In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence
Summary
Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.
Abstract
Cette technique combine fibre optique médiée par fluorescence enregistrements avec la livraison précise de reporters de gène recombinant virus adeno-associé basé. Cet nouvelle et facile à utiliser en vivo fluorescence surveillance système a été développé pour enregistrer le rythme transcriptionnel du gène de l’horloge, Cry1, dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de déplacer librement les souris. Pour ce faire, un journaliste de fluorescence de transcription Cry1 a été conçu et emballé en virus Adeno-associé. Purifié, concentré de virus a été injecté dans la SCN, suivie de l’introduction d’une fibre optique, qui a été ensuite fixée sur la surface du cerveau de la souris. Les animaux ont été retournés à leurs cages maison et jouir d’un délai de 1 mois de convalescence postopératoire assurer suffisamment expression du Rapporteur. Fluorescence a été enregistré puis en se déplaçant librement souris via un en vivo surveillance système qui a été construit dans notre établissement. Pour l’ en vivo système d’enregistrement, un laser à 488 nm a été couplé avec un 1 × 4-séparateur de faisceau qui divise la lumière en quatre sorties d’excitation de laser de puissance égale. Cette configuration a permis d’enregistrer simultanément des quatre animaux. Chacun des signaux émis par fluorescence ont été recueillie via un tube photomultiplicateur et une carte d’acquisition de données. En revanche à la précédente bioluminescence in vivo horloge circadienne technique d’enregistrement, cette fluorescence in vivo système d’enregistrement permet l’enregistrement de l’expression génique horloge circadienne pendant le cycle de lumière.
Introduction
Chez les mammifères, le noyau suprachiasmatique (SCN) régit les rythme circadien de l’organisme entier pour coordonner la réponse de l’individu à exogène de changements environnementaux (p. ex., lumière, température, stress, etc.)1. Composants d’horloge de base se composent de PAR1-3, 2-Cry1, horlogeet Bmal1et jouent un rôle central dans la régulation de l’horloge circadienne de chaque cellule. Chaque cellule dans le SCN contient l’activateur de la transcription, horloge/BMAL1, qui agit comme un hétérodimère pour induire l’expression de PER et CRY. Le PER / CRY complexe inhibe alors la fonction d’horloge/BMAL1 pour former une boucle de rétroaction de transcription-traduction qui prend environ 24h au complet2,3.
Des études antérieures sur le RCS ont principalement employé l’ex vivo SCN tranche culture méthode4,5,6 et, bien que cette approche a fourni des renseignements précieux, ses limites ont entravé notre capacité à obtenir des données concernant l’influence des autres noyaux du cerveau sur le RCS, ainsi que l’effet de stimuli exogènes (par exemple, lumière) sur cellules résidant dans cette région critique. En 2001, groupe de Hitoshi Okamura fut le premier à utiliser le système de bioluminescence de l’expression génique in vivo moniteur horloge circadienne dans le SCN en se déplaçant librement souris7. Groupe de Ken-ichi Honma a passé les dernières années développer davantage la bioluminescence in vivo système d’enregistrement dans le SCN8,9,10. Ensemble, ces études ont fourni des chercheurs avec la possibilité de surveiller l’horloge circadienne dans l’obscurité totale ou après une impulsion de lumière. Cependant, parce que la bioluminescence est trop faible pour permettre une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité, associée au fait que la lumière est le signal prédominant requis pour l’entraînement de SCN-mediated des horloges circadiennes11, il est demande croissante pour le développement de méthodes expérimentales qui surmonter les limitations associées à enregistrement de bioluminescence. Le présent rapport décrit un système basés sur la fluorescence qui a été construit pour surveiller l’horloge circadienne du SCN en vivo en se déplaçant librement des souris. Cette méthode facile à utiliser permet une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité et permet l’observation à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le SCN en temps réel et à haute résolution temporelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrairement à l’ex vivo des méthodes, telles que la tranche culture4,5, RT-PCR16et in situ hybridation17, qui exigent que les animaux soient tuées, l’ in vivo enregistrement méthode permet chercheurs pour étudier l’expression des gènes circadiens chez un animal vivant. Ainsi, cette technologie offre la possibilité d’évaluer l’effet des différentes perturbations physiques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire de Zhang pour prévoyant la fourniture d’assistance technique de stimuler les discussions et les membres du laboratoire de Zhan. Cette recherche a été financée par des subventions 31500860 (de C.Z.) de la FNSC, 2012CB837700 (de C.E.A et C.Z.) du programme 973 de le M.O.S.T. de Chine et par le financement de l’administration municipale de Pékin. C.E.A a été appuyée par les chinois « Programme de recrutement d’Experts de jeunesse Global ».
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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