteren Nagellack. Wiederholen Sie die Schritte in 3.1.2, 3.2.5, weglassen der eigentlichen Injektion von rAAV zur Steuerung beschrieben.
- Postoperative Pflege
- Subkutan, postoperative Schmerzmittel wie Buprenorphin 2 mg/kg Körpergewicht, Mäuse bieten zweimal am Tag.
- Platzieren Sie Mäuse in einem Recovery-Käfig, während sie aus der Narkose kommen.
- Hausmäuse individuell unter einer 12 h hell/dunkel-Bedingung (Lichtintensität ~ 100 Lux an der Unterseite des Käfigs) mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Acht Tage sollen vor weiter experimentieren, um genügend Erholungszeit zu ermöglichen und um optimale Fluoreszenz Reporter Ausdruck entfallen.
4. in Vivo Fluoreszenz Signalüberwachung und Datenerhebung
- Acht Tage nach der Operation, die Faser auf den Maus-Kopf mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor verbinden (zB., Gene Observer). Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal im SCN der Kontroll-Mäusen, das Hintergrundsignal zu etablieren. Führen Sie die Beobachtung und Messung dieses Signals mit Fluoreszenz-Signal-Monitor.
- Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal experimentelle Maus mit dem gleichen Betrieb der Maus Steuerung. Schließen Sie Mäuse die viralen Vektoren erhalten haben, aber die Anzeige nur das Hintergrundsignal aus Analyse, aus, da dies bedeutet wahrscheinlich, dass die Spitze der optischen Faser die SCN verpasst hat. Nach diesen ersten Maßnahmen zurück Mäuse in ihrer Heimat Käfige für weitere 3 Wochen erlauben das Fluoreszenzsignal zu stabilisieren.
- Verbinden Sie nach 3 Wochen die Mäuse mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor. Messung die Fluoreszenz für 15 s alle 10 Minuten, bei einer Frequenz von 100 Hz. Während diese Messungen sind die Mäuse frei beweglichen in ihren Käfigen mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Verwenden Sie eine Lichtintensität auf dem Boden des Käfigs von ~ 100 Lux, und eine Leistung des Lasers an der Spitze der Glasfaser zwischen 15-20 µW.
- Perfundieren Sie nach der Fertigstellung aller Aufnahmen Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd und entfernen Sie und in Scheiben schneiden Sie die Gehirne um Platzierung der optischen Faser zu überprüfen. Schließen Sie Mäuse aus Analyse, wenn die Glasfaser-Tipp nicht richtig im SCN implantiert wird.
(5) Datenanalyse und Präsentation
- Maßnahme-Fluoreszenz-signal alle 10 min für 15 s, bei einer Frequenz von 100 Hz bis 1500 Datenpunkte ergeben. Der Durchschnitt dieser 1500 Punkte entspricht das Fluoreszenzsignal zu jedem gegebenen Zeitpunkt. Plotten mehrere Durchschnitte im Laufe der Zeit produziert eine Signal-Zeit-Kurve entspricht die transkriptionelle Rhythmus der Cry1 unter einer leichten Kontrollbedingung im SCN Mäusen frei zu bewegen.
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Representative Results
Fluoreszenz-Reporter-Design der Cry1 war Show in Figur 1A. Mit dem Ansatz über 500 detaillierte nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 wurde erfolgreich in der SCN Erwachsener Mäuse injiziert und robuste Venus Ausdruck (Abbildung 1 b, 1 C) ausgestellt. Fluoreszenz-Signale aufgezeichnet unter 12h / 12h hell/dunkel (LD) und dunkel/dunkel (DD) Bedingungen (Abbildung 2) ergab robust circadianen Rhythmus unter beiden Bedingungen. Zu guter Letzt verzeichnete Fluoreszenzsignal lange und kurze Photoperiode Bedingungen (Abbildung 3).
Abbildung 1. Fluoreszenz-Reporter-Design und es Ausdruck im SCN
(A) die Fluoreszenz-Reporter-Gestaltung der Cry1. (B) Mikrophotographie des Mäusegehirns zeigt Reporter Ausdruck 8 Tage nach der Injektion des Virus. (C) Vergrößerung des Bereichs boxed in rot auf der Mikrophotographie in (B) gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Fluoreszenz in Vivo Aufnahme im SCN LD und DD Bedingungen
(A) Hintergrund Fluoreszenz im SCN zeigen keine nachweisbaren Rhythmus LD und DD Bedingungen. Die weiße und graue Bereiche zeigen bzw. Licht- und Licht-off Zeiten. (B) P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 Ausdruck im Laufe von 7 Tagen in einem 12 / 12/LD Zustand und 7 Tage in einem DD-Zustand. (C) Analyse der zirkadianen Rhythmus in der LD-Zustand (~24.4 h); die rote Linie zeigt die konvergente in die Sinus-Kurve passen (das Ergebnis der Fit ist in der linken Leiste angezeigt). (D) Analyse der zirkadianen Rhythmus in der DD-Zustand (~23.25 h); die rote Linie zeigt die konvergente in die Sinus-Kurve passen (das Ergebnis der Fit ist in der linken Leiste angezeigt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. In Vivo Fluoreszenz Aufnahmen im SCN unter 20-4 langen und 4-20 kurze Photoperiode Bedingungen
Beispiel für eine Fluoreszenz-Aufzeichnung von P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 Ausdruck im SCN für 7 Tage unter einem 12 / 12/LD Zustand, gefolgt von 7 Tagen unter einer 20-4 lange Photoperiode Bedingung, 3 Tage unter einer Bedingung DD, 3 Tage unter einem 12 / 12/LD Zustand, und dann 7 Tage unter einer 4-20 kurze Photoperiode Bedingung. Weiße und graue Bereiche angeben bzw. die Licht- und Licht-off Zeiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1. Spezielle Reagenzien erforderlich für Protokoll (siehe Tabelle der Materialien)
| Primer-name | Sequenz | ||
| Grundierung F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| Grundierung R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| Grundierung F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| Grundierung R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| Grundierung F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| Grundierung R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| Grundierung F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| Grundierung R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
Tabelle 2. Einführung in das Protokoll verwendet
Tabelle 3. DNA-Sequenz in das Protokoll verwendet Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Im Gegensatz zu ex-Vivo -Methoden, z. B. Slice Kultur4,5, RT-PCR16und in Situ Hybridisierung17, die erfordern, dass Tiere getötet werden, kann das in Vivo Aufnahme Methode Ermittler, circadiane Genexpression in ein lebendes Tier zu studieren. Als solche bietet diese Technologie die Möglichkeit, die Wirkung der verschiedenen körperlichen Störungen (z.B., Schlafentzug, Stress, Ernährung, etc.) auf die neuronale circadianen Uhr bewerten. Im Gegensatz zu der in Vivo Biolumineszenz7,8,10 -Methode, die nur, in der ständigen Dunkelheit funktionieren kann, die Fluoreszenz in Vivo Aufnahme Methode unter Licht einsetzbar Bedingungen-ein entscheidender Vorteil der Technologie als Licht signalisiert Re Mitnahme des SCN circadianen Uhr18. Obwohl relativ konstant, robust circadianen Rhythmen mit dieser Methode erkannt werden können, es sollte erwähnt werden, dass die Reporter-Technologie keine quantitativen Informationen liefert und kann daher nicht zur Gentranskription Messen und Übersetzung.
Es gibt viele wichtige Schritte dieses Protokolls. Die konzentrierte rAAV-Titer sollte so hoch wie 2-8 x 1012 Viruspartikel pro mL sein; niedrigeren viralen Titer würde schwach oder gar nicht nachweisbar Fluoreszenz Signale abgeben. Bei den Kopf der Maus in den stereotaxischen Apparat, sicherzustellen Sie, dass der Schädel horizontal zum sicheren genaue Positionierung für Virus Injektion und LWL-Implantation ist. Injektion des Virus sollte langsam erfolgen (≤50 nL min-1) um sicherzustellen, dass das Virus im SCN bleibt. Keramik Ferrule und optische Faser sollte befestigt auf dem Schädel und dental Harz sollte nicht mit der Haut in Berührung. Wenn die Keramik Ferrule und Glasfaser nicht ausreichend fest sind, löst sie allmählich von der Maus-Kopf.
Diese Technik kann ausgeweitet werden andere gen-Reporter (z.B. Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, etc.) durch eine Änderung der Projektträger und der entsprechenden Intron-19. Umkehrung der Flagge-inton336-Venus-NLS-D2-Kassette mit zwei umgekehrte Lox-Sequenzen und die Reporter mit einem Cre mauslinie kombinieren, kann diese Technologie eingesetzt werden, Aufzeichnen der Aktivität in bestimmten Nervenzellen. Beispielsweise würde die Kombination dieser Ansatz mit einer Vip-Cre-Maus-Linie für die Aufzeichnung von Cry1 transkriptionelle Rhythmen in vasoaktive intestinale Polypeptid exprimierenden Neurone im SCN ermöglichen. Diese Methode kann auch GCaMP6 als Ca2 + Indikator aufzunehmen Ca2 + zirkadianen Rhythmus im Gehirn beschäftigen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir danken Mitglieder im Zhang Labor für anregende Diskussionen und Mitglieder im Zhan Labor für technische Hilfestellung bietet. Diese Forschung wurde durch 31500860 (zu C.Z) Zuschüsse der NSFC, 2012CB837700 (zu E.E.Z. und C.Z) des Programms 973 aus der M.O.S.T. von China, und durch die Finanzierung von kommunalen Regierung in Peking unterstützt. E.E.Z. wurde von den Chinesen "Recruitment Programm von Global Youth Experts" unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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